一種禽流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的制備方法及其產(chǎn)品和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種禽流感標(biāo)記疫苗的制備方法及其產(chǎn)品和用途，特別涉及一種通過(guò) MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)禽流感病毒、以及采用新的濃縮純化方法制備禽流感標(biāo)記疫苗的方法， 還涉及標(biāo)記疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢定。本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 疫苗接種是特異性預(yù)防禽流感病毒（AIV)的有效手段，制備安全有效的疫苗是成 功地預(yù)防、控制乃至最終消滅AIV的先決條件。疫苗使用的效果取決于快速大量疫苗的生 產(chǎn)和供給，最近幾年的流感流行和新的流感病毒爆發(fā)流行提示及時(shí)的疫苗接種是控制、預(yù) 防流感的最重要措施。但是各地流行的高致病性禽流感亞型不同，疫苗株和流行株的抗原 性不匹配或匹配程度低，給疫苗的開(kāi)發(fā)和研制帶來(lái)的極大挑戰(zhàn)。目前國(guó)內(nèi)雞胚禽流感疫苗 存在的問(wèn)題，主要為：
[0003] 1)疫苗誘導(dǎo)抗體妨礙識(shí)別感染和免疫禽類；
[0004] 2)疫苗預(yù)防禽流感發(fā)病而不能預(yù)防陰性感染；
[0005] 3)免疫產(chǎn)生的壓力促使禽流感病毒抗原突變逃逸免疫；
[0006] 4)免疫保護(hù)產(chǎn)生的時(shí)間晚，免疫保護(hù)期短；
[0007] 5)母嬰抗體對(duì)新生禽類免疫的干擾；
[0008] 6)疫苗對(duì)各種禽類的免疫效果不是很清楚；
[0009] 7)疫苗的質(zhì)量：安全性、免疫原性、有效性、穩(wěn)定性有待提高。
[0010] 用雞胚生產(chǎn)禽流感疫苗，雞胚供應(yīng)和生產(chǎn)周期長(zhǎng)，難以應(yīng)對(duì)新發(fā)禽流感的防控；傳 統(tǒng)的獸用流感疫苗由于采用雞胚規(guī)?；a(chǎn)，疫苗盡管安全但容易引起嚴(yán)重的應(yīng)急反應(yīng)， 需要對(duì)工藝進(jìn)行改造、驗(yàn)證。
[0011] 禽流感病毒滅活疫苗具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制禽流感的過(guò)程中發(fā)揮著 重要作用，但在疫苗制備過(guò)程中和產(chǎn)品中的一些宿主細(xì)胞蛋白殘余、核酸、牛血清白蛋白、 化學(xué)試劑等如果不加以控制，則會(huì)引起免疫動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重副反應(yīng)甚至死亡，特別是可能使 動(dòng)物致癌或影響肉類動(dòng)物的食品安全。
[0012] 用宿主細(xì)胞MDCK培養(yǎng)病毒制備疫苗抗原或重組藥物，從用藥安全性考慮，必須 純化抗原去除影響禽流感病毒疫苗安全性的雜質(zhì)，以使其符合藥品質(zhì)量規(guī)范和安全要求， 同時(shí)盡量減少工藝或原輔材料中可能潛在的影響疫苗效果和安全的物質(zhì)，特別是要盡量避 免使用動(dòng)物源性的原輔材料，以降低傳播動(dòng)物疫病如流感、犬瘟熱、瘋牛病、狂犬病等傳染 病風(fēng)險(xiǎn)。
[0013] 用生物反應(yīng)器生產(chǎn)禽流感病毒抗原，提高了細(xì)胞密度、病毒抗原產(chǎn)量，同時(shí)增加了 細(xì)胞雜質(zhì)和添加物的量，也增加分離、濃縮、純化禽流感病毒的工藝步驟。過(guò)去因?yàn)榍萘鞲?病毒疫苗抗原庫(kù)主要以雞胚作為抗原生產(chǎn)基質(zhì)，疫苗多為粗制疫苗。純化技術(shù)特別是現(xiàn)代 規(guī)?；瘽饪s、純化病毒抗原技術(shù)，如柱層析、蔗糖梯度超速離心技術(shù)、切向流中空纖維柱、深 層過(guò)濾模塊幾乎沒(méi)有在獸用疫苗生產(chǎn)中使用。這些技術(shù)和設(shè)備的應(yīng)用易于疫苗質(zhì)量控制和 保證，也易于GMP認(rèn)證和工藝驗(yàn)證。
