假病毒包裝系統(tǒng)及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及假病毒包裝載體及包裝系統(tǒng)， 其用于制備假病毒的用途，以及假病毒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 假病毒（pseudovirus)是病毒衣殼蛋白或者包膜蛋白包裹攜帶有報告基因的異 源核酸形成的類似于真病毒的具有感染性的病毒顆粒，由于被包裹的核酸不具有復(fù)制形成 病毒的全部核酸序列的能力，所以假病毒只有一輪的感染力，操作比較安全。
[0003] 假病毒主要通過多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T或293FT細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)自行復(fù)制、表達(dá)組 裝形成，通過收集培養(yǎng)基上清或者裂解細(xì)胞等方法獲得。
[0004] 假病毒具備和真病毒一樣的感染性，進(jìn)入細(xì)胞的過程和真病毒一樣，但其進(jìn)入細(xì) 胞后不具有復(fù)制產(chǎn)生病毒的能力，因而沒有危害，可以更安全地用于中和抗體和抗病毒藥 物檢測。
[0005] 對傳染性強、致病性強的病毒，如SARS-CoV，Ebola病毒，狂犬病毒，H7N9等的研宄 具有極大的危險性，而且數(shù)量有限，而假病毒安全性好，并可以通過轉(zhuǎn)染技術(shù)大量制備，為 這些危險性高的病毒研宄提供了方便。
[0006] 假病毒體系有多種，主要包括以慢病毒載體構(gòu)建的假病毒，以病毒蛋白自組裝形 成的假病毒，以及以病毒基因改造、插入報告基因所形成的假病毒。慢病毒載體是以HIV-1 為基礎(chǔ)發(fā)展起來的，包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，可提供所有轉(zhuǎn)錄并包 裝RNA到重組假病毒所需要的全部輔助蛋白，利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 在細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，包裝好的病毒顆粒分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。
[0007] 假病毒體系的特點是克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，使檢測技術(shù)更安全、簡便、快速、高 通量，而且使一些本身很難培養(yǎng)的病毒也能采用培養(yǎng)的方法進(jìn)行檢測。
[0008] 美國國立衛(wèi)生研宄院（NIH)提供了兩個HIV-1為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，分別是不攜帶Flue 基因的pSG3.Aenv和攜帶Flue基因的NL4-3.Flue.R-.E-。種輝輝、聶建輝等利用pSG3. Aenv建立了HIV假病毒檢測中和抗體的方法，另外國內(nèi)外很多研宄人員利用NL4-3.Flue. R-.E-構(gòu)建了許多假病毒，例如SARS-CoV，Ebola病毒，狂犬病毒，流感病毒等。由于pSG3. Aenv不含報告基因，因此只能用于感染表達(dá)熒光素酶的TZM-bl等細(xì)胞，限制了假病毒的 感染細(xì)胞范圍；而NL4-3.Flue.R-.E-可以表達(dá)熒光素酶，從而提供檢測的信號，但是該質(zhì) 粒用到的啟動子為HIV長末端重復(fù)序列（LTR)，表達(dá)效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種能夠高效表達(dá)熒光素酶的假病毒包裝載體及包裝系統(tǒng)，具體包 括以下幾個方面。
[0010] 本發(fā)明第一方面涉及一種假病毒包裝載體，其是在載體PSG3.Aenv中可操作地 連接有熒光素酶基因和調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。
[0011] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其是在載體PSG3.Aenv中nef基因的上游可操作地 連接有熒光素酶基因和調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其是在載體pSG3. Aenv第11946位至14103之間可 操作地連接有熒光素酶基因和調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。
[0013] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，其是在載體pSG3. Aenv第13967處可操作地連 接有熒光素酶基因和調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。
[0014] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的熒光素酶選自螢火蟲熒光素酶、海腎熒 光素酶。
[0015] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述螢火蟲熒光素酶基因的序列如SEQIDN0: 3所示。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的啟動子為CMV啟動子，優(yōu)選地，所述CMV 啟動子的序列如SEQIDN0:18所示。
[0017] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述熒光素酶基因和調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動子 的序列如SEQIDN0 :6所示。
[0018] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述假病毒包裝載體具有如SEQIDN0:7所示 的序列。
[0019] 本發(fā)明另一方面涉及一種假病毒包裝系統(tǒng)，其包含本發(fā)明第一方面任一項的假病 毒包裝載體和至少一種真核表達(dá)載體。
[0020] 在本發(fā)明的實施方案中其中所述本發(fā)明第一方面任一項的假病毒包裝載體作為 假病毒包裝的骨架載體，所述真核表達(dá)載體作為假病毒包裝的外源基因表達(dá)載體。
[0021] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的真核表達(dá)載體是將載體PCDNA3. 1(+)中 CMV啟動子至17啟動子的序列替換為CAG啟動子、LTR啟動子或包含有人巨細(xì)胞病毒主要 艮P亥1J早期蛋白基因（Humancytomegalovirusmajorimmediate-earlyproteingene)增 強子/啟動子、人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因外顯子1和人巨細(xì)胞病毒主要即刻早 期蛋白基因內(nèi)含子1的序列。
[0022] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述pcDNA3. 1 (+)中CMV啟動子至17啟動子的序列 為第229-896位的序列。
[0023] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述CAG啟動子的序列如SEQIDN0:10所示。
[0024] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述LTR啟動子的序列如SEQID N0:13所示。
