M硫酸銨、50M磷酸二氫鉀，pH，7. 4較為適合流感病毒 吸附。
[0144] 親和層析和疏水HIC-phenyl層析柱組合，硫酸纖維素或肝素親和柱上樣和平 衡緩沖液為lOOmM檸檬酸pH7. 4,洗脫緩沖液含有1. 7M(NH4)2S04, 50mMK2HP04,pH7. 4， HIC-phenyl柱上樣和平衡液與親和膜吸附層析洗脫液一致，洗脫液為100mM檸檬酸，pH 7. 4,流速lml/min，禽流感病毒蛋白用ELISA測定，總的DNA檢測方法按照試劑盒（DNA; Quant-iT.RTM.PicoGreen.RTM.assay)中的說明書進(jìn)行，總的蛋白檢測方法按照試劑盒 (P;Pierce.RTM.BCAproteinassay)中的說明書進(jìn)行。試驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值。
[0145] 親和層析和疏水反應(yīng)層析組合優(yōu)化：
[0146] 層析的操作條件和上述相同，用同一系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。澄清的病毒液分別透析到 100mM檸檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸二氫鉀、pH7. 4緩沖液中，含流感病毒4.65X107TCID5。/ mL，分別上樣已經(jīng)用lOOmM檸檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸二氫鉀、pH7. 4緩沖液平衡的硫酸 纖維素或肝素柱，用l〇〇mM檸檬酸，PH7. 4或含50mM磷酸二氫鉀、pH7. 4緩沖液簡短洗滌，洗 脫液合并后分別上樣已經(jīng)平衡的疏水層析柱，1〇〇禮檸檬酸，PH7. 4或含50mM磷酸二氫鉀、 PH7. 4緩沖液洗脫收集病毒液、合并，用上述方法檢測病毒液的組分。
[0147] 2批流感病毒原液、不同的緩沖液條件，硫酸纖維素、肝素親和膜吸附層析和 HIC-phenyl、HIC-PPGresins組合純化層析的操作條件和上述相同，用同一系統(tǒng)和檢測系 統(tǒng)。澄清的病毒液分別透析到l〇〇mM檸檬酸，PH7. 4或含50mM磷酸二氫鉀、pH7. 4緩沖液 中，含流感病毒4. 65X107TCID5Q/mL，分別上樣已經(jīng)用lOOmM檸檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸 二氫鉀、PH7. 4緩沖液平衡的硫酸纖維素或肝素柱，用lOOmM檸檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸 二氫鉀、PH7. 4緩沖液簡短洗滌，洗脫液合并后分別上樣已經(jīng)平衡的疏水層析柱，lOOmM檸 檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸二氫鉀、pH7. 4緩沖液或1. 7M硫酸銨洗脫收集病毒液、合并，用 實(shí)例的方法檢測病毒液的組分。
[0148] 結(jié)果：纖維素硫酸化依賴化學(xué)反應(yīng)的溫度，在35 °C、40 °C、45 °C纖維素硫酸 化程度分別為5. 5 %、9. 3 %、13 %。lml硫酸纖維素可吸附50ml的病毒液，病毒滴度 4. 65X107TCIDM/ml，吸附66 %的病毒，最后洗脫病毒收獲率79-80%，而纖維素骨架結(jié)合 15%的DNA，吸附31 %的流感病毒。說明硫酸纖維素純化流感病毒可提高收率。
