一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，把特異反應(yīng)體系的一株生物原料包被在磁珠上，將包被生物原料的磁珠與被測(cè)樣本反應(yīng)，清洗后加入另一株已標(biāo)記β－二酮類(lèi)稀土配合物的特異性生物原料，發(fā)生免疫反應(yīng)，使磁珠、被測(cè)樣本和熒光示蹤物形成復(fù)合物，清洗后再加入熒光增強(qiáng)物，最后用時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)，獲得被測(cè)樣本的濃度等信息。本方法可實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨熒光法半自動(dòng)、全自動(dòng)系統(tǒng)（即隨機(jī)系統(tǒng)）檢測(cè)，能解決解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治黾夹g(shù)的不足之處，提高時(shí)間分辨熒光分析法的應(yīng)用和推廣。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 時(shí)間分辨焚光免疫分析(Timeresolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種非同 位素免疫分析技術(shù)，它把鑭系元素和配基結(jié)合起來(lái)形成螯合物，這些螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，熒 光壽命較長(zhǎng)，可達(dá)1~2ms，同時(shí)有很強(qiáng)的焚光效率，能夠滿(mǎn)足測(cè)量要求。時(shí)間分辨焚光分析 法，是關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波 長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈 敏度。
[0003] 目前市場(chǎng)上產(chǎn)品均是采用解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―issociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay DELFIA)是時(shí)間分辨焚光分析中的一種。它米 用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪(Eu 3+)連接，另一端與抗體/抗原分子上的 自由氨基連接，形成Eu3+標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過(guò)免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù) 合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，因此需加入一種解離增強(qiáng)液，首先把Eu 3+從復(fù)合物上解離下 來(lái)，然后自由Eu3+與解離增強(qiáng)液中熒光增強(qiáng)物(螯合劑)螯合進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，使Eu 3+的 熒光成行萬(wàn)倍增加。采用這種解離增強(qiáng)步驟分析方法，被稱(chēng)為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖?分析。
[0004] 時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)實(shí)際上是利用了發(fā)射熒光的波長(zhǎng)與其激發(fā)光波長(zhǎng)的 巨大差異(Stokes位移較大)克服了激發(fā)光對(duì)發(fā)射熒光的背景影響，由于Eu 3+和其配基形成 的螯合物的發(fā)射熒光的波長(zhǎng)在很狹窄光譜范圍內(nèi)，同時(shí)，其熒光壽命又較長(zhǎng)，這樣特點(diǎn)就解 決激發(fā)光的雜散光和外界短壽命光對(duì)發(fā)射熒光影響，從而大幅度提高了光學(xué)分析的靈敏 度。因此TRFIA具有很高的分析靈敏度、寬闊的測(cè)量范圍、優(yōu)良的分析精密性和對(duì)多個(gè)待測(cè) 物同時(shí)檢測(cè)的能力，成為方法學(xué)上頗具優(yōu)勢(shì)的非放射免疫分析技術(shù)之一。