[0025] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的包含有人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白 基因（Humancytomegalovirusmajorimmediate-earlyproteingene)增強子 / 啟動子、 人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因外顯子1和人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因內(nèi) 含子1的序列如SEQIDN0:16所示。
[0026] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述真核表達(dá)載體具有如SEQID N0:17所示的序 列。
[0027] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的真核表達(dá)載體含有外源基因，優(yōu)選地，所 述外源基因為病毒的膜蛋白基因。
[0028] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述病毒為有包膜病毒，優(yōu)選地，所述有包膜病毒包 括DNA病毒、RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如選自冠狀病毒（例如SARS-CoV)，皰瘆病毒，痘病 毒，嗜肝病毒（如丙肝病毒），絲狀病毒（如Ebola病毒），彈狀病毒（例如狂犬病毒），流感 病毒，副粘病毒（如麻瘆病毒、呼吸道合胞病毒），黃病毒（例如登革病毒），囊膜病毒，布尼 亞病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒。
[0029] 本發(fā)明還涉及一種真核表達(dá)載體，其是將載體pcDNA3. 1(+)中CMV啟動子至17啟 動子的序列替換為CAG啟動子、LTR啟動子或包含有人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因 (Humancytomegalovirusmajorimmediate-earlyproteingene)增強子 / 啟動子、人巨 細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因外顯子1和人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因內(nèi)含子1 的序列。
[0030] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述PCDNA3. 1 (+)中CMV啟動子至17啟動子的序列 為第229-896位的序列。
[0031] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述CAG啟動子的序列如SEQIDN0 :10所示。
[0032] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述LTR啟動子的序列如SEQIDN0 :13所示。
[0033] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的包含有人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白 基因（Humancytomegalovirusmajorimmediate-earlyproteingene)增強子 / 啟動子、 人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因外顯子1和人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因內(nèi) 含子1的序列如SEQIDN0 :16所示。
[0034] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述真核表達(dá)載體具有如SEQIDN0 :17所示的 序列。
[0035] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其還含有外源基因，優(yōu)選地，所述外源基因為病毒的 膜蛋白基因。
[0036] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述病毒為有包膜病毒，優(yōu)選地，所述有包膜病毒包 括DNA病毒、RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如選自冠狀病毒（例如SARS-CoV)，皰瘆病毒，痘病 毒，嗜肝病毒（如丙肝病毒），絲狀病毒（如Ebola病毒），彈狀病毒（例如狂犬病毒），流感 病毒，副粘病毒（如麻瘆病毒、呼吸道合胞病毒），黃病毒（例如登革病毒），囊膜病毒，布尼 亞病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒。
[0037] 本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項的假病毒包裝載體、本發(fā) 明任一項的假病毒包裝系統(tǒng)或本發(fā)明任一項的真核表達(dá)載體。
[0038] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如為HEK293、HEK293T、 HEK293FT等細(xì)胞。
[0039] 本發(fā)明還涉及假病毒，其由本發(fā)明第一方面任一項的假病毒包裝載體、本發(fā)明任 一項的假病毒包裝系統(tǒng)、本發(fā)明任一項的真核表達(dá)載體或本發(fā)明任一項的宿主細(xì)胞制備得 到。
[0040] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明任一項的假病毒包裝載體、本發(fā)明任一項的假病毒包裝系 統(tǒng)、本發(fā)明任一項的真核表達(dá)載體或本發(fā)明任一項的宿主細(xì)胞在制備假病毒中的用途。
[0041] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的假病毒為有包膜病毒的假病毒，所述有 包膜病毒包括DNA病毒、RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如選自冠狀病毒（例如SARS-CoV)，皰瘆 病毒，痘病毒，嗜肝病毒（如丙肝病毒），絲狀病毒（如Ebola病毒），彈狀病毒（例如狂犬 病毒），流感病毒，副粘病毒（如麻瘆病毒、呼吸道合胞病毒），黃病毒（例如登革病毒），囊 膜病毒，布尼亞病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒。
[0042] 本發(fā)明還涉及一種假病毒的制備方法，其包括以下步驟：
[0043] 將本發(fā)明第一方面任一項的假病毒包裝載體和本發(fā)明任一項的真核表達(dá)載體共 轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即得到假病毒。
[0044] 在本發(fā)明的實施方案中，所述真核細(xì)胞例如選自HEK293、HEK293T、HEK293FT等細(xì) 胞。
[0045] 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種攜帶螢火蟲熒光素酶報告基因的新的慢 病毒載體pSG3.Aenv.Fluc，它是雙鏈環(huán)狀DNA，長度為16. 4kb左右。利用pSG3.Aenv的 Hpal酶切位點，設(shè)計In-Fusion連接引物，PCR擴增熒光素酶基因，用In-FusionHDEnzyme Premix將PCR產(chǎn)物和酶切載體，連接得到pSG3.Aenv.Flue質(zhì)粒。
[0046] 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種新的慢病毒載體pSG3.Aenv.cmvFluc， 它是雙鏈環(huán)狀DNA，長度為17.lkb左右，其是在所得載體pSG3.Aenv.Flue的基礎(chǔ)上添 加CMV啟動子到熒光素酶基因上游。具體地，利用pSG3.Aenv的Hpal酶切位點，設(shè)計 In-Fusion連接引物，從帶