硫辛酸修飾的聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物的制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種改性的兩親三嵌段聚合物，具體涉及一種中間疏水性鏈段側(cè)鏈用 硫辛酸修飾的兩親三嵌段聚合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于納米載體可以增強(qiáng)滲透和保留（EPR)效應(yīng)，對(duì)抗癌藥物靶向控制釋放，近年 來(lái)，各種納米載體被開發(fā)用于改善癌癥化療效果。聚合物膠束作為一種納米載體，由于其優(yōu) 異的性質(zhì)：延長(zhǎng)藥物循環(huán)時(shí)間，提高藥物溶解度以及增強(qiáng)EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向腫瘤部位等能 力而廣泛應(yīng)用于藥物輸送。兩親性聚合物通過分子間的相互作用在水中可以自組裝形成聚 合物納米膠束（Micelles)。納米膠束作為藥物載體進(jìn)入體內(nèi)，可以有效地減少人體網(wǎng)狀內(nèi) 皮系統(tǒng)（RES)巨噬細(xì)胞的吞噬，能穿越細(xì)胞間隙，可通過人體最小的毛細(xì)血管及血腦屏障 (BBB)并被細(xì)胞組織吸收，釋放出抗癌膠束殺死癌變細(xì)胞。同時(shí)，納米膠束可以避免藥物活 性喪失，有利于藥物的貯藏和運(yùn)輸。因此聚合物納米膠束在藥物的控制釋放上具有巨大應(yīng) 用潛力。
[0003] 將末端官能化的親水鏈段作為大分子引發(fā)劑開環(huán)聚合反應(yīng)形成具有疏水鏈段的 兩親結(jié)構(gòu)，是制備兩親聚合物的最主要方法之一。常見的術(shù)端官能化的親水鏈段包括聚乙 二醇（PEG)、聚磷酸酯（PEEP)等。常用的可生物降解的疏水鏈段包括聚酯（聚己內(nèi)酯，聚 丙交酯等）和聚氨基酸（如聚γ-芐酯-L-谷氨酸、聚γ-芐酯-L-天冬氨酸、聚苯丙氨酸 和聚亮氨酸等）。作為親水鏈段，聚乙二醇（PEG)具有高度的親水性和良好的生物相容性 及血液相容性，能被機(jī)體迅速排出體外而不產(chǎn)生任何毒副作用。作為疏水鏈段，天然和合成 的聚氨基酸具有良好的生物相容性，生物降解性，代謝產(chǎn)物對(duì)人體無(wú)害，且無(wú)免疫原性（Wu et al. Biomaterials，2013, 34 :5262-5272 ;Wang，et al. Soft Matter，2013, 9:692-699; Ding，et al. Polym. Chem. 2011，2 :2857-2864)。
[0004] 然而通過自組裝形成的兩親聚合物的聚集體如膠束、納米膠束、聚合物囊泡等 藥物載體往往不夠穩(wěn)定，注入體內(nèi)被血液大量稀釋而解離，造成藥物過早釋放而不能將 藥物輸送至靶向位點(diǎn)。通過共價(jià)鍵交聯(lián)是目前用來(lái)提高納米藥物載體穩(wěn)定性的主要方 法。交聯(lián)可分為核交聯(lián)或殼交聯(lián)（Wu，et al.J. Control. Release，2012,164:338-345; Hu，et al.Macromolecules，2013,46 :6243-6256 ;Jin，et al.Soft Matter，2012,8 : 11809-11816)。但對(duì)于理想的藥物釋放載體而言，需要的是一種對(duì)體內(nèi)環(huán)境敏感的可逆交 聯(lián)，g卩：在體內(nèi)血液中非常穩(wěn)定能長(zhǎng)循環(huán)，進(jìn)入細(xì)胞后，能對(duì)胞內(nèi)環(huán)境具有響應(yīng)性而解除交 聯(lián)，將藥物釋放出來(lái)。近年來(lái)，開發(fā)具有環(huán)境（PH、溫度、氧化還原環(huán)境等）敏感性的納米 載體成為研究熱點(diǎn)之一（Chen，et al.J. Control. Release，2013,169 :171-179 ;Zhong，et al. Biomacromolecules，2013,14 :3723-3730) 然而，到目前為止，關(guān)于可生物降解的、環(huán)境 敏感的、可逆交聯(lián)的納米藥物載體的報(bào)道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種兩親三嵌段聚合物的制備及應(yīng)用的方法。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是，一種兩親三嵌段聚合物，所述兩親三嵌 段聚合物的鏈段為一種親水性聚合物和兩種疏水性聚合物組成，中間鏈段的側(cè)鏈為硫辛酰 基。
