抗肝纖維化青霉呋喃酮a化合物及其藥物組合物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及具有抗肝纖維化活性的呋喃酮聚酮類 活性化合物PenicilfuranoneA及其制備方法，以該化合物為活性成分的藥物組合物，以及 其在制備治療肝纖維化疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 呋喃酮類聚酮類化合物是一類有真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，目前見報道于真菌 Aspergillusrugulosus,Cephalosporiumgregatum,以及Penicilliumdaleae的次生代 謝產(chǎn)物中。迄今為止，文獻報道的呋喃聚酮類化合物不足20個化合物，且其分子量皆為300 左右。前人研究表明該類化合物具有抗菌，致植物枯萎，抑制哺乳動物Y族DNA酶等作用。 本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎，分子量為486,與之前報道的該類化合物，結(jié)構(gòu)完全不一樣。迄今為 止，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見有本發(fā)明的結(jié)構(gòu)新穎的呋喃酮聚酮類化合物被報道，同時也未見任 何文獻報道該類呋喃酮類化合物具有抗肝纖維化活性的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明目的在于提供從內(nèi)生真菌Penicilliumdaleae中分離得到的咲喃聚酮類 化合物A，其制備方法，在藥物中特別是在抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0004] 為了實現(xiàn)本明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0005] 下述結(jié)構(gòu)式（I)所示的青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，
[0006]
[0007] 藥物組合物，其包含所述的青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和至少一 種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。
[0008] 根據(jù)所述的青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述的藥學(xué)上可接 受的鹽為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、 乙二酸鹽。
[0009] 本發(fā)明同時提供了青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，取青 霉咲喃酮APenici11iumdaleae發(fā)酵物，用有機溶劑提取，濃縮得浸膏，分別用乙酸乙酯萃 取，硅膠層析柱，制備型高效液相色譜等方法得結(jié)構(gòu)式（I)化合物。
[0010] 更具體的制備方法如下：取Penicilliumdaleae菌絲體接種于滅菌馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)液中PDA，于室溫下以170轉(zhuǎn)每分鐘在搖床中震蕩五天，做成種子液，將種子液轉(zhuǎn)接 到滅菌的大米培養(yǎng)基中，28°C條件下無菌培養(yǎng)40天，用乙酸乙酯提取利用大米培養(yǎng)基培養(yǎng) 40天后的菌絲體，共提取四次，得到乙酸乙酯提取物，利用硅膠柱色譜，高效液相色譜質(zhì)譜 聯(lián)用，制備型高效液相色譜處理乙酸乙酯提取物，最后得到青霉呋喃酮A，其制備液相色譜 條件為：12mL/min，UVX_ 230nm，MeCN-H20 45:55,保留時間 15.0min。
[0011] 上述制備方法中，青霉咲喃酮A化合物可進一步與適當?shù)乃岢甥}，適當?shù)乃徇x自 鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、酒石酸、檸檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸或其他適合的有機酸或 無機酸。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述的青霉呋喃酮A化合物或藥物組合物在制備抗肝纖維化的 藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的藥物組合物，能作為適宜口服或注射給藥的制劑形式。
[0014] 其中所述的口服給藥的制劑形式為片劑、緩釋片、控釋片、錠劑、硬或軟膠囊、滴 丸、微丸、水性或油混懸劑、乳劑、可分散的散劑或顆粒劑、口服溶液、糖漿劑或酏劑，所述的 注射給藥的制劑形式為滅菌的水性或油性溶液、無菌粉末、脂質(zhì)體、乳劑、微乳劑、納米乳劑 或微囊。
[0015] 本發(fā)明化合物青霉呋喃酮A結(jié)構(gòu)新穎，分子量為486,與之前報道的該類化合物結(jié) 構(gòu)完全不一樣，且具有明顯的抗肝纖維化活性，其機制與阻斷TGF-β1刺激肝星狀細胞的 過度激活和細胞外基質(zhì)的形成能力有關(guān)，在低于32μΜ的濃度下，PenicilfuranoneA未見 明顯的肝細胞毒性。
【附圖說明】：
[0016] 圖1為本發(fā)明PenicilfuranoneA的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0017] 圖2為本發(fā)明PenicilfuranoneA的X-單晶衍射結(jié)構(gòu)示意圖；
