一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，包括以下步驟：將松杉靈芝母種制作成液體菌種，接入人參或西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)中進(jìn)行發(fā)酵，得到含有稀有人參皂苷的菌質(zhì)；其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1:(18?22)。本發(fā)明提供一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，將藥用菌和中藥通過發(fā)酵進(jìn)行結(jié)合，得到發(fā)酵菌質(zhì)，具有發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境要求不苛刻、操作容易等優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)化應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)開發(fā)。產(chǎn)物菌質(zhì)中含有稀有人參皂苷Rg3、Rk1、Rg5、C?K，同時(shí)，也為松杉靈芝的開發(fā)利用提供新的思路、新方法。
【專利說明】
-種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂昔的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到 稀有人參皂巧的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參（Panax ginseng)為五加科植物人參的干燥根，作為珍貴藥材，具有大補(bǔ)元 氣、復(fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺之功效。西洋參(學(xué)名:Panax quinquefolius)是五加科人參屬多年 生草本植物，別名花旗參、洋參、西洋人參?？蒞補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津;用于氣虛陰虧、內(nèi)熱、 咳喘疲血、虛熱煩倦、消渴、口燥喉干。
[0003] 人參皂巧是由糖和巧元相連而成的糖巧類化合物，屬于=祗類皂巧，是人參的主 要活性成分之一，按其皂巧元結(jié)構(gòu)分為=種類型：分別是齊墳果燒型、四環(huán)=祗皂巧、五環(huán) =祗皂巧，齊墳果燒皂巧元為齊墳果酸；另兩類是達(dá)瑪燒型，在人參皂巧中占大多數(shù)。人參 皂巧可W在人體內(nèi)被代謝為多種稀有皂巧。經(jīng)研究證明，稀有人參皂巧對(duì)于細(xì)胞調(diào)亡的保 護(hù)、逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥、通過調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性及糖皮質(zhì)激素樣受體作用和抑制腫瘤 細(xì)胞的增殖等都具有很好的療效。
[0004] 目前，在生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域中，對(duì)人參皂巧轉(zhuǎn)化主要通過皂巧酶和微生物發(fā)酵。其 中，酶轉(zhuǎn)化需要進(jìn)行酶制備并對(duì)底物要求較高;而微生物發(fā)酵研究較多的是腸道厭氧菌、參 地分離菌及病原菌等，底料一般要求單體人參皂巧，成本昂貴。
[0005] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方 法，W解決現(xiàn)有稀有人參皂巧的獲取過程中底物要求高、成本高、操作復(fù)雜的問題;所述的 利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，將藥用菌和中藥通過發(fā)酵進(jìn)行結(jié)合，得 到發(fā)酵菌質(zhì)；具有發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境要求不苛刻、操作容易等優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)化應(yīng)用 和產(chǎn)業(yè)開發(fā)。產(chǎn)物菌質(zhì)中含有稀有人參皂巧Rg3、Rkl、Rg5、C-K。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術(shù)方案：
[000引一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，包括W下步驟：
[0009] 將松杉靈芝母種制作成液體菌種，接入五加科人參屬的水提液發(fā)酵基質(zhì)中進(jìn)行發(fā) 酵，得到含有稀有人參皂巧的菌質(zhì)；
[0010] 其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1: (18-22)。
[0011] 松杉靈芝為我國(guó)傳統(tǒng)藥用真菌，又名松杉樹芝、鐵杉樹芝、木靈芝，屬靈芝科靈芝 屬，主要生長(zhǎng)于海拔700-1400m紅松闊葉混交林、針葉混交林內(nèi)的冷杉、落葉松、紅松、云杉 的伐根、腐木上，是一種極為稀少的珍貴草藥，主要分布在我國(guó)寒溫帶地區(qū)。松杉靈芝營(yíng)養(yǎng) 成分豐富，含有人體必需的氨基酸、核巧、微量元素、維生素、生物活性多糖、=祗類化合物、 生物堿等，同時(shí)還是維護(hù)人體健康所必須的膳食纖維的良好來源。
