新芋螺肽、其藥物組合物及用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新芋螺毒素肽、其藥物組合物、其制備方法及用途。本發(fā)明還涉及所述芋螺毒素肽的核酸構(gòu)建體、其表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、以及其融合蛋白。本發(fā)明還涉及一種阻斷乙酰膽堿受體的方法、以及所述芋螺毒素肽的制藥用途。本發(fā)明的新芋螺毒素肽K41JM及其類似物能夠特異地阻斷乙酰膽堿受體(nAChRs)(例如α9α10nAChR)，并且具有治療神經(jīng)痛、癌癥化療、乳腺癌、肺癌、傷口愈合、腦脊髓炎、癲癇、局部缺血等的活性，具有在制備鎮(zhèn)痛藥物、抗癌藥物等，以及神經(jīng)科學(xué)工具藥等方面的良好應(yīng)用前景。
【專利說明】
新芋螺肽、其藥物組合物及用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新芋螺肽、其藥物組合物、其制 備方法及用途。本發(fā)明還涉及所述芋螺肽的類似物。本發(fā)明還涉及一種阻斷煙堿乙酰膽堿 受體（nAChRs)的方法、以及所述芋螺肽的制藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs)是動物界普遍存在的離子通道型受體，從低等的 線蟲到高等的哺乳動物都含有該類受體（Nicke，A. (2004) Learning about structure and function of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Lessons from snails. European journal of biochemistry/FEBS 271，2293)。nAChRs 受體位于神經(jīng)-肌肉（和 /或）神經(jīng)-神經(jīng)接頭的突觸內(nèi)和突觸外，激活多巴胺、去甲腎上腺素、五羥色胺、γ-氨基 丁酸等多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。nAChRs介導(dǎo)眾多中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能，包括學(xué)習(xí)、 記憶、應(yīng)答、鎮(zhèn)痛、感覺信號加工和運(yùn)動控制等，它們具有重要的生理功能和臨床研究意義。 大量研究顯示nAChRs是篩選診:斷和治療一大類重要疾病藥物的關(guān)鍵祀點(diǎn)，這些疾病包括 疼痛、成癮、癌癥、智障、帕金森癥、精神病、抑郁、重癥肌無力等疑難雜癥等。
[0003] nAChRs是由5個(gè)亞基組成的五聚體跨膜蛋白，分為肌肉型和神經(jīng)型兩大類， 其中神經(jīng)型nAChR s異常復(fù)雜，它們由不同的α和β亞基組成異源或同源型的功能性 受體亞型，在脊椎動物中，至少有12個(gè)亞基，SP α 2 - α 10, β 2 - β 4。雖然這些亞型 的藥理學(xué)功能截然不同，但其結(jié)構(gòu)非常相似，極難區(qū)分，以致各個(gè)亞型的生理功能和藥 理學(xué)作用至今尚不很清楚。由于缺乏針對各種亞型的高選擇性配體化合物，要研究和 闡明各種各樣的nAChRs亞型的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能面臨諸多挑戰(zhàn)。因而，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)各個(gè) 亞型的特異性分子探針，將有利于掲示和闡釋它們在生命體內(nèi)的功能，同時(shí)有可能研 發(fā)出針對上述不同疾病的治療藥物（Livett BG，Sandall DW，Keays D，Down J，Gayler KR，Satkunanathan N，Khalil Z. Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholine receptor.Toxicon.2006,48 (7):810-829. Nicke,A.,ffonnacott, S. &Lewis, R. J. Alpha-conotoxins as tools for the elucidation of structure and function of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subtypes. European journal of biochemistry/FEBS 271，2004, 2305-2319. Dani，J. A. &Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annual review of pharmacology and toxicology 2007,47:699-729)〇
[0004] 在神經(jīng)型nAChRs的各種亞型中，a 9 a 10亞型在生物醫(yī)藥領(lǐng)域越來越 備受關(guān)注。研究表明，a9ctl0 nAChR是治療神經(jīng)痛藥物的新靶點(diǎn)（McInt〇Sh，J. M. ；Absalom, N. ；Chebib,M. ；Elgoyhen,A. B. ；Vincler, M. , Alpha9 nicotinic acetylcholine receptors and the treatment of pain.Biochemical pharmacology 2009, 78 (7), 693-702. Satkunanathan, N. ；Livett,B. ；Gayler,K. ；Sandall,D. ；Down, J.； Khalil, Z. , Alpha-conotoxin Vcl. 1 alleviates neuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones. Brain research 2005, 1059 (2)，149-58.)〇 ctM 10 nAChR阻斷劑具有治療神經(jīng)痛、預(yù)防神經(jīng)受傷、和加速受傷神經(jīng)恢復(fù)的功能， 可能是通過免疫機(jī)制發(fā)揮作用（Holtman，J. R. ;Dwoskin，L. P. ;Dowell，C. ;Wala，E. P.; Zhang, Z. ；Crooks, P. A. ；McIntosh, J. M. , The novel small molecule alpha9alphal0 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic.European journal of pharmacology 2011, 670(2-3), 500-8.Zheng,G. ；Zhang,Z. ；Dowell,C.