[0005] 時(shí)間分辨熒光分析是以稀土離子標(biāo)記抗原或抗體、核酸探針和細(xì)胞等為特征的超 靈敏度檢測(cè)技術(shù)，它克服了酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光且易受環(huán)境干擾、電 化學(xué)發(fā)光的非直接標(biāo)記等缺點(diǎn)。使非特異性信號(hào)降低到可以忽略的程度，達(dá)到了極高的信 噪比，從而大大地超過(guò)了放射性同位素所能達(dá)到的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存 時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍寬、不受樣品自然熒光干 擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)，成為繼放射免疫分析之后標(biāo)記物發(fā)展的一個(gè)新里程碑。
[0006] 隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)微量、超微量的測(cè)定會(huì)越來(lái)越多，時(shí)間分辨熒光分析法 (TRFIA)具有越來(lái)越大的應(yīng)用空間，但是目前市場(chǎng)上還沒(méi)有時(shí)間分辨熒光分析法全自動(dòng)檢 測(cè)系統(tǒng)（即隨機(jī)系統(tǒng)），因此影響這種檢測(cè)方法的進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。這是由于目前大家均 是采用解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治龇?DELFIA)，DELFIA系統(tǒng)的使用原理是采用解離增 強(qiáng)液需把標(biāo)記Eu 3+解離下來(lái)，再增強(qiáng)鑭系元素的長(zhǎng)壽命熒光，由于解離增強(qiáng)液內(nèi)有較強(qiáng)的酸 性和較強(qiáng)的離子強(qiáng)度，影響全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)中包被載體磁珠的單分散性，從而影響檢測(cè)結(jié) 果，也在方法學(xué)上限制其使用和推廣。
[0007] 發(fā)明專(zhuān)利CN201310168516.2，公開(kāi)了一種新型的f3-二酮類(lèi)稀土配合物及其制備 方法，以大分子二酮類(lèi)為母體原料，然后將其在協(xié)同配體鄰菲羅啉的作用下與稀土離子 進(jìn)行配位得到新型的二酮類(lèi)大分子稀土配合物。該專(zhuān)利的熒光材料作為有機(jī)電致發(fā)光材 料主要應(yīng)用于彩電行業(yè)，缺乏與蛋白接合的基團(tuán)，不能應(yīng)用于免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
[0008] 發(fā)明專(zhuān)利CN201110287991.2,公開(kāi)了一種納米微球時(shí)間分辨熒光探針，為一高分 子材料包裹稀土元素?zé)晒馀浜衔锏募{米微球，其特征在于稀土元素?zé)晒馀浜衔锇ㄏ铝心?爾比的物質(zhì):稀土元素離子二酮體類(lèi)螯合劑:熒光增強(qiáng)協(xié)同劑=1:4:5,其中所述稀土元 素離子為Eu 3+和其他鑭系離子以100:1-1000:1摩爾比的雙摻混合物。該專(zhuān)利的時(shí)間分辨熒 光探針為乳膠納米微球，精密性較差，線(xiàn)性也較差，只適用于快速診斷行業(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為了克服上述技術(shù)問(wèn)題，提供了一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法?？蓪?shí)現(xiàn)時(shí)間 分辨熒光法半自動(dòng)、全自動(dòng)系統(tǒng)（即隨機(jī)系統(tǒng))檢測(cè)，能解決解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻?析技術(shù)的不足之處，提高時(shí)間分辨熒光分析法的應(yīng)用和推廣。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，包括以下步驟： 1) 把特異性生物原料包被在磁珠上； 2) 用0-二酮類(lèi)稀土配合物作為熒光示蹤物，標(biāo)記到另一特異性生物原料上，備用； 3) 將1)所得包被特異性生物原料的磁珠與被測(cè)樣本反應(yīng)，清洗磁珠，加入2)所得被標(biāo) 記的另一特異性生物原料，反應(yīng)后，清洗磁珠； 4) 向反應(yīng)體系中加入熒光增強(qiáng)物，用時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)反應(yīng)體系中標(biāo)記物的熒光， 獲得被測(cè)樣本信息。
