22種新的人參多肽的一級(jí)序列的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從人參中分離純化得到的人參多肽組分，其中含有22種新的人參多 肽的一級(jí)序列，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參為五加科植物，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品藥物，在中醫(yī)藥臨床領(lǐng)域中具 有悠久的歷史，具有補(bǔ)脾益肺，大補(bǔ)元?dú)?，生津安神益智的功效，人參中的成分?fù)雜，主要成 分包括糖類、皂苷類、揮發(fā)油成分等，還有有機(jī)酸及其酯、酶類、蛋白質(zhì)、留醇及其苷，多肽、 黃酮類，木質(zhì)素、無機(jī)元素及維生素類等，在繁多的化學(xué)成分中，至今研究最多的成分是人 參皂苷和人參多糖。
[0003] 近年來，我們對(duì)人參多肽進(jìn)行了大量深入的研究和探討，目前已有報(bào)道，Akira Yagi等人從人參水提物中分離得到一個(gè)四肽，其序列為Gly-Arg- γ -Glu-Val-NH2,此四 肽可刺激幼倉(cāng)鼠腎-21 細(xì)胞增殖（Hideyuki Kajiwara. etc, Evidence of metal binding activities ofpentadecapeptide from Panax ginseng. Journal of Chromatography B，1996,687 :443-448. h汪大偉等人分離提純得到人參中抗脂解十四肽，其氨基酸序列為
[0004] Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-Asp-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly
[0005] -Asp-Ala(汪大偉等.抗脂解活性的人參十四肽的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).物理化學(xué)學(xué) 報(bào)，1990,6(5) :562-566)。還有報(bào)道從人參甲醇水提取物中得到六個(gè)y-谷氨酰寡肽： P-I (N-γ-glutamylcystinyl-bis-glycine),P-Il ( γ-glutamylcysteinyIglycine disulfide, oxidized glutathione), P-Ill (N，Ν' -bis- γ-glutamylcystinyIglycine) ，P-IV ( γ-glutamylcysteinyIgly cinamide disulfide), P-V(N-γ-glutamylglycyIcy steine disulfide)，P-VI ( γ -glutamylarginine)，其中 5 個(gè)為氧化型谷I光甘肽（Chen. Z.K. ,etc. Isolation and characterization of a group of oligopeptides related to oxidized glutathione from the root of Panuxgnseng. J. Peptide Res. 1998,52: 137-142) 并且我們已從人參非皂苷成分中鑒定出一個(gè)三肽（王穎，等.人參三肽的序列 分析.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2014, 52 (4) :1-3.)與一個(gè)十四肽（Hao-ming Luo, etc,. Purification and characterization of a novel tetradecapeptide from ginseng polypeptides with enhangcing memory activity for mice. Chemical Research in Chinese Universities，2013, 29(4) :638-641.)，氨基酸序列分別為：Gln-Thr-Ser 和 Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ser0
[0006] 多肽具有很多的生物活性，在研究人參大分子類成分過程中，我們又從人參中分 離鑒定出22種全新結(jié)構(gòu)的人參多肽，并通過出了它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)，本研究成果 可為人參的開發(fā)與利用及構(gòu)效關(guān)系的闡述提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一是提供一種人參多肽組分的制備方法，該制備方法中人參的水 提取液經(jīng)過大孔樹脂柱層析分離，膜超濾，外液經(jīng)凝膠柱層析純化而得到多肽組分。經(jīng)此方 法得到的多肽組分純度更高，雜質(zhì)更少。