[0149] 硫酸化溫度的提高，改善了流感病毒的吸附，也增強(qiáng)了DNA吸附，硫酸化達(dá)5. 5重 量％時(shí)，吸附15%的起始DNA。纖維素和硫酸化纖維素和DNA分子反應(yīng)模式不同，環(huán)化的 DNA、DNA的大小不同導(dǎo)致對纖維素和硫酸纖維素不同吸附，離子交換介質(zhì)限制了MDCK細(xì)胞 雙鏈DNA對弱陰或強(qiáng)陰離子的吸附。
[0150] 疏水層析反應(yīng)的流感病毒結(jié)合動(dòng)力性試驗(yàn)表明所有介質(zhì)可吸附20ml流感 病毒液，含3. 7X109TCID5。病毒。肝素介質(zhì)動(dòng)力結(jié)合活性為結(jié)合6ml流感病毒液，含 1. 1X109TCID5。病毒，硫酸纖維素結(jié)合活性為50ml流感病毒液，含9. 3X10 9TCID5。病毒， 硫酸纖維素的高結(jié)合性通過實(shí)驗(yàn)確證，流感病毒液50ml、4ml純化的收獲率分別為79%、 81 %，為結(jié)合的流感病毒為22 %、23 %。因此9. 3X109TCID5。流感病毒顆粒未能吸附到介質(zhì) 上，進(jìn)入3-5微米介質(zhì)顆粒的過濾?？梢院雎苑翘禺愋缘慕Y(jié)合。
[0151] 2M氯化鈉溶液導(dǎo)致流感病毒對乙基、苯基、己基配體的結(jié)合不足，因此發(fā)明中，流 感病毒原液經(jīng)親和膜吸附層析后，為能提高疏水層析的雜質(zhì)去除分離水平，選擇使用硫酸 銨和一系列不同的疏水配體試驗(yàn)，包括乙醚，聚丙二醇（poly-propyleneglycol(PPG))，苯 基，丁基以及己基。結(jié)果：PPG以及苯基為配體的層析液中無流感病毒顆粒檢出（ELISA)，乙 醚、丁基、己基作為HIC-配體的層析液分別含3%、6%、7%的起始上樣的病毒。苯基、丁基、 己基作為配體洗脫后的洗脫液中分別含有起始病毒量的84%、67%、63%。
[0152]疏水介質(zhì)層析不吸附對DNA的幾率分別為乙醚（75% )、PPG(64% )、苯基（58% )、 丁基（48%)、己基（53%)。和流感病毒共同洗脫的DNA，不同配體有所不同：乙醚（29%)、 PPG(13% )、苯基（19% )和己基（4% )。配體疏水性和n-alkyl鏈長度增長導(dǎo)致對DNA結(jié) 合能力的增強(qiáng)因而導(dǎo)致總DNA的減少。強(qiáng)疏水性的配體，如能結(jié)合48%、43%起始DNA的丁 基、己基不能達(dá)到工藝物料平衡，在再生工藝步驟去除。發(fā)明所提供的結(jié)果明顯地揭示流感 病毒培養(yǎng)液的自由DNA的疏水性可用于親和膜吸附層析去除純化液中的殘余DNA。.
[0153] 疏水層析中除乙醚結(jié)合2 %病毒液起始蛋白，其他配體都能大量結(jié)合病毒液蛋白， 洗脫液無蛋白檢測到。應(yīng)用的洗脫液在硫酸銨存在下，不能充分洗脫吸附在介質(zhì)上蛋白，洗 脫液中的蛋白含量在檢測限值（丁基，己基）到2% (PPG)。乙醚和苯基HIC-陪體中含 1%總蛋白。大量的在疏水層析吸附介質(zhì)上的蛋白可在再生工藝或步驟中通過激劇沖洗除 去。因此PPG和苯基HIC和親和膜吸附層析用作流感疫苗下游的純化。
[0154] 2批流感病毒原液、不同的緩沖液條件，硫酸纖維素、肝素親和膜吸附層析和 HIC-苯基、HIC-PPGresins組合純化的結(jié)果，如下表2所示：.
