一種硅基陣列微反應(yīng)池?cái)?shù)字pcr芯片及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于PCR技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種硅基陣列微反應(yīng)池?cái)?shù)字PCR芯片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA分子擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，精確定量DNA拷貝數(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要應(yīng)用之一。1997年，James F.Brown, Jonathan E.Silver和Olga V.Kalinina 構(gòu)建了數(shù)字 PCR(digital polymerase chain react1n，dPCR)技術(shù)的雛形，并獲得了美國專利(專利號(hào):US6143496 A)。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)不同的是，數(shù)字PCR將核酸樣本充分稀釋，使每個(gè)反應(yīng)艙的樣本模板數(shù)少于或者等于I個(gè)，PCR擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)艙的焚光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，解決了實(shí)時(shí)焚光定量PCR(real time quantitativePCR，qPCR)利用對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量過程中的一系列問題，實(shí)現(xiàn)了單分子DNA絕對(duì)定量。該技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測通量高、定量準(zhǔn)確，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細(xì)胞基因表達(dá)、環(huán)境微生物檢測和下一代測序等方面。
[0003]數(shù)字PCR(Digital PCR-dPCR)技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR(qPCR)技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對(duì)定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。
[0004]數(shù)字PCR芯片可使用的反應(yīng)池材料相當(dāng)廣泛。在選擇數(shù)字PCR芯片材料時(shí)，需要綜合考慮材料的多方面性質(zhì)，包括導(dǎo)熱性、耐用性、成本、表面化學(xué)性質(zhì)、光學(xué)和電學(xué)性能、生物相容性，是否易于制造、集成及大規(guī)模生產(chǎn)等。目前已報(bào)道的數(shù)字PCR系統(tǒng)主要采用硅、玻璃、PDMS等構(gòu)成。玻璃透明，但導(dǎo)熱性較差。PDMS材料具有優(yōu)良的生物惰性、較好的透光性，因此在數(shù)字芯片中得到了廣泛的應(yīng)用，但是在數(shù)字PCR芯片的應(yīng)用中具有一定的局限性，主要是由于PDMS具有一定程度的透氣性，而PCR的熱循環(huán)溫度較高，高溫一般在94-95°C，同時(shí)在預(yù)變性過程中還需要在高溫階段維持5-10分鐘，由于PCR熱循環(huán)過程的高溫已經(jīng)接近水的沸點(diǎn)100°C，如果密封材料具有一定透氣性勢必會(huì)使水蒸氣揮發(fā)造成反應(yīng)液中水溶劑減少，反應(yīng)液的成分濃度發(fā)生變化，當(dāng)熱循環(huán)溫度降低時(shí)，由于反應(yīng)池高溫時(shí)水分的揮發(fā)形成負(fù)壓，環(huán)境中的氣體同樣會(huì)由于PDMS的透氣性進(jìn)入到反應(yīng)池中形成氣泡，進(jìn)而影響反應(yīng)池的密封。同時(shí)PDMS的熱導(dǎo)率較差(約0.18W/mK)，利用其制備的PCR芯片在熱循環(huán)過程中熱傳遞效率較低，如果在不延長熱循環(huán)時(shí)間的前提下必然會(huì)對(duì)PCR擴(kuò)增效率造成影響。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)存在著很多問題，比如，很難將液體均勻地進(jìn)入到芯片上的陣列微孔中，在PCR反應(yīng)過程中，液體容易蒸發(fā)，不同的區(qū)域面積受熱不均。芯片上的微孔之間容易串?dāng)_。反應(yīng)微孔的極性不能與反應(yīng)體系相匹配，催化酶容易吸附在微孔壁上，不能參與反應(yīng)。微流控芯片價(jià)格高昂。所以急需制造出一種功能全面，性能優(yōu)越的數(shù)字PCR芯片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是一種陣列微反應(yīng)池?cái)?shù)字PCR芯片，所述芯片12設(shè)置有列陣的微孔13，芯片12上方有上蓋18。