[0012] 目前，對(duì)于松杉靈芝的研究多為子實(shí)體培養(yǎng)為目的。而本發(fā)明提供的利用松杉靈 芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，將松杉靈芝和人參、西洋參進(jìn)行結(jié)合，采用松杉靈芝 在發(fā)酵過程中對(duì)于五加科人參屬中的人參皂巧進(jìn)行生物體外轉(zhuǎn)化，得到含有稀有人參皂巧 的菌質(zhì)。該菌質(zhì)中含有稀有人參皂巧1^3、1?41、1^5、(：-1(。稀有人參皂巧具有抗腫瘤、益智、免 疫調(diào)節(jié)、抗病毒作用，并且還可W抗腦缺血和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。
[0013] 優(yōu)選的，所述發(fā)酵的方式為采用搖床培養(yǎng)的方式，在200-220轉(zhuǎn)/分下避光培養(yǎng)13- 15天。
[0014] 搖床培養(yǎng)過程中，要求轉(zhuǎn)速適中，松杉靈芝菌絲與水提液發(fā)酵基質(zhì)可W充分接觸， 對(duì)菌絲生長(zhǎng)需要氧氣供應(yīng)充足。避光培養(yǎng)有利于菌體生長(zhǎng)，若采用光照培養(yǎng)，則對(duì)菌絲生長(zhǎng) 有一定抑制作用。
[0015] 優(yōu)選的，所述松杉靈芝母種來自長(zhǎng)白山區(qū)林間枯朽樹干上野生松杉靈芝子實(shí)體。
[0016] 優(yōu)選的，所述二級(jí)液體菌種的制備方法，具體包括W下步驟：
[0017] (1)將松杉靈芝母種接入PDB培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在200-220轉(zhuǎn)/分下避 光培養(yǎng)，得到一級(jí)液體菌種；
[0018] (2)將一級(jí)液體菌種接入二級(jí)菌種培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在200-220轉(zhuǎn)/分 下避光培養(yǎng)，得到二級(jí)液體菌種。
[0019] 將母種接入PDB培養(yǎng)基，進(jìn)行一級(jí)液體菌種培養(yǎng);其中，PDB培養(yǎng)基的組成為：馬鈴 馨200g，葡萄糖20g，酵母粉2g，水lOOOmL。
[0020] 如果是在4°C保存的母種，首先要進(jìn)行平板復(fù)壯，即采用復(fù)合PDA培養(yǎng)基，在22°C條 件下，進(jìn)行暗培養(yǎng)；其中，PDA培養(yǎng)基的組成為：馬鈴馨200g、葡萄糖20g、蛋白腺2g、MgS〇4 2g、K2HP〇4 1.5g、KH2P〇4 1.5g、瓊脂 18g、水 1000血。
[0021 ] -級(jí)液體菌種制作：用復(fù)壯后菌種制作液體菌種，培養(yǎng)基為液體菌種培養(yǎng)基(PDB 培養(yǎng)基），選用250mLS角瓶，裝液量為130mL/瓶，接種3塊經(jīng)打孔器打孔的平板菌種，搖床培 養(yǎng)，200rad/min，24°C暗培養(yǎng)8天;其中，PDB培養(yǎng)基的組成為：馬鈴馨200g、葡萄糖20g、酵母 粉2g、水lOOOmL。
[0022] 將培養(yǎng)好的一級(jí)液體菌種接種于二級(jí)PDB培養(yǎng)基，進(jìn)行二級(jí)液體菌種制作。其中， PDB培養(yǎng)基的組成為:馬鈴馨200g，葡萄糖20g，酵母粉2g，水lOOOmL。
[0023] 二級(jí)液體菌種制作：將培養(yǎng)好的一級(jí)液體菌種接種量接種于二級(jí)液體菌種培養(yǎng) 基，二級(jí)液體菌種培養(yǎng)基選用250mLS角瓶，裝液量為130mL/瓶，接種3mL-級(jí)液體菌種，搖 床培養(yǎng)，200r/min，24°C暗培養(yǎng)6天。
[0024] 將培養(yǎng)好的二級(jí)液體菌種接種于人參和/或西洋參液體發(fā)酵基質(zhì)，進(jìn)行液體發(fā)酵。
[0025] 優(yōu)選的，在步驟(1)中，所述避光培養(yǎng)的溫度為22-24°C，時(shí)間為8-10天；
[00%]和/或，在步驟(2)中，所述避光培養(yǎng)的溫度為22-24°C，時(shí)間為8-10天。
[0027] 優(yōu)選的，所述五加科人參屬的液體發(fā)酵基質(zhì)為人參水提液發(fā)酵基質(zhì)和/或西洋參 水提液發(fā)酵基質(zhì)。
[0028] 人參皂巧是人參、西洋參的主要活性物質(zhì)，目前已分離得到的單體人參皂巧達(dá)70 多種，各皂巧在人參、西洋參中的含量和藥理作用差別較大。人參皂巧Rg3、趾l、Rg5、C-K為 稀有皂巧，是其他二醇型皂巧的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，具有良好的藥理作用。人參、西洋參中都含有可 W轉(zhuǎn)化為稀有人參皂巧的人參皂巧，但是只是人參皂巧的含量不同，其轉(zhuǎn)化后的稀有皂巧 的含量也不同，但是都可W采用松杉靈芝液體發(fā)酵的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0029] 優(yōu)選的，所述人參水提液發(fā)酵基質(zhì)和/或西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)的制備方法，包括 W下步驟：
