轉(zhuǎn)基因玉米bt176雙重?cái)?shù)字pcr熒光定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及轉(zhuǎn)基因玉米BT176雙重?cái)?shù) 字PCR熒光定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1996年首例轉(zhuǎn)基因番茄在美國(guó)成功商業(yè)化以來(lái)，對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的研究近 二十年來(lái)取得了迅速的發(fā)展。根據(jù)ISAAA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，截至2014年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植 面積已經(jīng)達(dá)到1. 8億公頃，比1996年種植面積提高了近100倍，占全球作物種植總面積的 3. 4%。轉(zhuǎn)基因作物的快速發(fā)展不僅為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)提供了更加便利的育種方式，也由于其未知 的安全隱患引起了各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的廣泛關(guān)注。為此，各國(guó)家和地區(qū)紛紛建立起轉(zhuǎn)基因成 分的標(biāo)識(shí)制度。在全球各國(guó)家和地區(qū)制定的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)制度中，定量標(biāo)識(shí)制度占據(jù)較 大比重，其中以歐盟和日韓最具代表性。我國(guó)在轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)方面主要采取定性標(biāo)識(shí)制 度，由于定性標(biāo)識(shí)制度與定量標(biāo)識(shí)制度在檢測(cè)技術(shù)等方面存在不同，使我國(guó)在作物進(jìn)出口 方面容易受到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的制約。為此，我國(guó)需要大力發(fā)展轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)技術(shù)并建立 相關(guān)定量標(biāo)識(shí)制度。
[0003] 數(shù)字PCR(Digital-PCR)是一種新型的絕對(duì)定量PCR檢測(cè)方法，是一項(xiàng)檢測(cè)和定 量核酸的新技術(shù)，其基本原理是通過(guò)將微量樣品進(jìn)行大倍數(shù)稀釋和分液，直至每個(gè)樣品中 所含有的待測(cè)分子數(shù)不超過(guò)1個(gè)，再將所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有PCR擴(kuò)增 熒光信號(hào)記為1，無(wú)熒光信號(hào)記為0,有熒光信號(hào)的反應(yīng)單元中至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分 子，針對(duì)反應(yīng)結(jié)果采用泊松分布（Poissondistribution)公式，便可計(jì)算出樣本的最初 拷貝數(shù)或濃度。該技術(shù)不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，也無(wú)需看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可 實(shí)現(xiàn)DNA絕對(duì)定量。該技術(shù)在基因拷貝數(shù)變化分析（copynumbervariation,CNV)(Qin etal.，2008)、遺傳突變檢測(cè)（Yungetal.，2009)、基因分型（Loetal.，2007)、基因定 量（Warrenetal.，2010)、單細(xì)胞基因表達(dá)（Guoetal.，2010)等方面的研究取得了突破 性的發(fā)展，在臨床方面為癌癥、腫瘤等疾病檢測(cè)提供了新的診斷方法。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面， Corbisier等（2010)利用數(shù)字PCR分析了玉米種子DNA中外源基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)之 比，該結(jié)果與利用普通熒光定量PCR技術(shù)以質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)的結(jié)果相同，證明了數(shù) 字PCR的可靠性。Burns等（2010)評(píng)估了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中檢測(cè)限（L0D)和定量限 (L0Q)，探索了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面的可行性和反應(yīng)條件，表明數(shù)字PCR能夠?qū)ζ鹗?模板拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量。然而利用數(shù)字PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的研究還處于起步階段?，F(xiàn)有 數(shù)字PCR檢測(cè)方法都需要經(jīng)過(guò)樣品前處理過(guò)程，在實(shí)際檢測(cè)中，前處理過(guò)程往往會(huì)導(dǎo)致實(shí) 驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差。因此現(xiàn)有的數(shù)字PCR檢測(cè)方法不適合直接作為轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種不需要進(jìn)行樣品前處理步驟的，針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米BT176 的雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176的絕對(duì)定量。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于轉(zhuǎn)基因玉米BT176雙重?cái)?shù)字PCR熒光 定量檢測(cè)的引物和探針組合，所述引物和探針組合為：