[0011] 本發(fā)明用于包被磁珠和標(biāo)記熒光示蹤物的生物原料為細(xì)胞、包涵體、蛋白質(zhì)（抗 原、半抗原、抗體等）、氨基酸、多肽、核苷酸、有機(jī)化合物及其它有特異反應(yīng)的任何體系。 整個(gè)特異生物反應(yīng)過(guò)程如下：首先把特異反應(yīng)體系的一株生物原料包被在磁珠上，將 包被生物原料的磁珠與被測(cè)樣本反應(yīng)，清洗后加入另一株已標(biāo)記0-二酮類(lèi)稀土配合物的 特異性生物原料，發(fā)生免疫反應(yīng)，使磁珠、被測(cè)樣本和熒光示蹤物形成復(fù)合物，清洗后再加 入熒光增強(qiáng)物，最后用時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)，獲得被測(cè)樣本的濃度等信息。
[0012] 將生物原料包被在磁珠上是指以下兩種包被方式:一種直接把生物原料通過(guò)化學(xué) 反應(yīng)，用化學(xué)鍵方式連接到磁珠上；另一種方式是磁珠表面先包被鏈親和素(親和素，抗生 物素單抗），特異反應(yīng)體系中的一株生物原料標(biāo)記生物素，最后通過(guò)生物素和鏈親和素(或 抗生物素單抗)反應(yīng)，把反應(yīng)體中的一株生物原料包被在磁珠上。
[0013] 將0-二酮類(lèi)稀土配合物作為熒光示蹤物標(biāo)記在另一株生物原料方式有兩種；一 種是直接把熒光材料通過(guò)化學(xué)鍵與生物原料連接起來(lái)，另一種方式是，把熒光材料通過(guò)化 學(xué)鍵與鏈親和素(或親和素)連接起來(lái)，在生物原料標(biāo)記生物素，最后熒光材料通過(guò)生物素 與鍵親和素反應(yīng)，把生物材料連接起來(lái)。
[0014] 本發(fā)明所述的e-二酮類(lèi)稀土配合物為Eu3+與0-二酮類(lèi)化合物的配合物。
[0015] 優(yōu)選地，所述的0-二酮類(lèi)化合物為四齒0-二酮類(lèi)化合物。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的四齒0-二酮類(lèi)化合物為4,4'_雙（l'，r，r，2'，2'，3'，3'-七氣_4'，6'-己二酬基)氣橫基-鄰-二聯(lián)苯(BHHCT)、1，10-雙-(8'-氣橫基噻吩基_4，4_5， 5，-6,6-7,7_ 全氟 _1，3,8，10)_ 葵四酮(BCT0T)或者 1，10_ 雙 _(8'_ 氯磺基二聯(lián)苯基 _4,4，_5， 5，-6，6-7，7-全氟-1，3，8，10)-葵四酮(BCD0T)。以上四齒-二酮類(lèi)化合物具有能夠連接蛋 白的基團(tuán)。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)0 -二酮類(lèi)化合物為四齒0-二酮類(lèi)化合物時(shí)，熒光增強(qiáng)物為三 正辛基氧膦(T0P0)、鄰菲羅啉(phen)和表面活性劑。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的表面活性劑為T(mén)riton x 100、Tween 20或者Tween 40〇 [0019]進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟4)中的熒光增強(qiáng)體系為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基 氧勝5-10111〇1凡、鄰菲羅啉5-101]1〇1凡、1'1'；[1:011叉 100 0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)）411為7.5。
[0020] 優(yōu)選地，所述的0-二酮類(lèi)化合物為二齒二酮類(lèi)化合物。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的二齒二酮類(lèi)化合物為4,7_雙氯磺酸基苯基-1，10-菲咯 啉 _2,9_二羧酸(80?0八）。
[0022]進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)0-二酮類(lèi)化合物為二齒二酮類(lèi)化合物時(shí)，步驟4)中的熒光增 強(qiáng)物為含釔的熒光增加體系；所述的熒光增強(qiáng)體系為25mM的磷酸緩沖液，其中含釔Y3+ 5-10mol/L、三正辛基氧膦5-10mol/L、噻吩甲酰三氟丙酮5-10mol/L、Triton x 100 0.15%(質(zhì) 量分?jǐn)?shù)），pH為7.0~8.0。