[0030] 將人參和/或西洋參的參須切段、粉碎、過篩，得到人參粉和/或西洋參粉;將人參 粉和/或西洋參粉加入水中，在95-98°C下水浴提取3-5小時(shí)，然后離屯、、取上清液，得到人參 水提液和/或西洋參水提液;在人參水提液和/或西洋參水提液中加入葡萄糖，然后滅菌，得 到人參水提液發(fā)酵基質(zhì)和/或西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)；
[0031 ]其中，所述葡萄糖和所述人參和/或西洋參水提液的質(zhì)量比為1: (98-102)。
[0032]水提液發(fā)酵基質(zhì)由水提液和葡萄糖共同組成，水提液可W提取出人參根部的有效 的人參皂巧和一些其他成分，而葡萄糖會(huì)為發(fā)酵提供必須的營(yíng)養(yǎng)。
[003；3]優(yōu)選的，所述過篩的目數(shù)為40-80目。
[0034] 更優(yōu)選的，所述過篩的目數(shù)為60目。
[0035] 過篩的粒徑選擇在40-80目，有助于充分提取人參根部的人參皂巧。
[0036] 優(yōu)選的，所述離屯、的轉(zhuǎn)速為8000-10000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為10-15分鐘。
[0037] 更優(yōu)選的，采用離屯、的轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為10分鐘。
[003引優(yōu)選的，所述滅菌的溫度為121 -125 °C，時(shí)間為20-30分鐘。
[0039] 溫度為121-125°C，時(shí)間為20-30分鐘，有助于充分滅菌，防止松杉靈芝發(fā)酵失敗。
[0040] 更優(yōu)選的，滅菌的溫度為12rC，時(shí)間為25分鐘。
[0041 ]液體發(fā)酵基質(zhì)的發(fā)酵條件為搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)條件為20化/min，24°C暗培養(yǎng)15 天，得到含有皂巧的發(fā)酵菌質(zhì)。
[0042] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0043] (1)本發(fā)明提供一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，將藥用菌 和中藥通過發(fā)酵進(jìn)行結(jié)合，得到發(fā)酵菌質(zhì)，具有發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境要求不苛刻、操作容 易等優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)化應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)開發(fā)。產(chǎn)物菌質(zhì)中含有稀有人參皂巧Rg3、Rkl、Rg5、C- K。
[0044] (2)本發(fā)明提供一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，能夠得到 含有稀有人參皂巧1^3、1?山、1^5、(：-1(的菌質(zhì)。
[0045] (3)本發(fā)明提供了一種松杉靈芝菌株開發(fā)利用的新途徑，相對(duì)于傳統(tǒng)領(lǐng)域W獲得 子實(shí)體為目的得栽培用途，W獲得菌絲體、=祗酸為目的的液體培養(yǎng)用途而言，本發(fā)明提供 了一種W獲得人參稀有皂巧為目的松杉靈芝利用途徑，有利于松杉靈芝的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)發(fā) 展。
【附圖說明】
[0046] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，W下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0047] 圖1為高效液相色譜-質(zhì)譜連用檢測(cè)稀有皂巧檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0049] 實(shí)施例1
[0050] 本實(shí)施例提供的松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，包括W下步驟：
[0051] 將松杉靈芝母種制作成二級(jí)液體菌種，接入五加科人參屬的水提液發(fā)酵基質(zhì)中進(jìn) 行發(fā)酵，得到含有稀有人參皂巧的菌質(zhì)；
[0052] 其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1:22。
[0化3]實(shí)施例2
[0054] 本實(shí)施例提供的松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，包括W下步驟：
[0055] 將松杉靈芝母種放入PDB培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在22 °C、200轉(zhuǎn)/分條件下， 避光培養(yǎng)6天，得到一級(jí)液體菌種；
