一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷ck的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以二醇組人參皂苷為原料酶催化定向轉(zhuǎn)化生產(chǎn)CK并對其進行分離純化的新工藝。其具體步驟是將人參皂苷二醇組人參皂苷溶解到去離子水并投入發(fā)酵罐中，通N2保護后在線滅菌，然后定量加入復合酶，和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O40·nH2O催化劑，其中Y選自P、Si、Fe或Zn，x為3或4，n為0?30的正整數(shù)，在相應的條件下進行定向轉(zhuǎn)化得到大量的CK產(chǎn)物，收集產(chǎn)物進行純化得到純度為90%以上的CK。在線滅菌條件通N2保護后，121℃，20min。上述的復合酶為果膠酶、纖維二糖酶以不同比例混合酶。本發(fā)明方法產(chǎn)率高，對環(huán)境友好，后處理簡單，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。
【專利說明】
一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷CK的方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷CK的方法，屬于生物化工領域。
【背景技術】
[0002]人參(Ginseng)作為一種中草藥，在亞洲地區(qū)已經(jīng)被使用了數(shù)千年，其主要的功能是強身健體，延年益壽。人參皂苷是人參中標志性活性成分之一，目前從人參的根、葉、莖和花中發(fā)現(xiàn)的人參皂苷有150多種，其中大部分都具有生物活性，包括抗腫瘤、抗衰老、改善記憶、抗炎及保肝等功效。然而在人參中含有的大量天然皂苷(此1、1^1、1^、1?1、1?(1)很難被吸收，需要經(jīng)過腸道微生物進行消化，才能被腸道吸收。研究表明，皂苷被轉(zhuǎn)化成去糖皂苷可以增加其在體內(nèi)的生理學活性。近些年，科學家通過一系列體內(nèi)和體外實驗證明去糖皂苷compoundK(CK)存在多樣的藥用價值，例如抗過敏、抗糖尿病、抗癌、抗炎癥，抗衰老及保肝等效果。由于其具有很高的安全性和疾病治療功能，CK被認為是一種潛在的具有多功能的藥物。
[0003]由于CK具有顯著的藥物活性及易于體內(nèi)吸收等優(yōu)點，而人參中又不存在CK這種稀有皂苷，因此如何利用原始皂苷轉(zhuǎn)化生產(chǎn)CK成為研究重點。目前報道的生產(chǎn)CK的方法主要有酸、堿處理法、高溫裂解法、微生物轉(zhuǎn)化法以及酶生物催化法。但酸、堿處理條件比較苛亥IJ，后處理比較繁瑣，高溫裂解法耗能，對設備等要求高，微生物轉(zhuǎn)化法中大部分微生物屬于厭氧菌，培養(yǎng)條件苛刻等缺點的存在，而由于酶生物催化法具有溫和、高效、專一性、反應條件簡單等特點被認為是目前較理想的生產(chǎn)方式。目前文獻報道的能催化轉(zhuǎn)化生成CK的酶主要有糖苷酶、柚皮苷酶、纖維素酶、果膠酶等。但都是以單一酶形式進行催化反應，催化的原料一般為從中藥材中提取的混合皂苷，催化效率低，不能進行大規(guī)模放大生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷CK的方法。
[0005]本發(fā)明的實現(xiàn)過程如下:
一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷CK的方法，包括如下步驟:將二醇組人參皂苷和緩沖液投入發(fā)酵罐中，并通N2保護，經(jīng)在線滅菌后加入復合酶和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O4Q.IiH2O催化劑，其中Y選自P、S1、FeSZn，xS3S4，r^0_3(^正整數(shù)，在25?60 °C下催化24?120h，最終經(jīng)分離純化得到目標產(chǎn)物。
[0006]上述的二醇組人參皂苷濃度為50?500g/L;所述的緩沖液為磷酸緩沖液或醋酸緩沖液，pH為3?10。
[0007]上述的復合酶為果膠酶、纖維二糖酶以1: 9?9:1酶活比例混合，酶濃度為50?500g/Lo
[0008]上述的分離純化是離心收集沉淀，然后用有機溶劑萃取得到皂苷。
[0009]上述的滅菌溫度為121°C，時間為20min，且加熱前通N2進行保護。
[0010]上述的通N2的流速為發(fā)酵罐有效容積量的50?200%/min，時間I?5min。
[0011 ] 一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷CK的方法，具體包括如下步驟:
(1)原料準備:將含量>85%的二醇組人參皂苷溶解于醋酸或磷酸緩沖液，控制溶液pH為3-10,然后投入全自動發(fā)酵罐中，通犯，通氣流量為50L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min;
(2)復合酶的制備:將果膠酶與纖維二糖酶以1:9?9:1的酶活比例混合，溶解于含0.1?50mM的Zn2+離子的醋酸或磷酸緩沖液中，其中酶的總濃度在50?500g/L之間；