[0006]外源基因正向引物：5' -GGCCGTGAACGAGCTGTT-3'
[0007]外源基因反向引物：5' -GGGAAGAAGCCTACATGITITCTAA-3'
[0008]外源基因探針：5'-FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-BHQ1-3'
[0009] 內(nèi)參基因adhl-135正向引物：5' -CGTCGITTCCCATCTCTTCCTCC-3'
[0010] 內(nèi)參基因adhl-135 反向引物：5' -CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'
[0011] 內(nèi)參基因adhl-135 探針：5' -VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1-3'。
[0012] 本發(fā)明還提供含有所述引物和探針組合的轉(zhuǎn)基因玉米BT176數(shù)字PCR雙重?zé)晒舛?量檢測(cè)試劑盒。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng) 性模板等中的至少一種。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)基因玉米BT176雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測(cè)方法，所述方法 包括以下步驟：
[0015] 1)提取待測(cè)樣品的基因組DNA ;
[0016] 2)以提取的基因組DNA為模板，利用所述的引物和探針組合，進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反 應(yīng)；
[0017]3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018] 其中，數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系以4yl計(jì)為：基因組DNAlyl，225nM外 源基因正、反向引物各0. 04yl，225nM內(nèi)參基因正、反向引物各0. 04yl，50nM外源基因 探針 0? 02yl，50nM內(nèi)參基因探針 0? 02yl，2XMasterMix(購(gòu)自Fluidigm公司）2y1， 20XLoadingReagent(購(gòu)自Fluidigm公司）0? 4y1，ddH20 補(bǔ)足至 4y1 〇
[0019] 數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?0°C熱激活300s;95°C預(yù)變性300s;95°C變性15s， 60°C退火及延伸60s，共50個(gè)循環(huán)；在60°C下采集熒光信號(hào)。
[0020] 前述的方法，步驟3)中檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體如下：在數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后， 記錄各反應(yīng)孔中外源基因和內(nèi)參基因的熒光信號(hào)值，通過(guò)泊松分布公式計(jì)算各反應(yīng)孔中外 源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，通過(guò)兩者的拷貝數(shù)之比得到轉(zhuǎn)基因成分的絕對(duì)濃度。
[0021] 本發(fā)明是在PCR芯片中進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將每個(gè)加樣孔作為一個(gè)整體，加入 轉(zhuǎn)基因作物數(shù)字PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增，通過(guò)監(jiān)測(cè)每個(gè)反應(yīng)孔中的熒光信號(hào)值， 獲得所有反應(yīng)孔中的總體擴(kuò)增曲線和熱點(diǎn)圖。
[0022] 檢測(cè)結(jié)果的判定按照以下方式進(jìn)行：
[0023] 1、在利用數(shù)字PCR進(jìn)行擴(kuò)增的過(guò)程中，陽(yáng)性孔的判定方法為：出現(xiàn)明顯區(qū)別于陰 性反應(yīng)孔（陰性反應(yīng)孔中模板為1y1ddH20)的擴(kuò)增信號(hào)，將該反應(yīng)孔記為陽(yáng)性擴(kuò)增孔；陽(yáng) 性樣品的判定方法為：在相同樣品的三個(gè)平行組內(nèi)，至少出現(xiàn)一組有陽(yáng)性擴(kuò)增孔，則表明檢 測(cè)樣品基因組中含有轉(zhuǎn)基因作物成分；
[0024] 2、在數(shù)字PCR擴(kuò)增結(jié)束后，記錄每個(gè)擴(kuò)增孔中外源基因和內(nèi)參基因的亮點(diǎn)數(shù)，通 過(guò)泊松分布公式計(jì)算每個(gè)孔中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，通過(guò)兩者的拷貝數(shù)之比得到 轉(zhuǎn)基因成分的絕對(duì)濃度；
[0025] 3、每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行組，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到三個(gè)平行組內(nèi)轉(zhuǎn)基因成分濃度的 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（1?0)，1?0<25%表明定量結(jié)果有意義；