[0056] 將一級(jí)液體菌種接入二級(jí)菌種培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在22°C、200轉(zhuǎn)/分條 件下，避光培養(yǎng)6天，得到二級(jí)液體菌種；
[0057] 將二級(jí)液體菌種接入西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)中，采用搖床培養(yǎng)的方式，在200轉(zhuǎn)/ 分下避光培養(yǎng)13天，得到含有稀有人參皂巧的菌質(zhì)；
[0058] 其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1:18。
[0059] 上述西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)的制備方法具體包括W下步驟：
[0060] 將西洋參的參須粉碎、過80目篩，得到西洋參粉;將西洋參粉加入水中，在98°C下 水浴提取3小時(shí)，然后在8000轉(zhuǎn)/分條件下離屯、，取上清液，得到西洋參水提液;在西洋參水 提液中加入其質(zhì)量1/98的葡萄糖，然后在12rC下滅菌30分鐘，得到西洋參水提液發(fā)酵基 質(zhì)。
[0061] 實(shí)施例3
[0062] 本實(shí)施例提供的松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，包括W下步驟：
[0063] 選取來自長(zhǎng)白山區(qū)林間枯朽樹干上野生松杉靈芝子實(shí)體為松杉靈芝母種，將松杉 靈芝母種放入PDB培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在24°C、220轉(zhuǎn)/分條件下，避光培養(yǎng)8天，得 到一級(jí)液體菌種；
[0064] 將一級(jí)液體菌種級(jí)種到二級(jí)液體菌種培養(yǎng)基，在24°C、210轉(zhuǎn)/分條件下，避光培養(yǎng) 6天，得到二級(jí)液體菌種
[0065] 將二級(jí)液體菌種接入人參水提液發(fā)酵基質(zhì)中，采用搖床培養(yǎng)的方式，在210轉(zhuǎn)/分 下避光培養(yǎng)15天，得到含有稀有人參皂巧的菌質(zhì)；
[0066] 其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1:20。
[0067] 上述人參水提液發(fā)酵基質(zhì)的制備方法具體包括W下步驟：
[0068] 將人參的參須粉碎、過60目篩，得到人參粉;將人參粉加入水中，在95°C下水浴提 取3-5小時(shí)，然后在9000轉(zhuǎn)/分條件下離屯、，取上清液，得到人參水提液;在人參水提液中加 入其質(zhì)量1/102的葡萄糖，然后在125°C下滅菌22分鐘，得到人參水提液發(fā)酵基質(zhì)。
[0069] 實(shí)施例4
[0070] 本實(shí)施例提供的松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，包括W下步驟：
[0071] 選取來自長(zhǎng)白山區(qū)林間枯朽樹干上野生松杉靈芝子實(shí)體為松杉靈芝母種，將松杉 靈芝母種放入PDB培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在23 °C、220轉(zhuǎn)/分條件下，避光培養(yǎng)7天，得 到一級(jí)液體菌種；
[0072] 將一級(jí)液體菌種級(jí)種到二級(jí)液體菌種培養(yǎng)基，在23°C、220轉(zhuǎn)/分條件下，避光培養(yǎng) 7天，得到二級(jí)液體菌種
[0073] 將二級(jí)液體菌種接入人參水提液發(fā)酵基質(zhì)中，采用搖床培養(yǎng)的方式，在220轉(zhuǎn)/分 下避光培養(yǎng)14天，得到含有稀有人參皂巧的菌質(zhì)；
[0074] 其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1:22。
[0075] 上述人參水提液發(fā)酵基質(zhì)的制備方法具體包括W下步驟：
[0076] 將人參的參須粉碎、過80目篩，得到人參粉;將人參粉加入水中，在95°C下水浴提 取4小時(shí)，然后在10000轉(zhuǎn)/分條件下離屯、，取上清液，得到人參水提液;在人參水提液中加入 其質(zhì)量1/100的葡萄糖，然后在12rC下滅菌20分鐘，得到人參水提液發(fā)酵基質(zhì)。
[0077] 實(shí)施例5
[0078] 本實(shí)施例提供的松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，包括W下步驟：
[0079] 選取來自長(zhǎng)白山區(qū)林間枯朽樹干上野生松杉靈芝子實(shí)體為松杉靈芝母種，將松杉 靈芝母種放入PDB培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在22°C、210轉(zhuǎn)/分條件下，避光培養(yǎng)8天，得 到一級(jí)液體菌種；
[0080] 將一級(jí)液體菌種級(jí)種到二級(jí)液體菌種培養(yǎng)基，在24°C、220轉(zhuǎn)/分條件下，避光培養(yǎng) 6天，得到二級(jí)液體菌種