； ffala, E. ；Dwoskin, L. P. ；Holtman, J. R. ；McIntosh, J. M. ；Crooks, P. A. , Discovery of non-peptide, small molecule antagonists of alpha9alphal0 nicotinic acetylcholine receptors as novel analgesics for the treatment of neuropathic and tonic inflammatory pain.Bioorganic&medicinal chemistry letters 2011，21(8)，2476-9)。角化細(xì)胞上的a9al〇 nAChR在傷口愈合的病理生理學(xué)過程中起 著很重要的作用（Chernyavsky，Α· I. ;Arredondo, J. ;Vetter，D. E. ;Grando, S. A.，Central role of alpha9 acetylcholine receptor in coordinating keratinocyte adhesion and motility at the initiation of epithelialization. Experimental cell research 2007,313(16)，3542-55)。新近研究表明，a9nAChR亞基在乳腺癌組織中過表達(dá)，減緩乳 H. , Wang, Y. J. , Chen, L. C. , Chang, Y. J. , Wei, P. L. , Yang, Y. Y. , ffu, C. H. , and Ho, Y. S. (2011)Nicotine-induced human breast cancer cell proliferation attenuated by garcinol through down-regulation of the nicotinic receptor and cyclin D3 proteins.Breast cancer research and treatment 125,73-87. Lee, C. H. , Huang, C. S.，Chen，C. S.，Tu，S. H.，Wang，Y. J.，Chang，Y. J.，Tam，K. W.，Wei，P. L.，Cheng，T. C.，Chu，J. S. , Chen, L. C. , ffu, C. H. , and Ho, Y. S. (2010) Overexpression and activation of the alpha9_nicotinic receptor during tumorigenesis in human breast epithelial cells. Journal of the National Cancer Institute 102,1322-1335)。a 9 亞基變體影 響支氣管細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與增殖，該亞基在肺癌的治療中具有非常重要的意義（Chikova，A.; Grando, S. A. , Naturally occurring variants of human Alpha9nicotinic receptor differentially affect bronchial cell proliferation and transformation. PloS one 2011，6(11)，e27978.)。
[0005] α 9a 10乙酰膽堿受體亞型（α 9a 10 nAChR)最早是因?yàn)槠湓陂蠙於亗鞒錾?經(jīng)纖維和耳蝸毛細(xì)胞之間介導(dǎo)突觸傳導(dǎo)而知名（Elgoyhen，A.B.，and Katz，E. (2012)The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of physiology,Paris 106,47-56)。近來，又發(fā)現(xiàn)ct9ct 10 nAChR存在于腎上腺嗜鉻細(xì)胞，可能調(diào)節(jié)緊張脅 迫反應(yīng)(Colomer, C. , Olivos-Ore, L. A. , Vincent, A. , McIntosh, J. M. , Artalejo, A. R. , and Guerineau, N. C. (2010)Functional characterization of alpha9_containing cholinergic nicotinic receptors in the rat adrenal medulla:implication in stress-induced functional plasticity. The Journal of neuroscience 30, 6732-6742)。此外，α 9和/或a 10轉(zhuǎn)錄本已報(bào)道存在于各種各樣的非神經(jīng)細(xì)胞中，包括 免疫細(xì)胞在內(nèi)。減弱a 9 a 10 nAChR的功能產(chǎn)生有益的效果，如在動物慢性痛（頑固性痛、 神經(jīng)痛）動物模型上可改變免疫功能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果（McIntosh，J. Μ.，Absalom，N.，Chebib， M.,Elgoyhen, A. B. , and Vincler，M. (2009)Alpha9 nicotinic acetylcholine receptors and the treatment of pain. Biochemical pharmacology 78,693_702);在實(shí)驗(yàn)性自身 免疫性腦脊髓炎動物模型上改變免疫功能產(chǎn)生療效（Simard，A. R.，Gan，Y.，St-Pie^e，S ?，Kousari，A.，Patel，V.，Whiteaker，Ρ·，Morley，Β· J.，Lukas，R. J.，and Shi，F(xiàn). D. (2013) Differential modulation of EAE by alpha9*_and beta2*_nicotinic acetylcholine receptors. Immunology and cell biology 91，195-200)。在脊椎動物體內(nèi)，α 9和/或 a 10 亞基或許是乙酰膽堿受體家族中的原始祖先（10, 11 Lipovsek，Μ.，Im，G. J.，F(xiàn)ranchini，L. F. , Pisciottano, F. , Katz, E. , Fuchs, P. A. , and Elgoyhen,A.B. (2012)Phylogenetic differences in calcium permeability of the auditory hair cell cholinergic nicotinic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 4308-4313。Franchini，L.F.，and Elgoyhen，A. B. (2006) Adaptive evolution in mammalian proteins involved in cochlear outer hair cell electromotility. Molecular phylogenetics and evolution 41，622-635) 〇 正因?yàn)槿绱耍?ct 9 ct 10 nAChR是海洋生物芋螺獵食脊椎動物魚類和更原始的無脊椎動物的合理靶標(biāo)。