[0023]本發(fā)明檢測(cè)方法反應(yīng)體系的反應(yīng)場(chǎng)所是在反應(yīng)杯中，它可以是酶標(biāo)板或管式反應(yīng) 器內(nèi)，反應(yīng)過(guò)程在一定溫、濕度條件下（18°〇30°(：范圍內(nèi)），搖動(dòng)、振蕩或旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)下進(jìn)行。 [0024]本發(fā)明的有益效果在于： 1、本發(fā)明的反應(yīng)體系從加樣、反應(yīng)、清洗到報(bào)告檢測(cè)結(jié)果全過(guò)程可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，也適用 于半自動(dòng)時(shí)間分辨熒光檢測(cè)系統(tǒng)。它可以應(yīng)用于檢測(cè)生物活性物質(zhì)和生物樣品免疫分析， 如內(nèi)分泌激素的檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)、抗體檢測(cè)、病毒抗原分析、藥物代謝分析以及各 種體內(nèi)或外源性超微量物質(zhì)的分析，也可以用于核酸探針?lè)治龊图?xì)胞活性分析、生物大分 子分析。
[0025] 2、目前的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)均采用解離增強(qiáng)方式，由于解離增強(qiáng)體系中增強(qiáng)液會(huì) 使磁珠團(tuán)聚，從而影響磁微珠的單分散性，因此，無(wú)法實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的自動(dòng)化和半 自動(dòng)化。本發(fā)明首次將磁珠包被生物原料技術(shù)用于時(shí)間分辨熒光檢測(cè)，無(wú)需解離增強(qiáng)關(guān)系， 沒(méi)有磁珠團(tuán)聚現(xiàn)象。填補(bǔ)了時(shí)間分辨在全自動(dòng)化系統(tǒng)檢測(cè)的空白。
[0026] 3、現(xiàn)有的的四齒0-二酮類(lèi)化合物和二齒二酮類(lèi)化合物作為熒光示蹤物，在使 用過(guò)程中由于熒光發(fā)光效率不高，很少被使用。本發(fā)明采用的熒光增強(qiáng)體系解決了發(fā)光效 率不高的問(wèn)題，且無(wú)需解離增強(qiáng)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了時(shí)間分辨的全自化。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為實(shí)施例6中促甲狀腺激素的工作曲線(xiàn)。
[0028] 圖2為實(shí)施例7中促甲狀腺激素的工作曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0030] 實(shí)施例1 一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 把特異性生物原料包被在磁珠上； 2) 用0-二酮類(lèi)稀土配合物作為熒光示蹤物，標(biāo)記到另一特異性生物原料上，備用； 3) 將1)所得包被特異性生物原料的磁珠與被測(cè)樣本反應(yīng)，清洗磁珠，加入2)所得被標(biāo) 記的另一特異性生物原料，反應(yīng)后，清洗磁珠； 4) 向反應(yīng)體系中加入熒光增強(qiáng)物，用時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)反應(yīng)體系中標(biāo)記物的熒光， 獲得被測(cè)樣本信息。
[0031] 實(shí)施例2 本實(shí)施例在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上： 所述的0-二酮類(lèi)化合物為4,4'_雙（1'，1'，1'，2'，2'，3'，3'_七氟-4'，6'_己二酮基） 氯磺基-鄰-三聯(lián)苯(BHHCT)。
[0032]步驟4)中的熒光增強(qiáng)物為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦5mol/L、鄰菲 羅啉5111〇1/1、1^^〇11叉 40 0.15%，？11為7.5。