[0008] 本發(fā)明的目的之二是對(duì)人參多肽組分中含有的人參多肽進(jìn)行分析鑒定，采用 UPLC-MSn法進(jìn)行測(cè)定，并經(jīng)Uniprot全序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與分析，確定了 22種人參多肽的一 級(jí)序列。
[0009] 本發(fā)明的內(nèi)容是能過以下技術(shù)方案來實(shí)施的。
[0010] 1、人參多肽組分的制備
[0011] 將人參Panax ginseng C. A. Meyer的干燥根粉碎，加10-15倍量的水煎煮2次，每 次3小時(shí)，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含Ig藥材，通過已處理好的DlOl大孔吸附樹脂，用 水洗脫2倍量柱體積，水洗脫液通過截留分子量為20K的中空纖維柱進(jìn)行超濾，超濾液繼續(xù) 通過截留分子量為IK的中空纖維柱進(jìn)行超濾，超濾液濃縮，真空干燥后，經(jīng)Sephadex G-15 凝膠色譜柱純化，按圖1洗脫曲線收集兩部分，分別命名為Pl與P2。P2為目標(biāo)多肽類成分。
[0012] 2、結(jié)構(gòu)研究
[0013] 人參多肽組分經(jīng)HPLC分析，GPC軟件計(jì)算，為重均分子量在3500Da的混合物。此 多肽經(jīng)UPLC-MS n檢測(cè)，Uniprot全序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與分析，得到22種多肽的氨基酸序列。
[0014] UPLC-MSn測(cè)定多肽的條件如下：
[0015] 液相條件：Easy-nLC1000UPLC 設(shè)備（ThermoFisher Scientific, USA)，色譜柱米 用反相ReproSil-Pur C18-AQ柱。流動(dòng)相：A :0.1 %甲酸-水，B :0.1 %甲酸-乙腈。進(jìn)樣 量 4 μ L0
[0016] 質(zhì)譜條件：ThermoFisher Scientific LTQ Orbitrap 質(zhì)譜儀。毛細(xì)管溫度 275°C。 電壓2kV。
[0017] 經(jīng)過測(cè)定，確定22種人參多肽的序列分別為
[0018] I. GIPQVEVTFDIDANGIVHVSAK、
[0019] 2.KQVMLGITK、
[0020] 3. TIVTEIGKILKT、
[0021] 4. htgkaktisgitfpdgengkvikvqfkemkpgmtqsgngyfletv^
[0022] 5. RVRFTSPHPRDFTDDVIAAMAETPNVMPQLHMPLQSGSDRILR、
[0023] 6. ADGTATVMAIGTAHPPHIFPQDTYADVYFRATNSEHKVELKKKF
[0024] 7. PISDVffARFALQTISRHFRRAVYAPDDLEARSQMHLASTMAGV ^
[0025] 8. MELINVSELGEEMDFKVFKDAVNNDGQVKAIVAKGAADQYTRKD^
[0026] 9. DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGK、
[0027] 10.FLEQQNQVLQTKffELLQQVNTSTGT^
[0028] 11. RKKKVICGMSGG、
[0029] 12. LQLYSDSDDDEEDEEDEEEEE、
[0030] 13. EASS⑶EGSYNPH、
[0031] 14. AKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ、
[0032] 15. KADTLGTFQIESRAQMSMLPRLKPAKFYDLVIQVAIV、
[0033] 16. KADTLGTFQIESRAQMAMLPRLKPKTFYDLWQVAIV、
[0034] 17. GIAKEEAEEIKAALEEAGAKVEIK、
[0035] 18. SAIDYVTKKLG、
[0036] 19. KWFGPYSGS、
[0037] 20. LGFRPYLGMPRERTALPLDMAQEP、
[0038] 21. IGSGTWDPKVLLGELAMLASNDIDASG、
[0039] 22. NMSSACVHF。
【附圖說明】
[0040] 圖 I為 Sephadex G_ 15 洗脫圖
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的簡(jiǎn) 易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
[0042] 實(shí)施例1 :人參多肽組分的制備