[0155]表2
[0156]
[0157] 從試驗(yàn)中看出用磷酸鉀鹽、檸檬酸緩沖液洗脫流感病毒并無差別，且可能減少流 感病毒的凝聚，流感病毒收率分別為73%、77%、75%、71%，純化流感液的0嫩分別為 5. 8%-2. 0%，4. 9%-4. 2%，各試驗(yàn)結(jié)果無顯著差異，但流感病毒產(chǎn)量明顯提高。肝素親 和層析用磷酸鉀、檸檬酸緩沖液純化流感病毒的病毒收率為68%、71%、59%、68%，用磷 酸鹽緩沖液的純化液中有12 %、14%DNA，檸檬酸緩沖液洗脫的病毒純化液有20 %的DNA和 蛋白一起洗脫。HIC-PPG、HIC-苯基柱上樣澄清后病毒液與純化假性親和吸附膜的洗脫液 不同，純化上步澄清的流感病毒液收獲率分別為88%、84%，純化假性親和膜吸附層析純 化后樣品的流感病毒收獲率58%、75%。可能是假性吸附膜層析大量病毒蛋白損失影響病 毒顆粒的吸附性。
[0158] 發(fā)明的實(shí)例發(fā)現(xiàn)磷酸鉀鹽和檸檬酸緩沖系統(tǒng)可作為純化工藝的緩沖系統(tǒng)，對流感 病毒的收率影響非常小，硫酸纖維素膜親和層析（SC-ΜΑ)/HIC-苯基組合收率最高達(dá)56%， 其次為肝素親和層析（h印arin-MA)/HIC-苯基組合收率為50%，SC-MA/HIC-PPG組合收率 44%heparin-MA/HIC-PPG組合病毒收率35% ;SC-MA/HIC-苯基層析組合使DNA下降到起 始含量的〇· 01-0. 04%。
[0159] 疏水層析中，離子強(qiáng)度影響DNA的減少，heparin-MA以及HIC-苯基是流感 病毒適宜的分離純化介質(zhì)。硫酸銨濃度在0. 4 5M時(shí)，9 5 %DNA和9 2 %的流感病毒不 吸附在HIC-苯基介質(zhì)上，濃度增加0. 6M、0. 85M、1. 0M、1. 25M、1. 5M、1. 7M時(shí)，分別有 43%，58%，63%，77%，85%和85%的病毒吸附到介質(zhì)上，且在1.5M后，洗脫液無病毒顆 粒能檢出，但含40 %的DNA，因此考慮到疏水層析的性質(zhì)：40 %DNA吸附于介質(zhì)，20 %隨病毒 洗脫，約有80%的DNA去除。HIC-苯基介質(zhì)在1. 5M硫酸銨的洗脫下，可去除大量DNA和雜 質(zhì)。優(yōu)化的硫酸銨濃度為1.7M。1.7M硫酸銨對流感病毒滴度影響經(jīng)測定下降小，抗原損失 小。因此基于以上實(shí)例結(jié)果，禽流感標(biāo)記疫苗規(guī)模化生產(chǎn)工藝流程、步驟質(zhì)量控制點(diǎn)如圖1 和圖2。
[0160] 實(shí)施例4禽流感疫苗純化工藝和質(zhì)量控制方法
[0161] 總蛋白濃度檢測：用BCA試劑盒檢測（購自Pierce公司）、白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA， Cat. #23209,購自ThermoFisher公司），該法已經(jīng)驗(yàn)證的使用范圍25-250μg/ml，檢測限 值：8· 3μg/ml，定量限值：25μg/ml。
[0162] 流感病毒血凝素檢測用夾心ELISA。
[0163] 滴度用在MDCK細(xì)胞上的50%感染劑量TCID50法檢測，采用試劑盒（購自ECACC; Cat. #88020401，UK;2· 0X105個(gè) /well)，細(xì)胞培養(yǎng)液含高糖DMEM培養(yǎng)（購自Invitogen公 司）含4mM谷氨酰胺（Cat.#G-3126-250GSigma-Aldrich，北京，中國），0. 1%慶大霉素 (Cat. #15710080,Invitrogen,北京，中國）and10%胎牛血清FBS(Cat. #3302-P280703,I nvitrogen,北京，中國），在37°C、5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)。病毒液樣品10倍稀釋加入單 層MDCK細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，用固定液固定（1體積丙酮和2體積甲醇混合），加入兔抗流感 病毒多克隆抗體（用含1 %胎牛血清PBS1000倍稀釋），加入抗兔過氧化物酶偶聯(lián)IgG抗體 (1;10000 稀釋），加入ACE底物（0.3mg/ml3-amin〇-9-ethyl_carbazole溶解于緩沖液含 0. 1M醋酸鈉、0. 015%雙氧水，pH5. 0)，依次分步洗滌，在顯微鏡下觀察，計(jì)算TCID50。