(3)待發(fā)酵罐內(nèi)溫度降至常溫，向發(fā)酵罐內(nèi)投入準備好的復合酶液，和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，n為0-30的正整數(shù)，培養(yǎng)溫度為25?60°C，攪拌速度為100~360rpm/min，在相應的條件下催化反應24?120h;
(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化:將轉(zhuǎn)化液離心過濾后收集沉淀，將沉淀用磷酸緩沖液清洗，再加入水與有機溶液的混合液進行萃取，萃取2?3次后合并收集有機相，減壓濃縮至原體積的1/10?1/20，用制備型的色譜柱進行分離純化。
[0012]上述的有機溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇。
[0013]上述方法得到的目標產(chǎn)物可以利用工業(yè)化色譜柱對目標產(chǎn)物進行精制純化。
[0014]利用上述方法制備的人參皂苷CK作為原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
[0015]本發(fā)明的積極效果:本發(fā)明綜合使用有機酸和雜多酸催化劑，催化效果得到大大提升，利用復合酶的形式對二醇組人參皂苷進行催化水解，大規(guī)模定向生產(chǎn)CK;轉(zhuǎn)化率高，收率高，純化工藝簡單，生產(chǎn)成本低。
【附圖說明】
[0016]圖1為人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化為人參皂苷CK的示意圖；
圖2為人參皂苷CK標準品液相色譜圖；
圖3為本發(fā)明生產(chǎn)得到的人參皂苷CK液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。
[0018]實施例1
將有效容積為100L的全自動發(fā)酵罐中加入體積為60L、pH為5，含IMm Ca2+離子的磷酸緩沖液，再加入3kg的純度為85%的人參皂苷Rbl(雜質(zhì)為其它類型的人參皂苷或者多糖)，通N2，通氣流量為50L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至室溫以下后，加入果膠酶:纖維二糖酶為6: 4的復合酶2kg，和20g雜多酸H3Pffi2O40.5H20。保持發(fā)酵罐溫度為25°C，攪拌速度為200rpm，催化反應96h。反應結束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水:乙酸乙酯為2:5的溶液進行萃取，反復萃取三次，收集有機相萃取液，減壓濃縮至原體積的I/10。用制備柱進行分離純化，得到1.2kg稀有人參皂苷CK，純度為90%。
[0019]對比實例:與上述制備方法類似，不同的是僅使用有機酸或雜多酸，稀有人參皂苷CK粗品僅能得到不足1.0kgo
[0020]實施例2
將有效容積為300L的全自動發(fā)酵罐中加入體積為200L、pH為7，含4mM Ca2+離子的磷酸緩沖液，再加入30kg的純度為90%的人參皂苷Rd(雜質(zhì)為其它類型的人參皂苷或者多糖)，通％，通氣流量為150L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至室溫以下后，加入果膠酶:纖維二糖酶為8: 2的復合酶25kg，和1g雜多酸H4SiW12O4Q.18H20。保持發(fā)酵罐溫度為40°C，攪拌速度為200rpm，催化反應120h。反應結束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水:乙酸乙酯為2:5的溶液進行萃取，反復萃取三次，收集有機相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/15。用制備柱進行分離純化，得到18kg稀有人參皂苷CK，純度為93%。
[0021]實施例3
將有效容積為500L的全自動發(fā)酵罐中加入體積為300L、pH為9，含5mM Ca2+離子的磷酸緩沖液，再加入30kg的純度為95%的人參皂苷Rb2(雜質(zhì)為其它類型的人參皂苷或者多糖)，通％，通氣流量為200L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至室溫以下后，加入果膠酶:纖維二糖酶為9:1的復合酶30kg，和40g雜多酸H3FeW12O4Q.28H20。保持發(fā)酵罐溫度為50°C，攪拌速度為200rpm，催化反應120h。反應結束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水:乙酸乙酯為2:5的溶液進行萃取，反復萃取三次，收集有機相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/15。用制備柱進行分離純化，得到17kg稀有人參皂苷CK，純度為96%。
[0022]實施例4
