一種利用苯乙烯?異戊二烯?苯乙烯嵌段共聚物（sis）固定化微生物細(xì)胞的方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用苯乙烯?異戊二烯?苯乙烯嵌段共聚物（SIS）固定化微生物細(xì)胞的方法及應(yīng)用。本發(fā)明以SIS為原料，通過環(huán)氧化反應(yīng)制備改性SIS材料，以改性SIS為載體采用包埋法制備固定化細(xì)胞，并利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化精氨酸為L?鳥氨酸。本發(fā)明工藝簡單，固定化細(xì)胞壽命長，采用本發(fā)明生產(chǎn)L?鳥氨酸，轉(zhuǎn)化液中L?鳥氨酸的含量為20?60g/l，精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)到98.5%。
【專利說明】
一種利用苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物細(xì)胞的方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物細(xì)胞的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段聚合物(SIS)是一種熱塑性彈性體，可以作為親膚性經(jīng)皮給藥機(jī)制，具有高彈性、高強(qiáng)度、無毒害的特點(diǎn)。又因其不易被微生物分解，用于固定化細(xì)胞，可以延長固定化細(xì)胞壽命。
[0003]L-鳥氨酸主要用于制備保肝、護(hù)肝、治療肝病、抗疲勞、抗虛弱等各種復(fù)方氨基酸輸液，并因其多功能的保健作用而引起世人的特別關(guān)注。目前各國市場上L-鳥氨酸的絕大部分市場份額被日本占據(jù)，其主要的生產(chǎn)廠家為味之素、田道制藥和協(xié)和發(fā)酵等3家。國內(nèi)有少數(shù)幾家生產(chǎn)，且均采用化學(xué)法制備，生產(chǎn)規(guī)模均有待擴(kuò)大，L-鳥氨酸的發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)目前在國內(nèi)尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，離工業(yè)化還有很長的路要走。鑒于L-鳥氨酸在國內(nèi)外市場的供需狀況及發(fā)展民族氨基酸產(chǎn)業(yè)的需要，微生物酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)鳥氨酸研究具有重大的經(jīng)濟(jì)意義和理論。
[0004]現(xiàn)有制備L-鳥氨酸的方法，主要有提取法，化學(xué)法，微生物發(fā)酵法和酶法。酶法是利用動植物或微生物體內(nèi)的精氨酸酶作催化劑，水解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素。酶法生產(chǎn)L-鳥氨酸專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，避免采用氰化氫等有毒化學(xué)品，同時底物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品較純，有利于后續(xù)分離，焦慶才等通過固定化L-精氨酸酶生產(chǎn)L-鳥氨酸，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到95%。張鵬等利用糞腸球菌體內(nèi)的精氨酸酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥氨酸，最高產(chǎn)量達(dá)112 g/Ι，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.5%。專利CN 101691555 B中利用海藻酸鈉固定化蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)L-鳥氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.5%。以上方法雖然精氨酸轉(zhuǎn)化率較高，但是得到的固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度還有待提尚O
[0005]本發(fā)明以SIS為原料，通過環(huán)氧化反應(yīng)制備改性SIS材料，以改性SIS為載體采用包埋法制備固定化細(xì)胞，并利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化精氨酸為L-鳥氨酸。本發(fā)明工藝簡單，固定化細(xì)胞壽命長，采用本發(fā)明生產(chǎn)L-鳥氨酸，轉(zhuǎn)化液中L-鳥氨酸的含量為20-60g/l，精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)到98.51%。
[0006]與公知技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)與其他培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明所使用的方法采用的材料為高分子材料，具有高彈性、高強(qiáng)度、無毒害的特點(diǎn)。又因其不易被微生物分解，用于固定化細(xì)胞，可以延長固定化細(xì)胞壽命。
[0007](2)本發(fā)明所使用的固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)L-鳥氨酸的方法減少了生產(chǎn)步驟，降低了成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的固定化材料苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物固定化微生物細(xì)胞，利用具有高精氨酸酶活性的蘇云金芽孢桿菌，制備固定化細(xì)胞，并加入含有精氨酸的轉(zhuǎn)化液中，以此獲得L-鳥氨酸，實(shí)現(xiàn)L-鳥氨酸的連續(xù)生產(chǎn)，大大縮短了時間，降低了成本。
[0009]本發(fā)明方法包括以下幾個步驟:
1、SIS的改性:配置15wt°/c^SIS甲苯溶液，室溫攪拌20min，制備均勻反應(yīng)溶液。在40 °C下加入1ml甲酸，攪拌0.5h。再緩慢加入1ml雙氧水，反應(yīng)結(jié)束后洗滌至中性，旋蒸除去甲苯。
[0010]2、發(fā)酵獲得菌體:取原始菌株制備菌懸液，加入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)。種子液按2%接種量接種至發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基裝液量為有效容積的60%，培養(yǎng)溫度32°C，罐壓0.04MPa，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，發(fā)酵20h，離心，得菌體。
[0011 ] 3、固定化細(xì)胞制備:在500C下迅速加入一定量菌體，充分?jǐn)嚢杈鶆?，降至室溫，將?xì)胞切成2_5mm的立方體，備用。
[0012]4、轉(zhuǎn)化:將制備的固定化細(xì)胞投入含有精氨酸濃度為40-60g/L，pH保持在10.0-10.5，28-32°(:，160-180印111的條件下轉(zhuǎn)化2411，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法即得轉(zhuǎn)化液中L-鳥氨酸含量。
[0013]
具體實(shí)施例