[0164]MDCK細(xì)胞殘余DNA、MDCK細(xì)胞雙鏈DNA檢測采用試劑Quant-iT PicoGreendsDNAreagent(購自美國生命公司），使用范圍 4-1000ng/mL，用lambda DNA(Cat. #D1501,Promega公司產(chǎn)品）校驗(yàn)，使用緩沖液為lOOmM醋酸，工作范圍4-1000ng/ mL,檢測限值0· 66ng/ml;定量限值2. 36ng/ml，總DNA測定6-400pg/mL范圍獲得驗(yàn)證。
[0165]DNA定量用限值總DNA測試盒和工作站（Cat.#R9009,德國MDS公司產(chǎn)品）。樣品 經(jīng)DNA抽提，用調(diào)零液調(diào)整體積到500微升，105°C滅活15分鐘，加入1000微升對單鏈DNA 有高親和性生物素偶聯(lián)蛋白、鏈霉素親和素、脲酶偶聯(lián)抗單鏈單抗的混合液，標(biāo)準(zhǔn)液和樣品 37°C孵育1小時(shí)，移入工作站的孔中，通過生物素包被醋酸纖維膜吸附器過濾，用PBS緩沖 液（含0. 05%疊氮化鈉、0. 05%吐溫，pH6. 5)洗滌，繼續(xù)高真空過濾直到各孔干燥，膜吸附 器移入限值讀數(shù)儀（已經(jīng)包被底物溶液500微升，含5M尿素、0. 05 %疊氮化鈉、0. 05 %吐溫 的PBS緩沖液，讀數(shù)儀有光測感受器），尿素是樣品的pH發(fā)生變化，所有樣品測試3次。該 法用小牛胸腺DNA校驗(yàn)，用50pg的胸腺DNA作為參照物以便滿足工藝過程純化和半成品殘 余檢測。
[0166] 實(shí)施例5禽流感標(biāo)記疫苗原液、半成品、成品M2蛋白的定量檢測
[0167] 禽流感病毒全長M2蛋白按專利號為ZL201210241084. 9,發(fā)明名稱為"一種制備甲 型流感病毒全長M2蛋白的方法"的中國專利申請所提供的方法制備和純化。
[0168] 疫苗原液、半成品、成品的M2蛋白的定量ELISA檢測：純化M2蛋白抗體溶于純水， 使5以8/1111，加100微升于96孔板37°(：過夜，用含10%馬血清的？83在4°(：封閉211，洗滌3 次，加入100μ1的10倍稀釋液待測樣品在室溫下作用lh，用PBST洗滌3次，再用HRP標(biāo)記 的M2蛋白抗體（1:1000~1:5000稀釋）室溫下反應(yīng)lh，加入HRP底物，反應(yīng)20min，用1M 磷酸終止反應(yīng)，0D值大于陰性平均值為陽性，用純化的M2蛋白不同稀釋度已知含量的M2蛋 白標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，獲得樣品中M2含量。
[0169] 蛋白測定方法：中國藥典2005版附錄29VIB，外源性DNA殘余量測定法：中國 藥典2005版附錄46IXB，抗生素殘余量測定法，中國藥典2005版附錄45IXA，，游離甲醛 < 50μg/劑，中國藥典2005版附錄34VIL。
[0170] 分子排阻高壓液相層析在線分析疫苗抗原純度，在線的AIV病毒抽提液、原 液100微升、濃縮原液100微升、純化液100微升注入分析型分子排阻層析柱（TSK-Gel PffcolumnG6000PW.sub.XL,particlesize17.mu. ,poresize1000.ANG. )(Tosho BiosciencesLLC.;Montgomeryvilie,Pa.)，平衡液PBS(無Ca2+orMg2+)平衡柱子， 流速lml/分，紫外光吸收值215nm，懦動(dòng)栗采用Agilent1100?·附帶ChemStation?軟件 (AgilentTechnologiesInc.;PaloAlto,Calif. )〇
[0171] 血凝素含量檢測按中國藥典2005年版三部113頁提供方法進(jìn)行。
[0172]MDCK細(xì)胞殘余DNA檢測按中國藥典2005版附錄46IXB進(jìn)行，MDCK宿主細(xì)胞蛋白 測定試劑