煙草內(nèi)生真菌菌株ycef005的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，提供了一種用于內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)，尤其是固體發(fā) 酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 固體發(fā)酵（solid-statefermentation，SSF)是在指沒有或幾乎沒有自由水存在 下，在有一定濕度固態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物進(jìn)行的一個(gè)生物反應(yīng)過程（Singhania etal.，2009)。從生物反應(yīng)過程的角度考慮，固態(tài)發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過程， 更為具體的，我們可以認(rèn)為固體發(fā)酵是一種在培養(yǎng)基為固體微粒的情況下進(jìn)行利用的一 種發(fā)酵手段（Mitchelletal.，2000b)。固體發(fā)酵與液體發(fā)酵相比有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)：培 養(yǎng)基更為便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制發(fā)酵體積、產(chǎn)生的廢水較少（PandeyAet al.，2000;PandeyAetal.，2008)。以培養(yǎng)基的用料為例，用于固體發(fā)酵的培養(yǎng)基比較單 純，一般來說，例如谷物類、小麥麩、小麥草、大宗谷物或農(nóng)產(chǎn)品等均可被使用，所以發(fā)酵原 料成本較經(jīng)濟(jì)。
[0003] 對(duì)于大多數(shù)的微生物而言，其生長的環(huán)境并沒有大量的自由水存在。即便是海 洋中的微生物，其中有超過98%的種類是生長于水下表層的固體介質(zhì)中的，對(duì)于真菌而 言，所有已知的真菌中只有不到1%的種類是在海洋中發(fā)現(xiàn)的（Carlile&Watkinson, 1994 ; Kelecom，2002)。也正是因?yàn)槿绱?，固體發(fā)酵能夠較好地模擬真菌的生長環(huán)境，從而適用于 真菌的生物發(fā)酵。
[0004] 到目前為止，有許多人研究了影響固體發(fā)酵進(jìn)程的生物化學(xué)和工程學(xué)的因 素（Mitchelletal.，2000a, 2000b;Pandey, 2003)，但是SSF中的許多技術(shù)問題仍然 沒有得到解決（H51keretal.，2004)。即便如此，SSF在生物技術(shù)中的運(yùn)用已經(jīng)很 廣泛了（Raimbault, 1998;Pandeyetal.，2000, 2001)。在許多綜述中可以查到運(yùn)用 SSF技術(shù)生產(chǎn)的一些生物產(chǎn)品或代謝物，如次級(jí)代謝產(chǎn)物（Balakrishnan&Pandey，1996 ; Robinsonetal.，2001)、黃曲霉素（Barrios-Gonzalez&Tomasini, 1996)、工程酶（Pandey etal.，1999)、細(xì)菌酶（Babu&Satyanarayana, 1996)、淀粉糖化酶（Selvakumaret al.，1998)、纖維素酶（Cen&Xia，1999)、中國食品（Hanetal.，2001)、木質(zhì)素的生物轉(zhuǎn) 化（Tengerdy&Szakacs，2003)、食用菌種植和天然香料的生產(chǎn)（Wang, 1999)、富蛋白食物 (Nigam&Singh，1996)等。
[0005] 關(guān)于固體發(fā)酵工藝的優(yōu)化，一般情況下，都會(huì)從溫度、培養(yǎng)基、初始pH、含水量、接 種量、種齡、發(fā)酵時(shí)間等角度考慮，而關(guān)于培養(yǎng)基，更是涉及了碳源、氮源和無機(jī)鹽的選擇 (DavoodMazaherietal., 2012 ；TamiresCarvalhodosSantosetal., 2012 ；Madhuri Narraetal.,2012 ;FatmaChaarietal.,2012)。以含水量為例，在蛋白酶和脂肪酶的生 產(chǎn)中，高含水量會(huì)降低培養(yǎng)基質(zhì)的多孔性，從而妨礙氣體的交換，而低含水量則會(huì)減少微生 物的生長，從而使酶的產(chǎn)量下降（Mahantaetal.，2008)。再以發(fā)酵時(shí)間（發(fā)酵進(jìn)程）對(duì)固 體發(fā)酵的影響為例，Biazus等人在采用玉米麥芽糖進(jìn)行研究的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵開始時(shí)，產(chǎn)物 的量很低，而隨后產(chǎn)物的量就迅速上升直到達(dá)到最大值，在達(dá)到最大產(chǎn)物量后，產(chǎn)物的生成 就受到了抑制，并且產(chǎn)物的活性也會(huì)下降（Biazusetal.，2006)。