[0014] 現(xiàn)行生產(chǎn)滅活禽流感病毒抗原采用MDCK細(xì)胞為疫苗抗原生產(chǎn)基質(zhì)，MDCK細(xì)胞懸 浮培養(yǎng)后繼滅活、濃縮工藝達(dá)到部分純化，后經(jīng)乳化制成疫苗供使用。盡管該疫苗的免疫效 果達(dá)到疫苗規(guī)程要求，但按現(xiàn)代疫苗的安全性要求，雜質(zhì)含量高、總蛋白含量高，有效完整 病毒顆粒含量低，對(duì)有效抗原量、MDCK細(xì)胞DNA殘余、MDCK細(xì)胞蛋白殘余、牛血清白蛋白、滅 活劑、防腐劑以及生產(chǎn)過(guò)程化學(xué)添加物沒(méi)有明確界定和定量。疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝應(yīng)不 斷提高，以保證疫苗穩(wěn)定、安全、有效。
[0015] 純化禽流感疫苗配方中禽流感M2蛋白含量甚微，且在各型流感病毒中高度保守， 含高度純化滅活完整禽流感病毒顆粒的疫苗，不引起動(dòng)物產(chǎn)生抗M2抗體，而自然感染或隱 形感染禽流感動(dòng)物產(chǎn)生M2蛋白抗體，因此通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的M2非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體存在 與否，可區(qū)別動(dòng)物禽流感疫苗免疫和自然感染，發(fā)揮禽流感防控的免疫和檢測(cè)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種大規(guī)模制備禽流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的方法及其 廣品和用途。
[0017] 本發(fā)明的一種禽流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步 驟：
[0018]a)病毒培養(yǎng)
[0019] 10000L生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到3-5X106個(gè)/ml，按照感 染復(fù)數(shù)Μ0Ι0. 01-0. 1接種禽流感病毒MDCK細(xì)胞適應(yīng)株，加入胰酶，使其終濃度達(dá)到50μg/ mL，攪拌速度不超過(guò)40rpm，4天收獲病毒液，用制備型低速連續(xù)流離心機(jī)離心除去細(xì)胞碎 片，同時(shí)收獲上清液和沉淀；沉淀在Triton-X-100存在的條件下裂解禽流感病毒感染細(xì)胞 和細(xì)胞膜碎片，所述Triton-X-100的終濃度為1-2% (v/v)，反復(fù)凍融3次后超聲3次，用 制備型低速連續(xù)流離心機(jī)離心收集上清液，合并上清液；
[0020] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒滴度為多107l〇gTCID5(]/mL，禽流感病毒血 凝素含量為彡30μg/ml，TritonX-100殘余量彡600μg/ml，抗生素殘余量為彡180μg/ ml；
[0021] b)膜深層過(guò)濾、微濾、超濾
[0022] 步驟a)得到的病毒上清液，依次經(jīng)過(guò)0. 65微米的膜深層過(guò)濾以及0. 45微米孔徑 的濾膜微濾后，經(jīng)膜孔截留值為750, 000-1000, 000MWC0的切向流超濾膜超濾，進(jìn)一步除去 完整的MDCK細(xì)胞和大分子物質(zhì)；
[0023] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒滴度為多107logTCID5Q/mL，禽流感病毒血 凝素含量為彡20yg/ml，內(nèi)毒素含量<40EU/ml，；
[0024] c)滅活；
[0025]甲醛滅活，滅活條件：2-8°C，時(shí)間7-10天；滅活澄清液經(jīng)膜孔截留值為 750, 000-1000, 000MWC0的切向流超濾膜超濾，進(jìn)一步除去小分子雜質(zhì)和縮小體積以便純 化；
[0026] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒血凝素含量為彡20μg/ml，Triton-X-100 殘余量< 50μg/ml，甲酸殘余量< 300μg/ml;內(nèi)毒素含量< 40EU/ml
[0027]d)親和層析以及在柱核酸酶解：
[0028] 包括：（1)采用硫酸纖維素或肝素作為親和層析介質(zhì)，將滅活后的禽流感病毒澄 清液吸附在介質(zhì)上，洗脫細(xì)胞DNA和細(xì)胞蛋白；（2)經(jīng)過(guò)步驟（1)操作后，用非特異的核酸 酶進(jìn)行在柱酶解；（3)經(jīng)步驟（2)操作后洗滌層析介質(zhì)，洗脫禽流感病毒；
