特異性結(jié)合的多肽序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與伏馬毒素仏特異性結(jié)合的多肽序列。本發(fā) 明提供的能與FBd#合的噬菌體展示肽與FBi具有較高的親和性和特異性，與傳統(tǒng)的單克隆 抗體相比，從噬菌體展示隨機(jī)多肽庫中淘選與靶標(biāo)結(jié)合的噬菌體展示肽具有操作簡單、容 易大量制備和純化的特點。
【背景技術(shù)】
[0002] 伏馬毒素 （Fumonision FB)是由串珠鏡刀菌Fusarium moniliforme Sheld和 F.proliferatum在一定溫度和濕度條件下繁殖所產(chǎn)生的水溶性次生代謝產(chǎn)物，他是一類由 不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物。目前，已發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有FAi、 FA2、FBi、FB2、FB3、FB4、FCi、FC2、FC3、FC4 和FP^ 11 種，其中 FBi 是其主要組分。FBi對食品污染 的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，主要污染糧食作物及其相關(guān)的食品和動物飼料，包括玉米、 大麥等谷物，以及茶葉、藥用植物、啤酒、動物內(nèi)臟等。伏馬毒素對人、畜不僅是一種促癌物， 而且完全是一種致癌物。動物實驗和流行病學(xué)實驗表明，伏馬毒素主要損害肝腎功能，能引 起馬腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫等，并與我國和南非部分地區(qū)高發(fā)的食道癌有關(guān)，現(xiàn)已引起 世界范圍的廣泛注意。
[0003] 目前伏馬毒素出的檢測方法主要涉及儀器分析法和免疫分析法。儀器分析檢測方 法包括質(zhì)譜(MS)、氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)技術(shù)和液相 色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)技術(shù)，儀器分析檢測方法雖然具有靈敏度和特異性好，但是樣品處 理步驟繁瑣、費時、儀器昂貴、而且需要專業(yè)人員和在快速檢測中難以普及使用。酶聯(lián)免疫 吸附檢測技術(shù)（enzyme-1 inked ImmunosorBent assay;ELISA)免疫是一種基于抗原、抗體 特異性結(jié)合而建立的檢測方法，具有高通量、速度快、操作簡便、檢測成本低和可定量等特 點，特別適用于大量樣本的快速篩選。但是目前用于ELISA檢測試劑盒的各類毒素的單克隆 抗體主要來源于小鼠雜交瘤細(xì)胞，因此在篩選單克隆抗體長期復(fù)雜的過程，即耗費時間，又 耗費財力物力。
[0004] 菌體展示技術(shù)(phage display technology)是20世紀(jì)80年代逐步建立并發(fā)展 起來的一項分子生物學(xué)新技術(shù)。它以噬菌體或噬粒為載體，使外源肽或蛋白質(zhì)的基因與噬 菌體表面特定蛋白質(zhì)基因在其表面進(jìn)行融合表達(dá)，進(jìn)而通過親和富集法篩選表達(dá)有特異肽 或蛋白質(zhì)的噬菌體。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)，改變了真菌毒素抗原和抗體制備的傳統(tǒng)途徑， 利用噬菌體展示技術(shù)可制備抗體、模擬抗原表位，代替真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，建立無毒ELISA 檢測方法。ELLSA檢測方法快速、靈敏、操作簡便，且對樣品的純度要求不高，適合樣品的初 步篩查檢測，但該方法由于目前用于ELISA檢測試劑盒的各類毒素的單克隆抗體主要來源 于小鼠雜交瘤細(xì)胞，因此在篩選單克隆抗體長期復(fù)雜的過程，即耗費時間，又耗費財力物 力。所以有待進(jìn)一步完善或?qū)で笙嚓P(guān)替代單克隆抗體的元件及分析技術(shù)。