[0018] 圖3為本發(fā)明PenicilfuranoneA對正常人肝臟細胞生長活力的影響（MTT法；處 理 48h);
[0019] 圖4為本發(fā)明PenicilfuranoneA抑制TGF-β1誘導(dǎo)下，肝星狀細胞纖維化形成相 關(guān)蛋白的表達（westernblot法；A為大鼠T6肝星狀細胞株，B為人LX-2肝星狀細胞株）。
【具體實施方式】：
[0020] 下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以 此來限定本發(fā)明。
[0021] 實施例1 :
[0022] 化合物PenicilfuranoneA的制備：
[0023] 分離流程：取少量Penicilliumdaleae菌絲體接種于1000ml滅菌馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)液中（PDA)，于室溫下以170轉(zhuǎn)每分鐘在搖床中震蕩五天，做成種子液。將種子 液轉(zhuǎn)接到2. 0公斤滅菌的大米培養(yǎng)基中，25度條件下，無菌培養(yǎng)35天。用乙酸乙酯5L提取利用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)35天后的菌絲體，共提取五次，每次5L，得到乙酸乙酯提取物 18g。利用硅膠柱色譜，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，制備型高效液相色譜處理18g的乙酸乙 酯提取物，最后得到PenicilfuranoneA12mg，其制備液相色譜條件為：12mL/min，UVAmax 230nm，MeCN-H2045:55,保留時間 15.Omin。
[0024] 實施例2 :
[0025]PenicilfuranoneA結(jié)構(gòu)解析：
[0026]化合物PenicilfuranoneA，金色針狀晶體，[a]22D- 6(c0·2,MeOH)iSI-MS譜給 出準分子離子峰為m/z509[M+Na]+，結(jié)合高分辨正離子HR-ESI-MS(m/z[M+Na]+509. 1792， 計算值為C26H3Q09Na，509. 1782)和13CNMR、DEPT譜提供的信息，確定其分子式為C26H3Q09,不 飽和度為12。UV光譜在196 (4. 5)，222 (4. 6)，359 (4. 0)，495 (2. 6)nm處有吸收，說明分子中 存在大共輒基團。分析4和13CNMR譜（表1)，再結(jié)合HSQC，HMBC，4-?C0SY，以及R0ESY 譜表明得到化合物PenicilfuranoneA的結(jié)構(gòu)。最后，通過X-單晶衍射分析進一步證實了 以上分析，并確定了其立體構(gòu)型（圖2)。PenicilfuranoneA的X-單晶衍射數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳 到應(yīng)該劍橋大學(xué)單晶數(shù)據(jù)庫www.cede,cam,ac.uk,其登記號為:CO)C1042018。
[0027]表 1.PenicilfuranoneA的NMR波譜數(shù)據(jù)（δinppm,JinHz)
[0028]
[0029] 11試于600MHz儀器，溶劑為DMS〇-d6.b測試于600MHz儀器，溶劑為acetone-d6.
[0030] 實施例3 :
[0031]PenicilfuranoneA對正常人肝細胞的毒性檢測：
[0032] 正常人肝臟細胞（L-02細胞株）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源 中心；RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；二甲基亞砜 (DMSO)和噻唑藍（MTT)為sigma公司產(chǎn)品；全自動酶標儀（美國，Thermo公司）；恒溫C02 培養(yǎng)箱（美國，Thermo公司）；正常人肝細胞L-02細胞株用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%滅 活胎牛血清，100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素）于37°C、飽和空氣濕度、含5% 0)2的 培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。取指數(shù)生長期L-02細胞株，1000Xg離心5min，棄去上清液，用相 應(yīng)的培養(yǎng)基打勻，制成細胞懸液，計數(shù)后稀釋成濃度為3X104個細胞/mL的細胞懸液，接種 于96孔板，每孔200μL，置于細胞培養(yǎng)箱24h后給藥，分別設(shè)置細胞對照組和11個濃度的 PenicilfuranoneA樣品組（0· 125、0· 25、0· 5、1、2、4、8、16、32、64、128μΜ)，每個濃度設(shè)置 3個復(fù)孔，加藥后將96孔板分別培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱中48h后，每孔加20uLΜΤΤ溶液（用PBS 將MTT粉末配成5mg/mL的儲存液），在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后離心棄去上清液，每孔 加入100uLDMS0,輕微振蕩使紫色晶體完全溶解，用酶標儀于570nm處測定每孔吸光度（0D 值），計算3個復(fù)孔0D值平均值，并計算細胞存活率：細胞存活率（％) =(給藥組細胞0D 均值一背景0D均值V(對照組細胞0D均值一背景0D均值）X100%。
[0033] 肝細胞損傷往往被認為是發(fā)生肝臟纖維化的誘發(fā)因子，因此，藥物可以通過保護 肝細胞的方式來