[0026] 4、當(dāng)待測(cè)樣品反應(yīng)孔中為陰性結(jié)果時(shí)，表明未檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因作物成分；當(dāng)待測(cè)樣 品反應(yīng)管中為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，表明待測(cè)樣品中含有轉(zhuǎn)基因作物成分。
[0027] 本發(fā)明方法可以直接對(duì)待檢測(cè)樣品的基因組中的轉(zhuǎn)基因玉米BT176進(jìn)行定量檢 測(cè)，從而省去了現(xiàn)有的數(shù)字PCR方法中的樣品前處理步驟，使得檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便易行，避免了 前處理步驟對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的不良影響。另外，在本發(fā)明方法中，由于轉(zhuǎn)基因成分是通過(guò) 外源基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比例計(jì)算得到的，因此在同一個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行雙重檢 測(cè)可以提尚轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的穩(wěn)定性。
[0028] 利用本發(fā)明提供的雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn) 基因玉米BT176的絕對(duì)定量檢測(cè)，本方法定量檢測(cè)限可達(dá)到0. 5%，靈敏度可達(dá)到0. 1 %，能 夠滿足轉(zhuǎn)基因成分實(shí)際檢測(cè)的需要。此外，本方法操作簡(jiǎn)單，靈活性強(qiáng)，是一種轉(zhuǎn)基因絕對(duì) 定量檢測(cè)的有效方法。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因玉米BT176外源基因引物探針與不同內(nèi)參基 因引物探針組合的擴(kuò)增效果圖；其中，A為與內(nèi)參基因adhl-70bp組合，B為與內(nèi)參基因 adhl-135bp組合，C為與內(nèi)參基因hmga-79bp組合，D為與內(nèi)參基因zssllb-88bp組合。 [0030]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因玉米BT176品系特異性檢測(cè)結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)為 不同轉(zhuǎn)基因玉米品系，縱坐標(biāo)為利用雙重?cái)?shù)字PCR法擴(kuò)增得到的外源基因拷貝數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0032] 實(shí)施例1用于轉(zhuǎn)基因玉米BT176雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測(cè)的引物和探針組合的 設(shè)計(jì)
[0033] 根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米BT176品系外源基因插入序列及邊界序列設(shè)計(jì)了如下用于轉(zhuǎn)基 因玉米BT176雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測(cè)的引物和探針組合（SeqIDNo. 1-6):
[0034]外源基因正向引物：5' -GGCCGTGAACGAGCTGTT-3'
[0035]外源基因反向引物：5' -GGGAAGAAGCCTACATGITITCTAA-3'
[0036]外源基因探針：5'-FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-BHQ1-3'
[0037] 內(nèi)參基因adhl-135正向引物：5' -CGTCGITTCCCATCTCTTCCTCC-3'
[0038]內(nèi)參基因adhl-135反向引物：5' -CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'
[0039] 內(nèi)參基因adhl-135探針：5' -VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1-3'。
[0040] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因玉米BT176雙重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)方法的建立
[0041] 1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0042] 本實(shí)施例中使用的轉(zhuǎn)基因玉米BT176樣品及其親本非轉(zhuǎn)基因樣品，轉(zhuǎn)基因玉米品 系NK603、M0N810、MIR604、MIR162、3272、M0N863均由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供。PCR 芯片購(gòu)自美國(guó)Fluidigm公司，型號(hào)為48. 770DigitalArrayChip;BioMarkHD高通量基 因分析系統(tǒng)（BiomarkHDSystem)購(gòu)自Fluidigm公司。
[0043] 1. 2實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因作物種子樣品基因組DNA提取
[0044] (1)將作物種子樣品研磨并徹底風(fēng)干；
[0045] (2)將轉(zhuǎn)基因玉米品系與親本非轉(zhuǎn)基因種子樣品進(jìn)行不同比例的混合，并通過(guò)混 勻儀器的過(guò)夜混勻得到實(shí)驗(yàn)用的不同轉(zhuǎn)基因濃度的樣品；
[0046] (3)用分析天平稱取100mg樣品，加入400yLAPI緩沖液以及4yL的RNaseA， 劇烈震蕩混勻后，65°C下水浴20min，期間震蕩混勻2-3次；
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