[0005] 目前利用噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)制備玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉 毒素出等毒素的單鏈抗體和得到赭曲霉毒素、黃曲霉毒素出、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、桔 青霉素、等毒素模擬抗原表位。另外，利用病原菌、真菌毒素或小分子物質(zhì)(毒素、除草劑、植 物生長激素、咖啡因等)與其抗體形成的復(fù)合物對噬菌體展示隨機(jī)多肽庫進(jìn)行親和篩選，已 經(jīng)篩選出能夠與其結(jié)合的噬菌體展示多肽，并且已經(jīng)建立基于噬菌體展示肽競爭性酶聯(lián)免 疫吸附檢測法和膠體金試紙條檢測方法。與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，從噬菌體展示隨機(jī)多 肽庫中淘選與靶標(biāo)結(jié)合的噬菌體展示肽具有操作簡單、容易大量制備和純化的特點。但目 前為止，尚未見具有與伏馬毒素也特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種與伏馬毒素也特異結(jié)合的多肽序列，所述多肽序列為噬菌體展示 肽，由12個氨基酸組成。
[0007] 所述的與伏馬毒素也特異結(jié)合的多肽序列共有五種，其氨基酸序列如SEQ ID N0: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4及SEQ ID N0:5所示。
[0008] 所述五種多肽序列對應(yīng)的核苷酸序列按次序如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10所示。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] -種與伏馬毒素出特異結(jié)合的多肽序列，制備所述多肽的方法如下：
[0011] (1)將FBi-BSA包被在酶標(biāo)板上，用5 %BSA封閉酶標(biāo)板，將噬菌體展示隨機(jī)12肽庫 加入包被和封閉后的酶標(biāo)板中進(jìn)行親和淘選，淘選過程按照"吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增"的循 環(huán)進(jìn)行，經(jīng)過4輪的淘選；
[0012] (2)輪淘選后，挑取30個克隆進(jìn)行擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、測序，得到5種序列；
[0013] (3)采用ELISA方法檢驗上述的5種噬菌體展示肽與FBi結(jié)合的親和性和特異性。
[0014]所述多肽序列與伏馬毒素 FBA#異結(jié)合，用于檢測或鑒定伏馬毒素 Bu
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供的能與FBd#合的噬菌體展示肽與FBi具有較 高的親和性和特異性，與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，從噬菌體展示隨機(jī)多肽庫中淘選與靶標(biāo) 結(jié)合的噬菌體展示肽具有操作簡單、容易大量制備和純化的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0016] 圖1為噬菌體展示肽1號與FB^BSA親和性測定；
[0017]圖2為噬菌體展示肽2號與FB^BSA親和性測定；
[0018]圖3為噬菌體展示肽3號與FB^BSA親和性測定；
[0019] 圖4為噬菌體展示肽4號與FBrBSA親和性測定；
[0020] 圖5為噬菌體展示肽5號與FB^BSA親和性測定；
[0021 ]圖6為噬菌體展示肽1號與FBrBSA特異性測定；
[0022]圖7為噬菌體展示肽2號與FBi-BSA特異性測定；
[0023]圖8為噬菌體展示肽3號與FBrBSA特異性測定；
[0024]圖9為噬菌體展示肽4號與FBrBSA特異性測定；
[0025]圖10為噬菌體展示肽5號與FBrBSA特異性測定。
【具體實施方式】
[0026] 本發(fā)明提供一種與伏馬毒素也特異結(jié)合的多肽序列，所述多肽序列為噬菌體展示 肽，由12個氨基酸組成，所述與伏馬毒素出特異結(jié)合的多肽序列共有五種。所述的與伏馬毒 素仏特異結(jié)合的多肽序列共有五種，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQIDN0:lSSEQIDN0:5m*。
[0027] 所述五種多肽序列對應(yīng)的核苷酸序列按次序如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ IDN0:8、SEQIDN0:9&SEQIDN0:l(^；f*。
[0028] 為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0029] -種與伏馬毒素出特異結(jié)合的多肽序列，制備所述多肽的方法如下：
