Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞表達(dá)成骨基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大面積骨缺損一直是創(chuàng)傷骨科的治療難題。目前，傳統(tǒng)的自體骨、異體骨以及人工 骨材料的填充都難以有效治療大面積的骨缺損。而骨組織工程通過整合支架材料、種子細(xì) 胞、活性因子等提高人工骨材料的成骨活性，對(duì)促進(jìn)骨愈合有重要作用。
[0003] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的一類具備多方向分化潛能的非造血干細(xì)胞， 在一定的誘導(dǎo)條件下能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向分化，促進(jìn)骨愈 合。而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床上已被應(yīng)用于治療移植物抗宿主病和同種異體造血干細(xì) 胞移植，其生物安全性已得到證實(shí)。然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不易于外源基因?qū)?，因此選擇 合適的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)至關(guān)重要。
[0004] Runx2在成骨分化的信號(hào)途徑中起核心作用，能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì) 胞定向分化并成熟，從而促進(jìn)骨愈合。
[0005] 把目的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的方法有很多，目前應(yīng)用的基因載體分為兩大類：非 病毒載體和病毒載體。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、聚合物等，這類載體的優(yōu)點(diǎn)是可以大量 生產(chǎn)，毒性反應(yīng)及免疫抑制方面也相對(duì)較安全，但其轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)量低、體內(nèi)應(yīng)用較困 難。病毒載體主要有3種：反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒。目前，還沒有使用Runx2重組慢 病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨基因的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨 基因的方法，旨在提供一種利用攜帶Runx2基因的慢病毒感染骨髓充質(zhì)干細(xì)胞、構(gòu)建感染 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞珠、表達(dá)成骨基因的問題。
[0007] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨基 因的方法，包括下述步驟：
[0008] Runx2基因提取及質(zhì)粒構(gòu)建：從骨肉瘤細(xì)胞系中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成CDNA，分別 設(shè)計(jì)Runx2基因的下游引物和下游引物，利用上述引物通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增Runx2基因；將 慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒與所述擴(kuò)增Runx2基因使用PspXI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理，將酶 切處理產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化處理，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物質(zhì)粒抽提，得到Runx2重組慢病毒載體質(zhì)粒；
[0009] Runx2重組慢病毒的包裝：將所述Runx2重組慢病毒載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 至293Ta細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝，獲得Runx2重組慢病毒，并對(duì)病毒滴度進(jìn)行監(jiān)控；
[0010] Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，加入Runx2重 組慢病毒進(jìn)行慢病毒感染，獲得能夠表達(dá)成骨基因的感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明提供的Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨基因的方法，操 作簡(jiǎn)單，從骨肉瘤細(xì)胞獲取Runx2基因片段，然后利用慢病毒載體將Runx2導(dǎo)入至骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞基因組DNA中，無明顯的毒性反應(yīng)，細(xì)胞生長良好。獲得的感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 能夠很好地表達(dá)Runx2基因-Runx2基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)水平增高，同時(shí)可提高 成骨因子的表達(dá)水平。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨基 因的方法流程示意圖；
[0013] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；
[0014] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的Runx2重組慢病毒載體質(zhì)粒酶切鑒定電泳結(jié)果圖；
[0015] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的Runx2重組慢病毒的包裝步驟中，不同慢病毒液體積 感染H1299細(xì)胞的綠色熒光圖；
[0016] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果圖；
[0017] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果圖；
[0018] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定結(jié)果圖；
[0019] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的Runx2重組慢病毒感染細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué) 觀察結(jié)果圖；