[0081] 將二級(jí)液體菌種接入西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)中，采用搖床培養(yǎng)的方式，在200轉(zhuǎn)/ 分下避光培養(yǎng)15天，得到含有稀有人參皂巧的菌質(zhì)；
[0082] 其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1:20。
[0083] 上述西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)的制備方法具體包括W下步驟：
[0084] 將西洋參的參須粉碎、過80目篩，得到人參粉;將人參粉加入水中，在96°C下水浴 提取4小時(shí)，然后在9000轉(zhuǎn)/分，條件下離屯、，取上清液，得到人參水提液;在人參水提液中加 入其質(zhì)量1/100的葡萄糖，然后在123°C下滅菌25分鐘，得到人參水提液發(fā)酵基質(zhì)。
[0085] 實(shí)驗(yàn)例1高效液相色譜-質(zhì)譜連用檢測(cè)
[0086] 對(duì)實(shí)施例2所提供的發(fā)酵產(chǎn)物-菌質(zhì)樣品進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜連用色譜檢測(cè)， W證明其含有稀有皂巧Rg3、Rkl、Rg5、C-K。
[0087] 供試品制備：將發(fā)酵后得到的產(chǎn)物凍干，粉碎，按lg:50mL甲醇超聲提取30min，過 濾，定容于IOOmL后，提取液經(jīng)10000巧m/min，離屯、IOmin，上清液經(jīng)0.22皿微孔濾膜過濾，即 得供試品溶液。
[008引色譜條件:色譜柱Agilent TC-C18(4.6mmX 250mm，5皿）。流動(dòng)相:0.02%乙酸錠 (w/v)和0.05%。氨水（v/v)水溶液(A)-乙臘（C)。梯度洗脫：Omin~4min，17.5%C;4min~ 9min，17.5%~28.9%C;9min~19min，28.9%~40%C;19min~24min，40%C;24min~ 34min，40%~53.3%C;34min~44min，53.3%~56.6%C;44min~54min，56.6%~95%C; 30min ~35min，95%C。流速：lmL/min。柱溫：35°C。進(jìn)樣體積：10 化。
[0089]質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧離子源化SI),采用負(fù)離子模式;干燥氣流速:8L/min; 霧化氣溫度:350°C ;氣簾氣:35psi ;化合物穩(wěn)定性:100% ;離子阱目標(biāo)離子:m/z900;掃描范 圍:m/z 150~1500;離子阱累積目標(biāo)離子:30000;采集時(shí)間：50ms;自動(dòng)二級(jí)質(zhì)譜；自動(dòng)優(yōu)化 碰撞能量范圍：1 .OV的30%~200% ;碰撞時(shí)間：20ms。
[0090] 檢測(cè)為本申請(qǐng)實(shí)施例2的檢測(cè)圖，結(jié)果如圖1所示。其中，A為標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)圖，B為 發(fā)酵基質(zhì)西洋參須樣品檢測(cè)圖，C為發(fā)酵產(chǎn)物樣品檢測(cè)圖。
[0091] 結(jié)果表明，經(jīng)與標(biāo)品(A)比對(duì)，發(fā)酵產(chǎn)物(C)中含有所測(cè)定的4種皂巧;經(jīng)與發(fā)酵基 質(zhì)樣品(B)比對(duì)，發(fā)酵基質(zhì)樣品中不含所測(cè)定的4種稀有皂巧，發(fā)酵產(chǎn)物中（C)含有所測(cè)定的 4種皂巧;表明發(fā)酵菌質(zhì)含有4種稀有皂巧1^3、1?41、1^5、(：-1(。菌質(zhì)樣品（〇中含有稀有皂巧 尺邑3、341、1^5、(：-1(，其保留時(shí)間與標(biāo)品(4)均相同，因此確定樣品中含有人參皂巧1^3、1?41、 I^5、C-K。
[0092] 實(shí)驗(yàn)例2菌質(zhì)的產(chǎn)量分析
[0093] 將實(shí)施例1-5所得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行離屯、，離屯、的轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分，離屯、的時(shí)間 為10分鐘，測(cè)定菌絲體沉淀質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。并與直接進(jìn)行二級(jí)培養(yǎng)，不接種人參 水提液的松杉靈芝進(jìn)行對(duì)比。
[0094] 表1實(shí)施例1-5發(fā)酵培養(yǎng)基菌絲體產(chǎn)量
[0095]
'[0096]實(shí)驗(yàn)證明，上述方法在發(fā)酵的過程中，并不影響松杉靈芝的產(chǎn)量。相對(duì)于傳統(tǒng)領(lǐng)域 W獲得子實(shí)體為目的得栽培用途，W獲得菌絲體為目的的液體培養(yǎng)用途而言，本發(fā)明提供 了一種W獲得人參稀有皂巧為目的松杉靈芝利用途徑，有利于松杉靈芝的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)發(fā) 展。