[0030] (1)將FBi-BSA包被在酶標(biāo)板上，用5%BSA封閉酶標(biāo)板，將噬菌體展示隨機(jī)12肽庫 加入包被和封閉后的酶標(biāo)板中進(jìn)行親和淘選，淘選過程按照"吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增"的循 環(huán)進(jìn)行，經(jīng)過4輪的淘選；
[0031] (2)輪淘選后，挑取30個克隆進(jìn)行擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、測序，得到5種序列；
[0032] (3)采用ELISA方法檢驗上述的5種噬菌體展示肽與FB!結(jié)合的親和性和特異性。
[0033]所述多肽序列與伏馬毒素 FBA#異結(jié)合，用于檢測或鑒定伏馬毒素 Bu
[0034]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，具體步驟如下：
[0035] 一、實驗準(zhǔn)備
[0036] 主要試劑：
[0037] 蛋白胨（0X0ID公司）、酵母提取物（0X0ID公司）、瓊脂粉（Amresco公司）、IPTG (Amresco公司）、Xgal(Amresco公司）、PEG8000(Sigma有限公司）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗 M13單克隆抗體(GE公司），噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫購自NEB公司(NEB#E8110S)。
[0038] 主要試劑配方：
[0039] l.PEG/NaCl:20%(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl,高壓滅菌，室溫儲藏；
[0040] 2.IPTG/Xgal配方：將1.25g IPTG和lg Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺（DMF)中，-20 °C避光保存；
[0041 ] 3.四環(huán)素貯液:20g/mL，溶于50%乙醇中，-20°C避光貯存，使用前搖勻；
[0042] 4. LB培養(yǎng)基：10g/L細(xì)菌胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，高壓滅菌，室溫儲 藏；
[0043] 5. LB/IPTG/Xgal平板：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15g/L瓊脂粉， 高壓滅菌，冷卻至70°C以下，加入lmL IPTG/Xgal，混勻倒平板，平板4°C避光保存；
[0044] 6 · LB-Tet平板:LB液體培養(yǎng)基加15g//L瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至70°C以下，加入 lmL四環(huán)素貯液，混勻倒平板，平板4 °C避光保存；
[0045] 7.封閉液:含有5%83厶，0.151，？!17.4?83，過濾除菌，4°(：保存；
[0046] 8.顯色液：25mL 0.1M pH 5.5檸檬酸鹽緩沖液中加入0.411^，611^/11^四甲基聯(lián)苯 胺，O.lmL l%H2〇2。
[0047]二、伏馬毒素出特異性結(jié)合多肽的淘選和制備 [0048] 1.伏馬毒素出特異性結(jié)合多肽的淘選
[0049] 按照"吸附一洗滌一洗脫一擴(kuò)增"的循環(huán)進(jìn)行，經(jīng)過4輪的淘選，具體操作如下：
[0050] (1)將FBi-BSA偶合物稀釋到2yg/mL，加入到微孔板，1 ΟΟμL孔，4 °C包被過夜；同時 將2yg/mL BSA加入到微孔板，100μL7孔，4 °C包被過夜;FBi-BSA偶合物和BSA各加48個孔；
[0051 ] (2)取少量大腸桿菌ER2738涂在LB-Tet平板上，37°C培養(yǎng)過夜；
[0052] (3)將BSA包被的酶標(biāo)板用含0. l%Tween-20的PBST洗滌6次，備用；
[0053] (4)將BSA包被的酶標(biāo)板沒孔加入100yL(l X 10npfu/mL)的噬菌體，室溫輕微震蕩1 小時；
[0054] (5)將?81-834偶合物包被的酶標(biāo)板用含0.1%了￥6611-20的1^31'洗滌6次，31^11/次， 甩空微孔板，加入300yL的封閉緩沖液，37°C孵育1小時，用含0.1%TWeen-20的TOST洗滌6 次，3min/次；
[0055] (6)將步驟(4)中酶