[0006] 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ArtificialNeuralNetwork，ANN)簡稱神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，是在人類對(duì)其 大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上人工構(gòu)造的能夠?qū)崿F(xiàn)某種功能的信息處理系統(tǒng)，具有非線性、 非局限性、非常定性等優(yōu)點(diǎn)。目前神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的種類有60多種，如BP(Back-propagation)神 經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、RBF(RadicalBasisFunction)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、SVM(SupportVectorMachine)神經(jīng)網(wǎng) 絡(luò)、S0M(Self_0rganizingFeatureMap)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)具有很強(qiáng)的非線 性映射，它根據(jù)輸入輸出數(shù)據(jù)來建立模型，網(wǎng)絡(luò)的統(tǒng)計(jì)信息儲(chǔ)存在連接權(quán)矩陣內(nèi)，故可以反 映十分復(fù)雜的非線性關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)的輸出端點(diǎn)個(gè)數(shù)不限，因而很適合于多因變量、多自變量統(tǒng) 計(jì)中的建模，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用，如，培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵建模過程和控制優(yōu)化以及發(fā)酵 分批補(bǔ)料控制等。
[0009] T1 j-輸入輸出間的突觸時(shí)延
[0010]Tj一神經(jīng)元j的閥值
[0011]wij一神經(jīng)元i到j(luò)的突觸連接系數(shù)/權(quán)重值
[0012] f(x)-神經(jīng)元變換函數(shù)
[0013]神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有許多優(yōu)良的性能，如：非線性映射能力、自組織性和自適應(yīng)性能力、記 憶聯(lián)想能力等。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模型很多，目前應(yīng)用最廣泛的具有成效的是BP(誤差反向傳播 算法，BackPropagation)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，除此之外，還有RBF(徑向基函數(shù)，RadicalBasis Function)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、SVM(支持向量機(jī)，SupportVectorMachine)也有應(yīng)用。
[0014]遺傳算法（Geneticalgorithms，GA)由Michigan大學(xué)Holland教授于 2〇 世紀(jì) 70年代提出。GA采用選擇（Selection)、交叉（Crossover)和變異（Mutation)運(yùn)算來實(shí)現(xiàn) "物競天擇，適者生存"這一自然法則的模擬.將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法耦聯(lián)處理，可以較好地 優(yōu)化出培養(yǎng)基配方。
[0015]遺傳算法的第一步是將實(shí)際問題的參數(shù)集編碼成位串，通常采用二進(jìn)制編碼或者 實(shí)數(shù)編碼。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化中采用實(shí)數(shù)編碼。第二步，從編碼的數(shù)據(jù)中隨機(jī)產(chǎn)生初始種群1，進(jìn) 入第一輪篩選。第三步，對(duì)初始種群進(jìn)行適應(yīng)值計(jì)算。第四步，進(jìn)行選擇與遺傳操作。第五 步，統(tǒng)計(jì)經(jīng)第四步產(chǎn)生的個(gè)體，從而構(gòu)成種群2。種群2將重復(fù)上述步驟產(chǎn)生種群3。如此 循環(huán)往復(fù)直到找到擁有最大適應(yīng)值的個(gè)體，即找到最優(yōu)解。
[0016]神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有很強(qiáng)的輸入輸出非線性映射能力，特別適用于微生物發(fā)酵這種高度非 線性、非結(jié)構(gòu)化的復(fù)雜模型中。而遺傳算法又是一種有導(dǎo)向的全局隨機(jī)搜索方法，它對(duì)于目 標(biāo)函數(shù)和搜索空間沒有任何限制，因此非常適合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等無明確分析函數(shù)形式的優(yōu) 化問題。