[0007] 上述技術(shù)方案中，所述親水聚合物可選用的原料為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的原 料，所述親水性聚合物可選自但不限于：聚乙二醇；所述親水聚合物的分子量為1000~ lOOOODa。所述中間疏水性聚合物可選自但不限于：聚谷氨酸芐酯、聚天冬氨酸芐酯、聚 N-芐氧羰基賴氨酸中的一種；所述中間疏水性聚合物的分子量為500~5000Da。所述末端 疏水性聚合物可選自但不限于：聚苯丙氨酸、聚亮氨酸、聚異亮氨酸中的一種；所述末端疏 水性聚合物的分子量為2000~lOOOODa。
[0008] 上述技術(shù)方案中，所述兩親三嵌段聚合物中間鏈段被硫辛酸修飾，其中硫辛酰基 的取代度（每個(gè)中間鏈段聚合物單元中硫辛酸的個(gè)數(shù)）為20~100%。
[0009] 制備上述兩親三嵌段聚合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，以硫辛酸修 飾的聚乙二醇-聚谷氨酸芐酯-聚苯丙氨酸（PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe)的制備為例來(lái)說(shuō) 明兩親三嵌段聚合物的制備方法，PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe聚合物可通過對(duì)開環(huán)聚合得到 的聚乙二醇-聚谷氨酸芐酯-聚苯丙氨酸（PEG-PBLG-PPhe)的側(cè)鏈進(jìn)行修飾得到：首先 用PEG-NHJ# BLG-NCA和Phe-NCA依次開環(huán)聚合得到PEG-PBLG-PPhe，然后用乙二胺將所 得聚合物胺解后再與硫辛酸發(fā)生?；磻?yīng)，制備一系列硫辛酸修飾的聚谷氨酸鏈段單元的 PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe，其合成路線如圖1所示。
[0010] 上述技術(shù)方案中，所述兩親三嵌段聚合物中硫辛酸修飾的聚谷氨酸鏈段單元可通 過加入的BLG-NCA與PEG、Phe-NCA的比例、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等來(lái)調(diào)節(jié)。
[0011] 上述技術(shù)方案中，由于聚乙二醇作為親水鏈段，兩種聚氨基酸作為疏水鏈段，得 到兩親性三嵌段聚合物，可以自組裝形成納米膠束，然后可以通過還原劑如二硫代蘇糖醇 (DTT)對(duì)殼上的硫辛?；奈逶h(huán)進(jìn)行交聯(lián)，來(lái)增加納米膠束的穩(wěn)定性，形成殼交聯(lián)納米膠 束，這種殼交聯(lián)納米膠束對(duì)細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境敏感，能解除交聯(lián)。
[0012] 因此，本發(fā)明的另一目的為提供一種交聯(lián)納米膠束。
[0013] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是，一種交聯(lián)納米膠束，所述納米膠束的外 冠親水層由親水性聚合物構(gòu)成，中間殼由硫辛酸修飾的疏水性聚合物構(gòu)成，內(nèi)核疏水層由 疏水性聚合物構(gòu)成。
[0014] 上述技術(shù)方案中，所述交聯(lián)納米膠束的粒徑為30~200納米，粒徑分布PDI為 0. 05 ~0. 35。
[0015] 制備上述交聯(lián)納米膠束的方法包括以下步驟：
[0016] (1)將上述兩親三嵌段聚合物通過自組裝形成納米膠束，所述納米膠束的外冠親 水層由親水性聚合物構(gòu)成，中間殼由側(cè)鏈為硫辛?；氖杷跃酆衔飿?gòu)成，內(nèi)核疏水層由 疏水性聚合物構(gòu)成；
[0017] (2)將步驟（1)中納米膠束的中間殼層交聯(lián)，通過對(duì)硫辛?；奈逶h(huán)的交聯(lián)來(lái) 穩(wěn)定納米膠束結(jié)構(gòu)，得到殼交聯(lián)納米膠束。
[0018] 上述技術(shù)方案中，步驟（1)中所述兩親三嵌段聚合物在水中自組裝形成以兩種聚 氨基酸為疏水部分的尺寸穩(wěn)定，分布均一的納米膠束，所述納米膠束的粒徑為30~200nm。
[0019] 上述技術(shù)方案中，步驟（2)中所述的交聯(lián)可采用但不局限于下列方法：
[0020] 利用疏基-二硫鍵交換（thiol-disulfide exchange)反應(yīng)，通過1，4_二硫代-D， L-蘇丁醇（DTT)對(duì)步驟（1)所得納米膠束中的含二硫鍵的五元環(huán)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)；其中，1， 4-二硫代-D，L-蘇糖醇（DTT)的用量相對(duì)于取代的硫辛酸的摩爾數(shù)的5~30%，納米膠束 能夠被成功交聯(lián)。
[0021] 上述技術(shù)方案所得殼交聯(lián)納米膠束的穩(wěn)定性相對(duì)于沒有交聯(lián)的納米膠束大大提 高，即使稀釋100倍（模擬IV注射）也不發(fā)生解離；對(duì)150mM的氯化鈉鹽的水溶液穩(wěn)定，粒 徑變化不大。