[0033] 實(shí)施例3 本實(shí)施例在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上： 所述的0-二酮類(lèi)化合物為1，10-雙_(8 ' -氯磺基噻吩基-4，4-5，5，-6，6-7，7-全氟-1， 3,8，10)_ 葵四酮(BCT0T)。
[0034]步驟4)中的熒光增強(qiáng)物為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦10m〇l/L、鄰菲 羅啉10111〇1/1、1^^〇11叉 100 0.15%，？11為7.5。
[0035] 實(shí)施例4 本實(shí)施例在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上： 所述的0-二酮類(lèi)化合物為1，10-雙_(8 ' -氯磺基二聯(lián)苯基-4，4，-5，5，-6，6-7，7-全氟-1，3,8，10)_ 葵四酮(BCD0T)。
[0036]步驟4)中的熒光增強(qiáng)物為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦6mol/L、鄰菲 羅啉6111〇1/1、1^^〇11叉 20 0.15%，？11為7.5。
[0037] 實(shí)施例5 本實(shí)施例在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上： 所述的0-二酮類(lèi)化合物為4，7-雙氯磺酸基苯基-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸。
[0038]步驟4)中的熒光增強(qiáng)物為25mM的磷酸緩沖液，其中含釔Y3+ 5-10m〇l/L、三正辛基 氧膦5-10mol/L、噻吩甲酰三氟丙酮5-10mol/L、Triton x 100 0.15%，pH為7.5。
[0039] 實(shí)施例6 采用四齒二酮類(lèi)化合物，用增強(qiáng)熒光反應(yīng)體系檢測(cè)促甲狀腺素 具體工藝方法如下： 1. 1、把抗人TSH的亞單元單克隆抗體包被磁珠上。
[0040] 把lmg的抗人TSH 亞單元單克隆抗體(購(gòu)于Mitsubishi chem. Co.)用pH8.0的 0.05M硼酸緩沖溶液，2~8 °C透析四次，最后取出體積不超過(guò)lml。
[0041]把10ml的粒徑2微米（固含量2%)表面帶羧基的磁微粒用磁鐵吸在某一位置，吸出 上清液，取5毫升25mM MES緩沖液(pH7.4)溶解，再加入混合均勻后加入5毫克NHS(N-羥基琥 珀酰亞胺)活化劑和2~5毫克EDC(碳二亞胺)活化劑，并充分?jǐn)嚢?0分鐘；把活化后的磁珠 用磁鐵吸住，把上清液吸走，然后加入2毫升硼酸緩沖液(pH8.2)。
[0042]把透析好的抗人TSH的亞單元單克隆抗體放入活化的磁珠，低溫振蕩反應(yīng)24小 時(shí)后，用磁鐵吸住，把上清液吸出，再注入10微升1%BSA封閉液，室溫下振蕩封閉12小時(shí)后， 磁鐵吸住，把上清液吸出，最后把稀釋液加入，2~8 °C低溫貯存 1.2、把四齒0-二酮類(lèi)化合物(BHHCT)和Eu3+的螯合物標(biāo)記在抗人-TSH的a-亞單元單 克隆抗體 BHHCT-Eu3+的結(jié)構(gòu)式如下：
首先把lmg抗人-TSHa-亞單元單克隆抗體(購(gòu)于Mitsubishi chem. Co.)用pH9.2的 0.05M碳酸緩沖溶液，2~8°C透析四次。加入0.2~0.5mg的BHHCT-Eu3+低溫反應(yīng)1~4小時(shí)。
[0043] 用Sephadex G-50柱層析分離標(biāo)記了BHHCT-Eu3+的單抗和沒(méi)在標(biāo)記的單抗，用蛋白 儀區(qū)分不同分子量的蛋白，同時(shí)檢定標(biāo)記到單抗的BHHCT-Eu 3+的比例。
[0044] 1.3、配制熒光增強(qiáng)液 配制10-5mol的三正辛基氧膦(T0P0)、0.05%的表面活性劑Triton X-100、0.025M磷酸 緩沖液(PH7.5)配制熒光增強(qiáng)液。
[0045] 1.4、促甲狀腺素試劑盒的制備 配制TSH標(biāo)準(zhǔn)品：配制TSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體濃度分別是0、0.09、0.84、4.4、22.5、115 mlU/ L〇