[0097] 綜上所述，本發(fā)明提供一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，W 解決現(xiàn)有稀有人參皂巧的獲取底物要求高、成本高、操作復(fù)雜的問題，所述的利用松杉靈芝 液體發(fā)酵得到稀有人參皂巧的方法，將藥用菌和中藥通過發(fā)酵進(jìn)行結(jié)合，得到發(fā)酵菌質(zhì)，具 有發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境要求不苛刻、操作容易等優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)化應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)開發(fā)。產(chǎn) 物菌質(zhì)中含有稀有人參皂巧1^3、1?山、1^5、(：-1(。同時(shí)，也為松杉靈芝的利用提供新的方向。
[0098] 盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的 精神和范圍的情況下可W作出許多其它的更改和修改。因此，運(yùn)意味著在所附權(quán)利要求中 包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有運(yùn)些變化和修改。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將松杉靈芝母種制作成二級(jí)液體菌種，接入五加科人參屬的水提液發(fā)酵基質(zhì)中進(jìn)行發(fā) 酵，得到含有稀有人參皂苷的菌質(zhì)； 其中，所述液體菌種與所述液體發(fā)酵基質(zhì)的體積比為1: (18-22)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述發(fā)酵的方式為采用搖床培養(yǎng)的方式，在200-220轉(zhuǎn)/分下避光培養(yǎng)13-15天。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述松杉靈芝母種來自長(zhǎng)白山區(qū)林間枯朽樹干上野生松杉靈芝子實(shí)體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述二級(jí)液體菌種的制備方法，具體包括以下步驟： (1) 將松杉靈芝母種接入I3DB培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在200-220轉(zhuǎn)/分下避光培 養(yǎng)，得到一級(jí)液體菌種； (2) 將一級(jí)液體菌種接入二級(jí)菌種培養(yǎng)基，采用搖床培養(yǎng)的方式，在200-220轉(zhuǎn)/分下避 光培養(yǎng)，得到二級(jí)液體菌種。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，在步驟(1)中，所述避光培養(yǎng)的溫度為22-24Γ，時(shí)間為8-10天； 和/或； 步驟(2)中，所述避光培養(yǎng)的溫度為22-24°C，時(shí)間為8-10天。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述五加科人參屬的液體發(fā)酵基質(zhì)為人參水提液發(fā)酵基質(zhì)和/或西洋參水提液發(fā)酵基 質(zhì)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述人參水提液發(fā)酵基質(zhì)和/或西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)的制備方法，包括以下步驟： 將人參和/或西洋參的參須粉碎、過篩，得到人參粉和/或西洋參粉;將人參粉和/或西 洋參粉加入水中，在95-98Γ下水浴提取3-5小時(shí)，然后離心、取上清液，得到人參水提液和/ 或西洋參水提液;在人參水提液和/或西洋參水提液中加入葡萄糖，然后滅菌，得到人參水 提液發(fā)酵基質(zhì)和/或西洋參水提液發(fā)酵基質(zhì)； 其中，所述葡萄糖和所述人參和/或西洋參水提液的質(zhì)量比為1: (98-102)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述過篩的目數(shù)為40-80目。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述離心的轉(zhuǎn)速為8000-10000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為10-15分鐘。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用松杉靈芝液體發(fā)酵得到稀有人參皂苷的方法，其特征在 于，所述滅菌的溫度為121-125Γ，時(shí)間為20-30分鐘。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK105925655SQ201610480278
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】閆梅霞, 張瑞, 韓紅祥, 王佳, 王志清, 王英平, 逄世峰, 許世泉
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所