[0043] 將人參Panax ginseng C. A. Meyer的干燥根粉碎，加10-15倍量的水煎煮2次，每 次3小時(shí)，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含Ig藥材，通過已處理好的DlOl大孔吸附樹脂，用 水洗脫2倍量柱體積，水洗脫液通過截留分子量為20K的中空纖維柱進(jìn)行超濾，超濾液繼續(xù) 通過截留分子量為IK的中空纖維柱進(jìn)行超濾，超濾液濃縮，真空干燥后，經(jīng)Sephadex G-15 凝膠色譜柱純化，按洗脫曲線收集兩部分，分別命名為Pl與P2。P2為目標(biāo)多肽類組分。
[0044] 實(shí)施例2 :結(jié)構(gòu)研究
[0045] 人參多肽組分經(jīng)HPLC分析，GPC軟件計(jì)算，為重均分子量在3500Da的混合物。此 多肽經(jīng)UPLC-MS n檢測(cè)，Uniprot全序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與分析，得到22種多肽的氨基酸序列（見 表1)〇
[0046] 表1.氨基酸序列測(cè)定結(jié)果
[0047]


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人參多肽組分的制備方法，其特征在于：將人參PanaxginsengC.A.Meyer粉 碎，加10-15倍量的水煎煮2次，每次3小時(shí)，濾過，合并濾液，濃縮至每lml含lg藥材，通 過已處理好的D101大孔吸附樹脂，用水洗脫2倍量柱體積，水洗脫液通過截留分子量為20K 的中空纖維柱進(jìn)行超濾，超濾液繼續(xù)通過截留分子量為1K的中空纖維柱進(jìn)行超濾，濃備液 濃縮，通過凝膠柱層析分離，得到人參多肽組分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參多肽組分的制備方法，其特征在于所述的人參多肽組分 中包含22種新的人參多肽的一級(jí)序列，采用UPLC-MSn測(cè)得22種新的人參多肽的一級(jí)序列 分別為： 1. GIPQVEVTFDIDANGIVHVSAK^ 2. KQVMLGITK、 3.TIVTEIGKILKT、 4. HTGKAKTISGITFPDGENGKVIKVQFKEMKPGMTQSGNGYFLETV、 5. RVRFTSPHPRDFTDDVIAAMAETPNVMPQLHMPLQSGSDRILR^ 6. ADGTATVMAIGTAHPPHIFPQDTYADVYFRATNSEHKVELKKKF 7. PISDVffARFALQTISRHFRRAVYAPDDLEARSQMHLASTMAGV^ 8. MELINVSELGEEMDFKVFKDAVNNDGQVKAIVAKGAADQYTRKD、 9. DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGK、 10. FLEQQNQVLQTKWELLQQVNTSTGT、 11. RKKKVICGMSGG、 12.LQLYSDSDDDEEDEEDEEEEE、 13. EASS⑶EGSYNPH、 14. AKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ、 15. KADTLGTFQIESRAQMSMLPRLKPAKFYDLVIQVAIV、 16. KADTLGTFQIESRAQMAMLPRLKPKTFYDLWQVAIV、 17. GIAKEEAEEIKAALEEAGAKVEIK、 18.SAIDYVTKKLG、 19. KWFGPYSGS、 20.LGFRPYLGMPRERTALPLDMAQEP、 21. IGSGTWDPKVLLGELAMLASNDIDASG、 22. NMSSACVHF。
【專利摘要】本發(fā)明是通過分離純化的方法從傳統(tǒng)中藥人參中分離純化得到的人參多肽組分，此人參多肽組分中包含22種新的人參多肽的一級(jí)序列，采用UPLC-MSn對(duì)22種新的人參多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，確定了22種人參多肽的一級(jí)序列。本發(fā)明可為傳統(tǒng)中藥人參的深入研究奠定基礎(chǔ)，也可為人參的開發(fā)與利用及構(gòu)效關(guān)系的闡述提供科學(xué)依據(jù)。
【IPC分類】C07K1/16, C07K14/415, C07K1/34, C07K7/08, C07K1/22, C07K7/06
【公開號(hào)】CN105399797
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510628372
【發(fā)明人】王穎, 陳英紅, 羅浩銘, 姜瑞芝
【申請(qǐng)人】羅浩銘
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月15日