：
[0027] 吸取2-4mL步驟1所得土樣渾濁液，加至裝有30-60mL富集培養(yǎng)基一的容量為 250mL的三角瓶中，于45-50°C、轉(zhuǎn)速160-200r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5-7d，得富集培養(yǎng)液。 無菌操作量取30-50mL富集培養(yǎng)液，4000-6000r/min離心5-10min，倒掉上清，用富集培養(yǎng) 基二將離心后的沉淀洗至裝有30-60mL富集培養(yǎng)基二的250mL三角瓶中，于45-50°C、轉(zhuǎn)速 160-200r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5-7d。
[0028] 步驟3,初篩：
[0029] 將第二次富集后的培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各級(jí)稀釋的培養(yǎng)液 0. 2mL分別涂布于霉菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿晾至表面沒有流動(dòng)液體時(shí)，用保鮮膜將培養(yǎng)皿 口封好，并置于37-40°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18-24h，然后將平板置于40-45°C恒溫培養(yǎng) 箱中繼續(xù)倒置培養(yǎng)2-4d。
[0030] 將平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)種到兩個(gè)初篩選擇培養(yǎng)基的相同位置，兩個(gè)初篩培養(yǎng)基分 別為阿魏酸酯酶初篩培養(yǎng)基和纖維素酶初篩培養(yǎng)基，接種好的培養(yǎng)皿40-45°C恒溫培養(yǎng)箱 中倒置培養(yǎng)2-4d。待有明顯菌落形成，觀察阿魏酸酯酶初篩培養(yǎng)基上有無明顯透明圈出現(xiàn)。 將纖維素酶初篩平板上加入一定量〇. 1 %的剛果紅染液，染色Ι-lOmin，倒掉染色液，觀察 菌落周圍剛果紅顏色是否明顯變淺。將在兩種初篩平板上均出現(xiàn)水解圈的菌株從阿魏酸酯 酶初篩培養(yǎng)基平板上接種出來，進(jìn)一步復(fù)篩。阿魏酸酯酶和纖維素酶初篩平板檢測(cè)結(jié)果分 別如表1和表2所不。
[0031] 步驟4,復(fù)篩：
[0032] 將步驟3初篩得到的菌株于PDA培養(yǎng)基平板上劃線，置于40-45 °C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)2-3d，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次觀察到菌落形態(tài)一致則認(rèn)為菌株已純化。
[0033] 步驟5,菌種保藏：
[0034] 將復(fù)篩得到的菌株純化后，接種到固體種子培養(yǎng)基上，35_40°C下培養(yǎng)3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接種到裝有30-50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在160-180r/ min轉(zhuǎn)速下37-40°C進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)3-4d后，按照6-10 % (v/v)的接種量，將液體 種子接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)中，在160_180r/min轉(zhuǎn)速下40-45°C進(jìn)行液體震蕩發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā) 酵培養(yǎng)3-5d，取發(fā)酵液1200r/min，IOmin離心后收集上清液測(cè)定阿魏酸酯酶和纖維素酶酶 活性。選取兩種酶活性均較高的菌株進(jìn)行劃線傳代培養(yǎng)，最終得到一株產(chǎn)酶穩(wěn)定且有較高 酶活的既產(chǎn)耐高阿魏酸酯酶又產(chǎn)耐高溫纖維素酶的產(chǎn)生菌株。純化的菌株接種于PDA斜面 培養(yǎng)基上，4°C保藏。復(fù)篩結(jié)果如表3所示，綜合考慮阿魏酸酯酶和纖維素酶的酶活情況，選 擇菌株AWS26作為目的菌株。
[0035] 其中，所使用的培養(yǎng)基配方如下：
[0036] 富集培養(yǎng)基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纖維素鈉0. 5g，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，補(bǔ)充 水至100mL，pH4. 5，121°C、15min滅菌，自然冷卻后，加入過濾除菌的氨芐青霉素至終濃度 50mg/L〇
[0037] 富集培養(yǎng)基二：麩皮粉lg、玉米秸桿粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，補(bǔ) 充水至100mL，pH4. 5，121°C、15min滅菌，自然冷卻后，加入過濾除菌的氨芐青霉素至終濃 度 50mg/L。
[0038] 霉菌篩選培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基800mL，孟加拉紅0. 02g，氯霉素0. lg，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液 lmL，補(bǔ)水至1000mL，瓊脂粉15g。121°C、15min滅菌。孟加拉紅和氯霉素滅菌后加入。