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。下述實(shí)施例中的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0015]實(shí)施例1
利用本發(fā)明中所述方法，生產(chǎn)L-鳥氨酸的操作工藝如下:
1、種子液培養(yǎng)
取原始菌種制備成菌懸液，液體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm條件下培養(yǎng)24h備用。
[0016]2、發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按2%的接種量接種至發(fā)酵罐中，罐中培養(yǎng)基裝液量為有效容積I的60%，在320C，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，罐壓0.04MPa條件下發(fā)酵20h。發(fā)酵液于4000rpm下離心，得菌體。
[0017]3、固定化載體制備
配置15wt°/c^ SIS甲苯溶液，室溫下攪拌20min，在40 °C下加入I Oml甲酸，攪拌0.5h，再緩慢加入1ml雙氧水，使反應(yīng)充分。反應(yīng)結(jié)束后洗滌至中性，加熱旋蒸除去甲苯，將至室溫，加入無水乙醇得白色膠裝物質(zhì)。
[0018]4、固定化細(xì)胞制備
將上一步獲得的固定化載體加熱至50°C，加入5g菌體，充分?jǐn)嚢?、冷卻后得固定化細(xì)胞，裁剪成邊長為2.5mm大小的塊狀，備用。
[0019]5、固定化細(xì)胞制備
將固定化細(xì)胞投入含有精氨酸濃度為50g/L，pH保持在10.2的轉(zhuǎn)化液中，在30 °C，170r/min的條件下轉(zhuǎn)化24h，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法測得轉(zhuǎn)化液中精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98.5%。
[0020]
實(shí)施例2
利用本發(fā)明中所述方法，生產(chǎn)L-鳥氨酸的操作工藝如下:
1、種子液培養(yǎng)
取原始菌種制備成菌懸液，液體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm條件下培養(yǎng)24h備用。
[0021]2、發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按2%的接種量接種至發(fā)酵罐中，罐中培養(yǎng)基裝液量為有效容積I的60%，在320C，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，罐壓0.04MPa條件下發(fā)酵20h。發(fā)酵液于4000rpm下離心，得菌體。
[0022]3、固定化載體制備
配置20wt°/c^ SIS甲苯溶液，室溫下攪拌20min，在40 °C下加入I Oml甲酸，攪拌0.5h，再緩慢加入1ml雙氧水，使反應(yīng)充分。反應(yīng)結(jié)束后洗滌至中性，加熱旋蒸除去甲苯，將至室溫，加入無水乙醇得白色膠裝物質(zhì)。
[0023]4、固定化細(xì)胞制備
將上一步獲得的固定化載體加熱至500C，加入1g菌體，充分?jǐn)嚢?、冷卻后得固定化細(xì)胞，裁剪成邊長為3mm大小的塊狀，備用。
[0024]5、固定化細(xì)胞制備
將固定化細(xì)胞投入含有精氨酸濃度為50g/L，pH保持在10.2的轉(zhuǎn)化液中，在30 °C，170r/min的條件下轉(zhuǎn)化24h，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法測得轉(zhuǎn)化液中精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96.32%。
[0025]
實(shí)施例3
利用本發(fā)明中所述方法，生產(chǎn)L-鳥氨酸的操作工藝如下:
1、種子液培養(yǎng)
取原始菌種制備成菌懸液，液體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L,MgS04-7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm條件下培養(yǎng)24h備用。
[0026]2、發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按2%的接種量接種至發(fā)酵罐中，罐中培養(yǎng)基裝液量為有效容積I的60%，在320C，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，罐壓0.04MPa條件下發(fā)酵20h。發(fā)酵液于4000rpm下離心，得菌體。
[0027]3、固定化載體制備
配置15wt°/c^ SIS甲苯溶液，室溫下攪拌20min，在40 °C下加入15ml甲酸，攪拌0.5h，再緩慢加入15ml雙氧水，使反應(yīng)充分。反應(yīng)結(jié)束后洗滌至中性，加熱旋蒸除去甲苯，將至室溫，加入無水乙醇得白色膠裝物質(zhì)。
[0028]4、固定化細(xì)胞制備
將上一步獲得的固定化載體加熱至500C，加入1g菌體，充分?jǐn)嚢?、冷卻后得固定化細(xì)胞，裁剪成邊長為4mm大小的塊狀，備用。
[0029]5、轉(zhuǎn)化
將固定化細(xì)胞投入含有精氨酸濃度為50g/L，pH保持在10.2的轉(zhuǎn)化液中，在30 °C，170r/min的條件下轉(zhuǎn)化24h，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法測得轉(zhuǎn)化液中精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95.63%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.本發(fā)明提供了一種利用苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物細(xì)胞的方法及應(yīng)用，其特征在于，包括: (1)將SIS環(huán)氧化得到改性的SI S材料； (2)將菌種制備成菌懸液，接入至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子液;接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束離心得到菌體； (3 )菌體與改性的SI S共混、冷卻、成型，得到固定化細(xì)胞； (4)利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化精氨酸為L-鳥氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，固定化載體為苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)環(huán)氧化改性材料。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，改性SIS與菌體共混比例為1-10:1，冷卻后切割成邊長為2-5mm的立方體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，固定化細(xì)胞為蘇云金芽孢桿菌，轉(zhuǎn)化條件為精氨酸含量40-60g/L，pH10.0-10.5，28-32 °C，160_180rpm，24h ；最終得轉(zhuǎn)化率達(dá)98.5%。
【文檔編號】C12N11/08GK106086100SQ201610558826
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月17日
【發(fā)明人】張鵬, 劉玉龍, 陳毅明, 侯玉慶, 劉彥宏
【申請人】北京化工大學(xué)