[0007]所述芯片12為硅片；所述芯片12的厚度為0.36-0.50mm，優(yōu)選為0.38-0.39mm ;所述上蓋18為透明玻璃。
[0008]所述微孔13為蜂窩狀排列，微孔13直徑為20-200微米，優(yōu)選為50-200微米；微孔13的外圍有溝槽11。
[0009]所述芯片12放置于芯片槽I內(nèi)，芯片槽I設(shè)置有凹槽10，導(dǎo)熱板2的上端面上設(shè)置有O型密封圈3 ;在所述的導(dǎo)熱板I的四角分別設(shè)置第一凸緣7和第二凸緣8，在每一第一凸緣7的上端面上分別設(shè)置一螺釘4，在每一第二凸緣8的上端面上分別設(shè)置一隔熱襯套5 ；
[0010]所述凹槽10的四邊設(shè)置有臺(tái)階9 ;臺(tái)階9設(shè)置有弧形凹口 6 ;凹槽10內(nèi)注滿油，所述油為低密度礦物油；所述導(dǎo)熱板I的厚度為2.5-3.5mm，制作材料為紫銅；所述O型密封圈3的材料為耐熱橡膠；所述螺釘4的材料為不銹鋼；所述隔熱襯套5的材料為聚四氟乙稀。
[0011]所述芯片12的表面與微孔13內(nèi)部進(jìn)行了 PEG修飾；使整個(gè)芯片表面及微孔內(nèi)部形成一層或多層PEG ;PEG修飾試劑為2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷。
[0012]陣列微反應(yīng)池?cái)?shù)字PCR芯片制備方法，具體步驟如下:
[0013]步驟1:選擇一單面拋光的芯片基片；
[0014]步驟2:清洗，⑴丙酮水浴lOmin，超聲lOmin，回收廢液，去離子水沖洗20遍以上；(2)乙醇水浴lOmin，超聲lOmin，回收廢液，去離子水沖洗2 O遍以上；(3)配制硫酸過氧化氫混合溶液，H2S04和H202的體積比為3: 1，使用熱板18 O °C加熱20min，回收廢液后用去離子水沖洗2()遍以上；(4)吹片烘干；
[0015]步驟3:在芯片基片拋光面上旋涂一層均勻的光刻膠，通過曝光在表面形成圓形的圖形列陣；
[0016]步驟4:在圖形陣列掩膜下干法刻蝕芯片12，形成溝槽11和圓形的微孔13 ;
[0017]步驟5:去膠，丙酮水浴lOmin，超聲lOmin，以硫酸過氧化氫混合溶液浸泡20min，大量去尚子水沖洗20遍以上；
[0018]步驟6:劃片，完成芯片12制備。
[0019]所述步驟還包括對(duì)芯片12的表面與微孔13內(nèi)部進(jìn)行PEG修飾；向微孔13內(nèi)進(jìn)液采用刮液方式，將PCR反應(yīng)液加到芯片的一側(cè)，傾斜、緩慢刮液；刮液過程持續(xù)1s ;刮液結(jié)束后，沿刮液方向滴加油滴，直至整個(gè)芯片12被油覆蓋；滴油過程持續(xù)5-lOs ;所述刮液使用硅膠片。
[0020]所述步驟還包括將芯片槽I注滿油，然后將芯片12放置入凹槽10，利用芯片12槽I內(nèi)的臺(tái)階9支撐芯片12，然后加上蓋18，利用螺釘4將上蓋18固定于芯片槽I上，整個(gè)過程避免產(chǎn)生氣泡。
[0021]本發(fā)明采用刮液方式進(jìn)液，最后利用油封實(shí)現(xiàn)了孔與孔之間無串?dāng)_，孔內(nèi)試劑獨(dú)立密封的目的。在微孔中進(jìn)液，通過油和上蓋再將芯片整體密封，有效避免了將微栗、微閥等進(jìn)液裝置集成到芯片外圍加工工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴的問題。密封后的芯片保證了內(nèi)部的油及芯片與外部環(huán)境的隔液隔氣。芯片槽材料采用紫銅加工而成，能夠快速的進(jìn)行熱量傳遞，有效縮短了 PCR反應(yīng)過程中的熱循環(huán)時(shí)間。芯片槽中設(shè)置臺(tái)階，熱傳導(dǎo)過程中加熱器將熱量傳遞給芯片槽，芯片槽對(duì)內(nèi)部的油進(jìn)行加熱，油再將熱量傳遞給芯片。避免了直接接觸造成的芯片受熱不均。
[0022]基于微反應(yīng)池的數(shù)字PCR芯片與微流控芯片相比制備工藝簡單，價(jià)格低廉，采用刮液的方式注液，能夠一次性在兩萬多個(gè)陣列微反應(yīng)池中有效注液。微孔排列為蜂窩狀，目的是在有限芯片面積上盡可能多的分布微孔，微孔陣列外圍設(shè)計(jì)一定寬度的方框溝道，可以防止在刮液操作過程中液體溢出芯片表面，節(jié)約生物試劑，還能減少熱循環(huán)過程中微孔反應(yīng)試劑揮發(fā)，保證PCR正常擴(kuò)增效率。利用PEG對(duì)芯片進(jìn)行的整體修飾，在微納體系中保證PCR反應(yīng)順利進(jìn)行關(guān)鍵是避免微反應(yīng)池側(cè)壁對(duì)反應(yīng)體系中酶的吸附。規(guī)避了表面疏水處理、孔內(nèi)親水處理的繁瑣過程，實(shí)現(xiàn)了孔內(nèi)單拷貝DNA的PCR過程。在微納體系中保證PCR反應(yīng)順利進(jìn)行的另一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)