[0039] 阿魏酸酯酶初篩培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基100mL，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，瓊脂粉I. 5g，pH4. 5,121°C滅菌20min。培養(yǎng)基滅菌后充分搖勻，隨著搖動(dòng)，培養(yǎng)基逐漸 變得不透明，在60-70°C下倒入平板中。其中，阿魏酸乙酯溶液：稱取0. 22g阿魏酸乙酯于離 心管中，加入500 μ L N、N-二甲基酰胺溶液，震蕩溶解后再加入500 μ L無菌水，充分搖勻。
[0040] 纖維素酶初篩培養(yǎng)基：纖維素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL， 瓊脂1. 5,加蒸餾水定容至100mL，pH值4. 5。121°C滅菌15min。
[0041] 固體種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基99mL，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，瓊脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min滅菌。
[0042] 液體種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基99mL，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL。121°C，15min滅菌。
[0043] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基80mL，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，蛋白胨lg，吐溫80 0. 5mL， (NH4)2SO4 lg，補(bǔ)充去離子水至 100mL。121°C，15min 滅菌。
[0044] 上述培養(yǎng)基中，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液：NaNO3 2. 0g，K2PO4 I. 5g，CaCl2 I. 5g，MgSO4 0· 3g， FeSO4 · 7H20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4)2SO4 5g，去離 子水 1000 mL。
[0045] PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水定容至1000mL。稱取200g馬鈴薯，洗 凈去皮切碎，加水1000 mL煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，添加蔗糖20g，補(bǔ)充水至1000mL。
[0046] 表1產(chǎn)阿魏酸酯酶霉菌平板初篩結(jié)果
[0047]
[0048]

[0049] 表2產(chǎn)纖維素酶霉菌平板初篩結(jié)果
[0050]
[0051] 表3各菌株粗酶液酶活
[0052]
[0054] 本發(fā)明所得菌株AWS26,菌落在PDA平板上呈輻射狀快速生長(zhǎng)，初期菌絲表面疏 松、平坦，白色，因產(chǎn)生分生孢子而呈現(xiàn)淡綠色，以后逐漸增多，呈深綠色。菌絲層致密、較 厚，產(chǎn)孢叢束排列成同心輪紋狀，菌落背面無色。在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲 體由具有橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，孢子梗由菌絲直立生出，分枝繁復(fù)，近似直角伸出，對(duì)生或 互生，呈樹枝狀排列，孢子梗長(zhǎng)5. 0-12. 0 μ m，中間寬2. 5-3. 7 μ m，基部寬L 5-3. 0。分生孢 子成簇著生于分生孢子梗的頂端。分生孢子球形或橢圓形，大小為3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布滿小刺，靠粘液在小梗上聚集成球狀綠色的分生孢子頭。對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》 和相關(guān)文獻(xiàn)確定該菌株是深綠木霉（Trichodermaatroviride)。
[0055] 提取本發(fā)明菌株AWS26基因組，依據(jù)真菌18SrDNA中最保守的序列設(shè)計(jì)引物， 擴(kuò)增采用上游引物：5' -CCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（如SEQ ID NO. 2所示），下游引物： 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（如 SEQ ID NO. 30.所示）。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性 5min， 94°C變性40S，52°C退火40S，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min，4°C保存。 擴(kuò)增產(chǎn)物連接 PMD18-T 載體。PCR 反應(yīng)體系為：10XBuffer2yL，dNTP(2. 5mmol/L)2yL，上 游引物 I UL，下游引物 I yL，templatelO ~50ng，Taq 酶（2. 5U)0. 3μ 1，加水補(bǔ)足 20yL。 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到其18S rDNA片段712bp。將該擴(kuò)增片段凝膠回收并測(cè)序，提交GenBank進(jìn) 行核酸同源性分析，測(cè)得序列如