[0029] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：體積為2000L，禽流感病毒血凝素含量多100μg/ml， MDCK細(xì)胞蛋白殘余量<50ng/ml，MDCK細(xì)胞殘余DNA量< 1000pg/ml，M2蛋白含量< 100ng/ ml，牛血清白蛋白殘余量< 100ng/ml，Triton-X-100殘余量< 50μg/ml;甲醛殘余量 < 50μg/ml，內(nèi)毒素含量< 30EU/ml;
[0030] e)疏水反應(yīng)層析
[0031] 步驟d)洗脫后的禽流感病毒液上樣于苯基瓊脂糖疏水層析柱，洗脫禽流感病毒， 得到純化后的禽流感病毒液；
[0032] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：體積為2000L，禽流感病毒血凝素含量多100μg/ml， MDCK細(xì)胞蛋白殘余量< 30ng/ml，MDCK細(xì)胞殘余DNA量< 500pg/ml，M2蛋白含量< 50ng/ ml，牛血清白蛋白殘余量< 50ng/ml，Triton-X-100殘余量< 50μg/ml;甲醛殘余量 < 50μg/ml，內(nèi)毒素含量< 30EU/ml;
[0033] f)透析、除菌過(guò)濾
[0034] 經(jīng)步驟d)純化后的禽流感病毒液稀釋為10000L，進(jìn)行透析，透析后的病毒液經(jīng) 0. 22μm膜除菌過(guò)濾；
[0035] 該步驟質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒血凝素含量多40yg/ml，內(nèi)毒素含量 < 10EU/ml，MDCK細(xì)胞蛋白殘余量< 10ng/ml，MDCK細(xì)胞DNA殘余量< 100pg/ml，甲醛殘余 量< 50μg/ml，TritonX-100殘余量< 5μg/ml，禽流感M2蛋白含量< 10ng/ml，牛血清白 蛋白殘余量< 20ng/ml;
[0036]g)乳化：采用適宜的水包油包水佐劑進(jìn)行乳化即得。
[0037] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟d)中用非特異的核酸酶在柱酶解包括按每毫升病毒液 加入1-100單位的量，將非特異性、高活性的核酸酶加入到層析介質(zhì)中，2-8°C作用9-18小 時(shí)。
[0038] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟e)中所述的透析采用的透析液中含有蔗糖6% (w/v)、 單鹽酸精氨酸1% (w/v)、一水谷氨酸鈉0.05% (w/v)、水解明膠0.5% (w/v)、無(wú)水磷酸氫 二鉀1%(￥八）以及磷酸氫二鉀0.25%(￥八）。
[0039] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟f)中所述的乳化采用的佐劑包括細(xì)胞因 子、油乳佐劑和合成佐劑，優(yōu)選為ISA25、QS-21、MF59以及鋁佐劑。
[0040] 如上，本發(fā)明提供了一種投入/產(chǎn)出效果明顯的，用于制備高效、高純度的完整禽 流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的方法。本發(fā)明與純化流感病毒方法以及質(zhì)量控制方法、質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)，特別是新的純化方法和質(zhì)量控制有關(guān)（圖1和圖2)。
[0041] 1、溶解宿主細(xì)胞
[0042] 由于禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中增殖，形成細(xì)胞病變裂解了細(xì)胞，部分病毒釋放， 部分病毒在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞碎片上，本發(fā)明采用連續(xù)低速離心機(jī)收集病毒上清，對(duì)沉淀進(jìn)行 超聲、凍融裂解后再進(jìn)行低速離心，合并2部分上清。有許多方法如凍融、高滲、超聲、裂解 劑裂解可溶解細(xì)胞、釋放禽流感病毒，但從規(guī)模化生產(chǎn)的方便和適用角度考慮，本發(fā)明采 取凍融、超聲、裂解劑溶解細(xì)胞，以提高禽流感病毒產(chǎn)量。
[0043] 2、裂解劑