將有效容積為100L的全自動發(fā)酵罐中加入體積為65L、pH為6，含20mM Ca2+離子的磷酸緩沖液，再加入5kg的純度為95%的人參皂苷Rb3(雜質(zhì)為其它類型的人參皂苷或者多糖)，通％，通氣流量為250L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至室溫以下后，加入果膠酶:纖維二糖酶為5:1的復合酶3kg，和20g雜多酸H3ZnW12O4Q.30H20。保持發(fā)酵罐溫度為45°C，攪拌速度為200rpm，催化反應96h。反應結束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水:乙酸乙酯為2:7的溶液進行萃取，反復萃取三次，收集有機相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/20。用制備柱進行分離純化，得到2.5kg稀有人參皂苷CK，純度為90%。
[0023]實施例5
將有效容積為200L的全自動發(fā)酵罐中加入體積為100L、pH為7，含1mM Ca2+離子的磷酸緩沖液，再加入15kg的純度為90%的人參皂苷Ral (雜質(zhì)為其它類型的人參皂苷或者多糖)，通犯，通氣流量為200L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至室溫以下后，加入果膠酶:纖維二糖酶為9:1的復合酶201^，和5(^雜多酸H3PW12O4Q.5H20。保持發(fā)酵罐溫度為50°C，攪拌速度為200rpm，催化反應120h。反應結束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水:乙酸乙酯為2:5的溶液進行萃取，反復萃取三次，收集有機相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/30。用制備柱進行分離純化，得到7kg稀有人參皂苷CK，純度為95%。
【主權項】
1.一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷CK的方法，其特征在于:將二醇組人參皂苷和緩沖液投入發(fā)酵罐中，并通N2保護，經(jīng)在線滅菌后加入復合酶和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、FeSZn，xS3S4，r^0_3(^正整數(shù)，在25?60 °C下催化24?120h，最終經(jīng)分離純化得到目標產(chǎn)物。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的二醇組人參皂苷濃度為50-500g/L ；所述的緩沖液為磷酸緩沖液或醋酸緩沖液，pH為3~10。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的復合酶為果膠酶、纖維二糖酶以I:9?9:1酶活比例混合，酶濃度為50?500g/L。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的分離純化是離心收集沉淀，然后用有機溶劑萃取得到皂苷。5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的滅菌溫度為121°C，時間為20min，且加熱前通N2進行保護。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述的通他的流速為發(fā)酵罐有效容積量的50 ?200%/min，時間I?5min。7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括如下步驟: (1)原料準備:將含量>85%的二醇組人參皂苷溶解于醋酸或磷酸緩沖液，控制溶液pH為3-10,然后投入全自動發(fā)酵罐中，通犯，通氣流量為50L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min; (2)復合酶的制備:將果膠酶與纖維二糖酶以1:9?9:1的酶活比例混合，溶解于含0.1?50mM的Zn2+離子的醋酸或磷酸緩沖液中，其中酶的總濃度在50?500g/L之間； (3)待發(fā)酵罐內(nèi)溫度降至常溫，向發(fā)酵罐內(nèi)投入準備好的復合酶液，和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，n為0-30的正整數(shù)，培養(yǎng)溫度為25?60°C，攪拌速度為100~360rpm/min，在相應的條件下催化反應24?120h; (4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化:將轉(zhuǎn)化液離心過濾后收集沉淀，將沉淀用磷酸緩沖液清洗，再加入水與有機溶液的混合液進行萃取，萃取2?3次后合并收集有機相，減壓濃縮至原體積的1/10?1/20，用制備型的色譜柱進行分離純化。8.根據(jù)權利要求4或7所述的方法，其特征在于:所述的有機溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇。9.根據(jù)權利要求1至7所述的方法，其特征在于:利用工業(yè)化色譜柱對目標產(chǎn)物進行精制純化。10.利用權利要求1所述方法制備的人參皂苷CK作為原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
【文檔編號】C12P33/20GK105925654SQ201610346277
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】范代娣, 段志廣, 惠俊峰, 米鈺, 馬沛, 朱晨輝, 李偉娜, 馬曉軒
【申請人】西北大學