[0022] 上述技術(shù)方案所得殼交聯(lián)納米膠束在還原環(huán)境中可以被解交聯(lián)，用以解交聯(lián)的還 原劑可選自但不限于：含巰基的分子，如1，4_二硫代-D，L-蘇糖醇（DTT)，谷胱甘肽（GSH) 或含三價(jià)磷的化合物，如三（2-氯乙基）磷酸酯（tris(2-carboxyethyl)_phosphine， TCEP);例如當(dāng)DTT的濃度為10mM的時(shí)候，上述殼交聯(lián)納米膠束會(huì)被解交聯(lián)。
[0023] 因?yàn)樯鲜鰵そ宦?lián)納米膠束具有還原敏感性，所以可以應(yīng)用所述殼交聯(lián)納米膠束作 為藥物載體，可提尚殼交聯(lián)納米膠束在體內(nèi)血液循環(huán)時(shí)的穩(wěn)定性，提尚交聯(lián)納米膠束被腫 瘤細(xì)胞內(nèi)吞的效率，從而提高藥物的生物利用度，同時(shí)殼交聯(lián)納米膠束可方便排除體外。
[0024] 本發(fā)明的另一目的為提供上述殼交聯(lián)納米膠束的應(yīng)用，所述殼交聯(lián)納米膠束作為 藥物載體的應(yīng)用。
[0025] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為，應(yīng)用上述兩親三嵌段聚合物作為藥 物載體的方法，包括以下步驟：
[0026] (1)藥物先溶在有機(jī)溶液中，再與所述兩親三嵌段聚合物的有機(jī)溶液共同攪拌，然 后再滴加二次水，將得到的溶液攪拌1小時(shí)后透析，得到包裹藥物的納米膠束；
[0027] (2)對(duì)形成的納米膠束加入5~30mol %相對(duì)于雙硫鍵的1，4-二硫代-D，L-蘇糖 醇（DTT)對(duì)殼上硫辛酰基進(jìn)行交聯(lián)得到包裹藥物的殼交聯(lián)納米膠束。
[0028] 上述技術(shù)方案中，所述藥物可選自但不局限于：疏水性藥物中的一種。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)需要選擇所需包封的藥物分子。
[0029] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，PEG-pGlu (EDA-LA) 1Q-PPhe，其中，PEG具有優(yōu)異的生物相容性， 在體內(nèi)能溶于組織液中，能被機(jī)體迅速排出體外而不產(chǎn)生任何毒副作用，其安全性得到FDA 認(rèn)證；聚氨基酸生物相容性好，在體內(nèi)可被酶降解成小分子而被排出體外，其側(cè)鏈可以接上 藥物，交聯(lián)劑或者是能改進(jìn)高分子的物理性質(zhì)的側(cè)基；硫辛酸是FDA批準(zhǔn)的一種內(nèi)源性的 抗氧化劑，可以去除機(jī)體自由基，降低血糖。因此整個(gè)體系具有非常優(yōu)良的生物相容性。
[0030] 由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：
[0031] (1)由于本發(fā)明的兩親三嵌段聚合物中間殼層的疏水鏈段側(cè)鏈修飾有硫辛?；?， 因此可以通過對(duì)兩親三嵌段聚合物自組裝形成的納米膠束進(jìn)行交聯(lián)，得到穩(wěn)定的還原敏感 性殼交聯(lián)納米膠束，該殼交聯(lián)納米膠束在細(xì)胞外和血液中不易解離，從而保證納米膠束包 封的藥物穩(wěn)定；克服了藥物在體內(nèi)易被泄漏、運(yùn)載效率低等不足。
[0032] (2) -旦進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，殼交聯(lián)納米膠束在細(xì)胞還原性條件下則快速解交聯(lián)而解 離，藥物快速釋放出來(lái)，從而產(chǎn)生高效治療作用；
【附圖說(shuō)明】 圖1是PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe兩親三嵌段聚合物的合成路線圖； 圖2是PEG-pGlu (EDA-LA) -PPhe載藥交聯(lián)膠束的制備及其在細(xì)胞內(nèi)還原響應(yīng)性藥物釋 放過程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：
[0034] 實(shí)施例一，合成聚合物 PEG-pGlu (EDA-LA) -PPhe2。(DP = 10, PEG :Mn = 5kDa)
[0035] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將CH30-PEG-NH2(0. 3g，0. 06mmo)溶于干燥DMF(3mL)中，向其中 加入BLG-NCA(189. 4mg，0. 72mmol)，將體系升溫至35