[0046] 把1.1制備的抗人TSH 亞單元單克隆抗體標(biāo)記的磁珠和1.2標(biāo)記BHHCT-Eu3+的抗 人-TSH的a-亞單元單克隆抗體分濃度調(diào)試，確定最合適的配比，然后與TSH標(biāo)準(zhǔn)品組合在一 起，反應(yīng)過(guò)程如下，取一定量的1.1制備的抗人TSH 亞單元單克隆抗體標(biāo)記的磁珠放入管 式反應(yīng)器中加入標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)反應(yīng)1小時(shí)后，用電磁場(chǎng)分離磁珠，上清液取走，清 洗，再加入1.2標(biāo)記BHHCT-Eu 3+的抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體，旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)反應(yīng)1小時(shí)后， 用電磁場(chǎng)分離磁珠，上清液取走，清洗，加入1.3制備的熒光增強(qiáng)液，旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)振蕩5分鐘檢 測(cè)。依次把剩下的五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)，檢測(cè)，測(cè)定條件為:激發(fā)波長(zhǎng)340nm;接收波長(zhǎng)615nm; 遲延時(shí)間0.2ms;窗口時(shí)間0.4ms;循環(huán)時(shí)間1.0ms。結(jié)果如下：促甲狀腺素的工作曲線(xiàn)見(jiàn) 圖1，該工作曲線(xiàn)具有較好的線(xiàn)性，結(jié)合表1數(shù)值和圖1可知，該檢測(cè)方法具有較好的靈敏度， 且實(shí)現(xiàn)了熒光檢測(cè)的自動(dòng)化。
[0047] 表1時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)法測(cè)定促甲狀腺素
實(shí)施例7 采用二齒二酮類(lèi)化合物，增強(qiáng)熒光反應(yīng)體系檢測(cè)促甲狀腺素 具體工藝方法如下： 2.1、把抗人TSH的亞單元單克隆抗體包被磁珠上(按1.1操作）。
[0048] 2.2、把二齒0-二酮類(lèi)化合物(8〇?〇44113+)標(biāo)記鏈親和素上 BCPDA-Eu 3+的結(jié)構(gòu)式如下：
首先把lmg鏈親和素用pH9.2的0.05M碳酸緩沖溶液，2~8°C透析四次。加入0.2~0.5mg 的二齒二酮類(lèi)Eu3+螯合物(BCPDA-Eu3+)低溫反應(yīng)1~4小時(shí)。
[0049] 用Sephadex G-50柱層析分離標(biāo)記了BCPDA-Eu3+的單抗和沒(méi)在標(biāo)記的單抗，用蛋白 儀區(qū)分不同分子量的蛋白，同時(shí)檢定標(biāo)記到單抗的BCPDA-Eu 3+的比例。
[0050] 2.3、把長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記在抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體 首先把11^的抗人4511的€ [-亞單元單克隆抗體在4-8°(：0.謂的？85溶液(？11約8.3，含 0.9%NaCl，不含NaN3)透析四次，取樣抗體濃度不低于0.5 mg/ml。
[00511用N，N-二甲基甲酰胺溶解活化的長(zhǎng)臂生物素（Sigma)成10mg/ml;該溶液在使用前 半小時(shí)內(nèi)配制，取一定量的生物素溶液(使生物素與抗體的質(zhì)量比為1:2)，在磁攪拌下逐滴 加入抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體溶液中，攪拌反應(yīng)5min后于4~8°C靜置60min。
[0052] 將反應(yīng)混合溶液對(duì)4~8°C 0.1M的PBS(PH約7.4，含0.9%NaCl，含有NaN3)透析6 次，取出生物素標(biāo)記抗體，加入BSA(進(jìn)口）使BSA含量為0.1%(W/W)，于2-8 °C或-20 °C保存。 [0053] 2.4、配制共熒光增強(qiáng)液 配制HT5摩爾濃度的三正辛基氧膦(T0P0)、1(T5摩爾濃度的二酮類(lèi)化合物如萘甲 酰三氟丙酮(P-NTA)(或噻吩甲酰三氟丙酮（TTA))、表面活性劑Triton X-100(或Tween 20)、10%的乙醇和25mM磷酸(pH7.2)緩沖液、10_5摩爾濃度釔(Y)離子組成。
[0054] 2.5、促甲狀腺素試劑盒的制備 配制TSH標(biāo)準(zhǔn)品：配制TSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體濃度分別是0、0.09、0.84、4.4、22.5、115 mlU/ L〇