[0044] 按照本發(fā)明，幾乎除培養(yǎng)工藝中沒(méi)有使用裂解劑，選取藥學(xué)、獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為安全的表 面活性劑TritonX-100作為裂解劑，濃度為1-2% (v/v)。
[0045] 3、核酸酶
[0046] 許多核酸酶可以在實(shí)驗(yàn)室使用，如Benzonase、Pulmozyme或其他DNA酶、核酸酶， 但從獸醫(yī)學(xué)、藥學(xué)安全角度考慮，本發(fā)明選用Benzonase，其可通過(guò)斷裂磷酸酯鍵而水解核 酸。使用濃度1-100單位/ml;
[0047] 4、深層過(guò)濾、微濾、超濾
[0048] 流感病毒收獲病毒液經(jīng)深層過(guò)濾（0. 65微米孔徑）去除碎片，再經(jīng)微濾（0. 45微 米孔徑），切向流超濾（750KD)除去完整的MDCK細(xì)胞和大分子物質(zhì)。滅活澄清液經(jīng)膜孔截 留值為750, 000-1000, 000MWC0的切向流超濾膜超濾后，進(jìn)入親和層析柱，進(jìn)一步除去MDCK 殘余蛋白和殘余DNA，經(jīng)親和層析病毒液通過(guò)超濾、除菌過(guò)濾、進(jìn)入下一工藝步驟。
[0049] 5、親和層析以及疏水反應(yīng)層析
[0050] 按照發(fā)明，單一的層析或連續(xù)流超速離心或蔗糖密度梯度離心已經(jīng)不能滿足禽流 感標(biāo)記疫苗的質(zhì)量要求和標(biāo)準(zhǔn)，研究表明，中去除效果，親和層析和疏水反應(yīng)層析更適合對(duì) 大量禽流感病毒液中雜質(zhì)DNA的處理。
[0051] 本發(fā)明在禽流感病毒純化采用了一種親和層析、在位核酸酶解、疏水反應(yīng)層析的 組合，除去了大量的核酸，并濃縮了病毒原液。由于分子篩層析載量極限為柱體積的20%， 且分離效果依賴蛋白濃度，限制了分子篩層析在禽流感疫苗工業(yè)化生產(chǎn)的使用。本發(fā)明的 優(yōu)點(diǎn)在于：（1)流速快30倍；（2)結(jié)合能力強(qiáng)；(3)收率高，（4)不需安裝和清潔驗(yàn)證；（5) 做成濾芯，沒(méi)有使用壽命和貯存安全的擔(dān)憂；
[0052] 6、超濾、濃縮、透析
[0053] 禽流感病毒培養(yǎng)液、原液、純化液至少需要透析，去除小分子雜質(zhì)和化學(xué)物 質(zhì)殘余，也需要控制可操作體積，發(fā)明中提供了透析和超濾濃縮的步驟，使禽流感病 毒達(dá)到部分純化和濃縮，發(fā)明中的超濾優(yōu)先采用切向流的中空纖維柱，膜孔截留值為 750, 000-1000, 000MWC0,具有對(duì)禽流感病毒剪切小、病毒破損少的優(yōu)點(diǎn)。
[0054] 用超濾透析和緩沖液交換除去生產(chǎn)過(guò)程中溶液中的糖、鹽、非液體溶劑、低分子物 質(zhì)，改變穩(wěn)定禽流感病毒的粒子和pH環(huán)境，本發(fā)明在收獲裂解后的工藝步驟中在純化步 驟轉(zhuǎn)接之前、疫苗配制之前都用超濾，調(diào)整緩沖液、調(diào)整體積，濃縮病毒液適合后續(xù)純化的 載量要求。
[0055] 7、高度純化
[0056] 細(xì)胞培養(yǎng)后流感病毒包括重組流感病毒去除雜質(zhì)的純化方法是經(jīng)過(guò)低速離心、凍 融超聲細(xì)胞沉淀、低速離心收的收獲病毒液合并病毒液，再經(jīng)深層過(guò)濾、超濾，親和層析、在 位核酸酶解、疏水反應(yīng)層析組合，連續(xù)流蔗糖密度梯度離心，增強(qiáng)了流感疫苗的安全性，擴(kuò) 展了疫苗的適用種群和范圍，特別是禽的特殊種群。
[0057] 首先，不含有害雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞MDCK蛋白、宿主細(xì)胞MDCK的DNA、不含動(dòng)物源性 的活性物質(zhì)，如酶或牛血清、工藝過(guò)程中的添加的化學(xué)物質(zhì)殘余。盡管目前暫未有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 的細(xì)胞流感疫苗，特別是禽流感細(xì)胞培養(yǎng)疫苗標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)程，但細(xì)胞性流感疫苗如MDCK細(xì)胞 流感疫苗制造過(guò)程必須說(shuō)明、驗(yàn)證安全。本發(fā)明的標(biāo)記疫苗工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明了其安全 性。用傳代的MDCK細(xì)胞制備流感