[0020] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的RT-qPCR分析目的基因感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后在1， 4, 7,14d成骨相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用 以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0022] 慢病毒載體是由人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus，HIV)改造獲 得的，慢病毒載體系統(tǒng)包括表達(dá)載體及包裝質(zhì)粒，慢病毒表達(dá)載體即通常所說的穿梭載體， 包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒載體優(yōu)勢(shì)明顯： 慢病毒可感染處于非分裂期細(xì)胞，使得細(xì)胞保持其特性；慢病毒不會(huì)引起靶細(xì)胞基因表達(dá) 的改變，使得其避免發(fā)生繼發(fā)性癌癥。而與腺病毒載體相比，慢病毒載體為反轉(zhuǎn)錄病毒，將 目標(biāo)基因整合到細(xì)胞基因中，能夠穩(wěn)定表達(dá)；其次，慢病毒免疫源性低，不引起宿主細(xì)胞的 免疫反應(yīng)；此外，慢病毒具有超過IOkb的空間可以搭載外源基因。本發(fā)明實(shí)施例選用慢病 毒系統(tǒng)完成對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的感染、使其表達(dá)成骨基因。
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨基 因的方法，包括下述步驟，如附圖1所示：
[0024] SOL Runx2基因提取及質(zhì)粒構(gòu)建：從骨肉瘤細(xì)胞系中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA， 分別設(shè)計(jì)Runx2基因的下游引物和下游引物，利用上述引物通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增Runx2基 因；將慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒與所述擴(kuò)增Runx2基因使用PspXI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理， 將酶切處理產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化處理，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物質(zhì)粒抽提，得到Runx2重組慢病毒載體質(zhì)粒；
[0025] S02. Runx2重組慢病毒的包裝：將所述Runx2重組慢病毒載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共 轉(zhuǎn)染至293Ta細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝，獲得Runx2重組慢病毒，并對(duì)病毒滴度進(jìn)行監(jiān)控；
[0026] S03.Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，加入 Runx2重組慢病毒進(jìn)行慢病毒感染，獲得能夠表達(dá)成骨基因的感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0027] 本發(fā)明實(shí)施例上述步驟SOl中，從骨肉瘤細(xì)胞系（MG-63)中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。查詢GENBANK得到Runx2全序列基因，約1500bp，利用Primer Premier 6.0軟件，設(shè) 計(jì)Runx2全基因序列引物。具體的，所述上游引物序列為：5' -actagatgctttattggatccggt accatggcatcaaacagcctcttcag-3' ；所述下游引物序列為：5' -agctgggttgcggccgcactcgagc taatatggtcgccaaacagattcat_3,〇
[0028] 利用上述引物通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增Runx2基因，為了驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得的 基因片段的準(zhǔn)確性，本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選對(duì)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，具體操作可為：將 反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，與基因庫提供Runx2全基因序列進(jìn)行比較。 本發(fā)明實(shí)施例反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到約1500bp長的條帶，與基因庫 提供Runx2全基因序列大小相符合，能成功獲得Runx2基因，如附圖2所示，其中條帶1為 Marker 6000,條帶 2 為 PCR 產(chǎn)物。
[0029] 在所述Runx2基因提取及質(zhì)粒構(gòu)建的步驟中，將慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒與所述擴(kuò)增 Runx2基因使用PspXI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理后，將酶切處理產(chǎn)物通過in-fusion反 應(yīng)，連接Runx2基因和慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒。
[0030] 進(jìn)一步的，為了驗(yàn)證Runx2重組慢病毒載體質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，可對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶 切鑒定，具體操作為：對(duì)抽提質(zhì)粒分別用DrdI內(nèi)切酶和StuI內(nèi)切酶酶切，分別對(duì)未被酶切 的重組質(zhì)粒、DrdI內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒及StuI內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果可見附圖 3所示，其中，條帶1為Marker 15000;條帶1為Marker 6000;條帶2為未被酶切的質(zhì)粒，呈 單一亮帶；條帶3為被DrdI內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒，則呈兩條亮帶，大小分別為5552/4565bp ; 條帶4為被StuI酶切的質(zhì)粒，呈條兩亮帶，大小分別為8364/1753bp。由此可見，成功構(gòu)建 了 Runx2重組慢病毒載體質(zhì)粒。更進(jìn)一步地，可將質(zhì)粒酶切片段進(jìn)行測(cè)序鑒定。
[0031] 上述步驟S02中，在所述Runx2重組慢病毒的包裝步驟中，采用熒光法對(duì)所述 Runx2重組慢病毒的病毒滴度進(jìn)行監(jiān)控，具體方法為：將所述Runx2重組慢病毒感染H1299 細(xì)胞，