[0055] 把2.1制備的抗人TSH 亞單元單克隆抗體標(biāo)記的磁珠、2.2標(biāo)記BCPDA-Eu3+的鏈 親和素和2.3標(biāo)記長(zhǎng)臂生物素的抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體分濃度調(diào)試，確定最合適 的配比，然后與TSH標(biāo)準(zhǔn)品組合在一起，反應(yīng)過(guò)程如下，取一定量的2.1制備的抗人TSH的0-亞單元單克隆抗體標(biāo)記的磁珠放入管式反應(yīng)器中加入標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)反應(yīng)1小時(shí)后， 用電磁場(chǎng)分離磁珠，上清液取走，清洗，再加入2.3標(biāo)記長(zhǎng)臂生物素的抗人-TSH的a-亞單元 單克隆抗體，旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)反應(yīng)1小時(shí)后，用電磁場(chǎng)分離磁珠，上清液取走，清洗，加入2.2標(biāo)記 BCPDA-Eu 3+的鏈親和素反應(yīng)10分鐘，用電磁場(chǎng)分離磁珠，上清液取走，清洗，最后加入2.4制 備的共熒光增強(qiáng)液，旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)振蕩5分鐘檢測(cè)。依次把剩下的五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)，檢測(cè)，測(cè)定條 件為：激發(fā)波長(zhǎng)340nm;接收波長(zhǎng)615nm;遲延時(shí)間0.2ms;窗口時(shí)間0.4ms;循環(huán)時(shí)間 1.0ms。結(jié)果如下:促甲狀腺素的工作曲線(xiàn)見(jiàn)圖2,該工作曲線(xiàn)具有較好的線(xiàn)性，結(jié)合表2數(shù)值 和圖2可知，該檢測(cè)方法具有較好的靈敏度，且實(shí)現(xiàn)了熒光檢測(cè)的自動(dòng)化。
[0056]表2時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)法測(cè)定促甲狀腺素
本發(fā)明的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了熒光檢測(cè)的自動(dòng)化，該自動(dòng)化檢測(cè)方法如下： 待檢測(cè)樣本溶液中含包被了時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物的磁微球，將待檢測(cè)樣本溶液分成等 量的若干份，分批次匯聚磁微球并進(jìn)行熒光標(biāo)記物時(shí)間分辨熒光的檢測(cè)，得到多次檢測(cè)的 統(tǒng)計(jì)結(jié)果，從而完成對(duì)整個(gè)樣本溶液中熒光標(biāo)記物的含量檢測(cè)；單次時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的 步驟如下： 1) 在兩端開(kāi)口的石英管中持續(xù)通入樣本溶液，同時(shí)啟動(dòng)激發(fā)光光源，石英管的一側(cè)設(shè) 置電磁鐵，在電磁鐵的磁場(chǎng)作用下，使流動(dòng)溶液中的磁微球駐留在電磁鐵的前端，隨著液體 的流動(dòng)，石英管內(nèi)的磁微球匯集數(shù)量不斷增加，形成匯集點(diǎn)； 2) 停止通入樣本溶液，光線(xiàn)通過(guò)激發(fā)光路聚焦在匯集點(diǎn)的磁微球上，經(jīng)至少10微秒后 關(guān)閉激發(fā)光光源;再經(jīng)10-2000微秒的設(shè)定時(shí)間后，收集磁微球結(jié)合的焚光標(biāo)記物的時(shí)間分 辨熒光信號(hào)，并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物的含量檢測(cè)。
[0057]磁微球的自動(dòng)化檢測(cè)具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、通過(guò)電磁鐵將磁微球聚集在檢測(cè)區(qū)域，使磁微球在檢測(cè)區(qū)域的濃度提高了成千倍， 熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度則可提高上萬(wàn)倍，而溶液中的雜質(zhì)所產(chǎn)生的背景干擾信號(hào)不會(huì)被增 強(qiáng)，有效消減由于清洗不徹底對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的干擾。