[0017]神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法之間是通過適應(yīng)度函數(shù)進(jìn)行耦合的。在微生物培養(yǎng)基優(yōu)化中 通常是先通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立培養(yǎng)基各組份間的數(shù)學(xué)模型，然后將這數(shù)學(xué)模型作為遺傳算法 中的適應(yīng)度函數(shù)求解該函數(shù)的最優(yōu)解。近幾年國內(nèi)外許多學(xué)者應(yīng)用此法成功優(yōu)化了各種微 生物產(chǎn)品的培養(yǎng)基，其優(yōu)化效果優(yōu)于響應(yīng)面、正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種內(nèi)生真菌YCEF005固體發(fā)酵培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基 能夠快速有效地得到煙草內(nèi)生真菌固體發(fā)酵的產(chǎn)物。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供采用上述 的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。
[0019] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0020] -種內(nèi)生真菌YCER)05固體發(fā)酵培養(yǎng)基，該固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括基質(zhì)和外加營養(yǎng) 組分以及水其中基質(zhì)按質(zhì)量百分比包括基質(zhì)包括60%麩皮、10%豆餅粉、10%米糠和10% 玉米碎粒；水的含量為基質(zhì)總質(zhì)量的50%;以基質(zhì)總質(zhì)量為Ikg計(jì)，所述的外外加營養(yǎng)組分 包括：蔗糖12. 96g，硝酸銨4. 00g，蛋白胨12. 70g，磷酸二氫鉀I. 50g，硫酸鈣10. 00g，硫酸 鎂0. 48g;蒸餾水500g。
[0021] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0022] -種內(nèi)生真菌YCEF005的培養(yǎng)方法，該方法包括以下的步驟：
[0023] 1)菌株活化：用滅菌的牙簽挑取PDA斜面保存管中的少許菌絲，接種于PDA培養(yǎng) 基上，封口后置于恒溫培養(yǎng)箱中，24h黑暗25°C下活化培養(yǎng)；
[0024] 2) -級(jí)種子液培養(yǎng)：將10塊直徑5mm的菌餅，接種于在200ml液體種子培養(yǎng)基中， 于150r/min，25°C培養(yǎng)72h;液體種子培養(yǎng)基為指馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液；
[0025] 3)二級(jí)種子液培養(yǎng)：200ml-級(jí)種子液用攪拌器打碎并搖晃混勻，吸取20ml接種 于200ml液體種子培養(yǎng)基，于150r/min，25°C培養(yǎng)72h;
[0026] 4)固態(tài)培養(yǎng)：200ml二級(jí)種子培養(yǎng)液打碎并搖晃混勾，吸取2ml接種于IOg上述的 內(nèi)生真菌YCEF005固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C條件下黑暗培養(yǎng)7d。
[0027] 作為優(yōu)選，所述的PDA培養(yǎng)基的制備方法如下：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂 20g，蒸餾水定容至1000 mL;1. 1個(gè)大氣壓、121°C下滅菌20min。
[0028]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0029] 1、首次嘗試煙草內(nèi)生真菌的固體發(fā)酵，開創(chuàng)先例；
[0030] 2、首次得到Y(jié)CEF005類型煙草內(nèi)生真菌的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型；
[0031] 3、能夠快速有效地得到煙草內(nèi)生真菌固體發(fā)酵的產(chǎn)物。
【附圖說明】
[0032]圖1 :菌絲中核酸量與菌絲量的關(guān)系：兩個(gè)煙草內(nèi)生真菌菌株菌絲中的核酸量與 菌絲干重之間具有良好的線性關(guān)系，菌株YCEF005線性方程為y= 10. 131x+0. 0332,R2 = 0? 9995 ;菌株YCER)53 線性方程為y= 11. 757x+0. 0716,R2= 0? 9988。
[0033] 圖2 :不同固態(tài)基質(zhì)上內(nèi)生真菌的生