[0058] 2、常規(guī)反應(yīng)試驗(yàn)清洗的目的是減少雜質(zhì)，提高熒光標(biāo)記物與背景信號(hào)占比；自動(dòng) 化檢測(cè)通過(guò)提高磁微球密度，提高熒光標(biāo)記物與背景信號(hào)占比，來(lái)提高實(shí)驗(yàn)精度，特別適用 于免清洗的反應(yīng)體系檢測(cè)熒光標(biāo)記物含量。
[0059] 3、將反應(yīng)池的液體樣本分成若干份，分別依次進(jìn)行熒光標(biāo)記物檢測(cè)，用多次的檢 測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)值，代替對(duì)反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物進(jìn)行一次檢測(cè)的常規(guī)方法，提高了反應(yīng)池的 檢測(cè)準(zhǔn)確性，減少系統(tǒng)檢測(cè)波動(dòng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 把特異性生物原料包被在磁珠上； 2) 用β-二酮類(lèi)稀土配合物作為熒光示蹤物，標(biāo)記到另一特異性生物原料上，備用； 3) 將1)所得包被特異性生物原料的磁珠與被測(cè)樣本反應(yīng)，清洗磁珠，加入2)所得被標(biāo) 記的另一特異性生物原料，反應(yīng)后，清洗磁珠； 4) 向反應(yīng)體系中加入熒光增強(qiáng)物，用時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)反應(yīng)體系中標(biāo)記物的熒光， 獲得被測(cè)樣本信息。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:所述的β-二酮類(lèi) 稀土配合物為Eu3+與β-二酮類(lèi)化合物的配合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:所述的β-二酮類(lèi) 化合物為四齒β-二酮類(lèi)化合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:所述的四齒β-二 酬類(lèi)化合物為4，4'-雙（1 '，1'，1'，2'，2'，3'，3'h氣_4'，6'-己二酬基)氣橫基-鄰-二聯(lián) 苯、I，10-雙-(8 ' -氯磺基噻吩基-4，4-5，5，-6，6-7，7-全氟-1，3，8，10)-葵四酮或者1，10_ 雙 _(8 ' -氣橫基二聯(lián)苯基 _4，4，_5，5，_6，6-7，7_全氣-1，3，8，10)-奏四酬。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:步驟4)中的熒光增 強(qiáng)物為含三正辛基氧膦、鄰菲羅啉和表面活性劑的熒光增強(qiáng)體系。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:所述的表面活性劑 為T(mén)riton X IOCKTween 20或者Tween 40〇7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:所述的熒光增強(qiáng)體 系為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦5-10mol/L、鄰菲羅啉5-10mol/L、Triton X 100 0·15%，ρΗ為7.0~8.0。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:所述的β-二酮類(lèi) 化合物為二齒二酮類(lèi)化合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于:所述的二齒β-二酮 類(lèi)化合物為4，7-雙氯磺酸基苯基-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于：步驟4)中的熒光 增強(qiáng)物為含釔的熒光增加體系；所述的熒光增強(qiáng)體系為25mM的磷酸緩沖液，其中含釔Y 3+ 10-5mol/L、三正辛基氧膦5-10mol/L、i3-噻吩甲酰三氟丙酮(或β-萘甲酰三氟丙酮）10- 5mol/ UTriton X 100(或Tween 20、Tween 40)0.15%，2~20%的乙醇，25禮的磷酸緩沖液。!1為7.0 ~8 · 0〇
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK105911041SQ201610379774
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】吳俊清, 章健, 吳冠英
【申請(qǐng)人】章健, 吳俊清, 吳冠英