[0006] α 9 α 10 nAChR參與疼痛信號的傳遞，阻斷α 9 α 10 nAChR的α -芋螺毒素，在 慢性擠壓傷神經(jīng)傷害模型（CCI)上具有鎮(zhèn)痛效果，以ct9ctl0 nAChR為靶點(diǎn)的神經(jīng)痛治 療藥物可通過肌肉注射發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)（Vincler，M. Wittenauer，S. Parker，R. Ellison，M. Olivera,B. M. McIntosh, J. M. Molecular mechanism for analgesia involving specific antagonism of alpha9alphal0 nicotinic acetylcholine receptors.Proc Natl Acad Sci U S A? 2006, 103(47) :17880-4. Holtman, J. R. ；Dwoskin, L P- ;Dowell,C. ；ffala, E. P. ；Zhang, Z. ；Crooks, P. A. ；McIntosh, J. M. , The novel small molecule alpha9alphal0 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic.European journal of pharmacology 2011，670(2-3)，500-8.)，比目前商業(yè)化的〇-(：1'}(1￥11八鎮(zhèn) 痛藥物-奇考諾肽給藥途徑更簡便，奇考諾肽需通過編程泵內(nèi)置于人體內(nèi)直接給藥至 脊髓，給藥途徑很麻煩，該給藥泵非常昂貴，目前僅限于美歐等發(fā)達(dá)國家應(yīng)用，很難在廣 大的發(fā)展中國家使用（Kress HG，Simpson KH，Marchettini P，Ver Donck A，Varrassi G. Intrathecal therapy:what has changed with the introduction of ziconotide. Pain Pract.2009 ；9(5):338-47. Burton Aff, Deer TR, Wallace MS, Rauck RL,Grigsby E.Considerations and methodology for trialing ziconotide. Pain Physician. 2010 ； 13(1) :23-33. Wallace MS, Rauck RL，Deer T. Ziconotide combination intrathecal therapy:rationale and evidence. Clin J Pain. 2010 ;26 (7):635-44)〇
[0007] 據(jù)調(diào)查，疼痛影響1/6的人群，包括關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛、腫痛。其中神經(jīng)痛影響4-8% 的人群。現(xiàn)有治療神經(jīng)痛的方法，主要是局部麻醉用藥，來阻斷由于外周神經(jīng)、神經(jīng)叢、背根 神經(jīng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生的疼痛信號。但這些治療只能短時(shí)間有鎮(zhèn)痛效果，但并不能根治 神經(jīng)痛。很多疾病都會引起神經(jīng)痛，包括癌癥與癌癥化療、酒精中毒、坐骨神經(jīng)痛、糖尿病、 三叉神經(jīng)痛、硬化癥、帶狀皰疹、機(jī)械傷和手術(shù)傷、艾滋病、頭部神經(jīng)癱瘓、藥物中毒、工業(yè)污 染中毒、淋巴神經(jīng)痛、骨髓瘤、多點(diǎn)運(yùn)動神經(jīng)痛、慢性先天性感覺神經(jīng)病、急性劇烈自發(fā)性神 經(jīng)痛、擠壓神經(jīng)痛、脈管炎（血管炎）/局部缺血、尿毒癥、兒童膽汁肝臟疾病、慢性呼吸障 礙、復(fù)合神經(jīng)痛、多器官衰竭、膿毒病/膿血癥、肝炎、撲啉癥、維生素缺乏、慢性肝臟病、原 生膽汁硬化、高血脂癥、麻瘋病、萊姆關(guān)節(jié)炎、感覺神經(jīng)束膜炎、過敏癥等。
[0008] 目前，生活在熱帶海洋中的肉食性軟體動物芋螺毒液中產(chǎn)生的毒素（芋螺肽 conop印tide，或稱芋螺毒素 conotoxin)備受關(guān)注。芋螺毒素具有特異結(jié)合動物體內(nèi)各種 離子通道和受體的特殊功能。目前，α*-芋螺毒素更加受到關(guān)注，已被用于系統(tǒng)地研究與 開發(fā)nAChRs各種亞型的特異阻斷劑。
[0009] 芋螺毒素（conopeptide, conotoxin)大多是由7 - 50個(gè)氨基酸殘基組成的、 富含半胱氨酸（Cys)的神經(jīng)肽毒素。芋螺毒素按其前體蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽序列的 相似性，以及半胱氨酸模式，分為不同的基因家族，至今，所有已知的芋螺毒素可分為 18 個(gè)超家族，分別為 A、B、C、D、S、M、II、12、13、J、L、01、02、03、P、T、V、Y(Kaas Q，Yu R, Jin AH, Dutertre S, Craik DJ(2012)ConoServer:updated content, knowledge, and discovery tools in the conopeptide database. Nucleic Acids Res 40:D325-330. Sulan Luo, Sean Christensen, Dongting Zhangsun, Yong ffu,Yuanyan Hu, Xiaopeng Zhu, Sandeep Chhabra, Raymond S. Norton, and J. Michael McIntosh. A Novel Inhibitor of a 9 a 10 Nicotinic Acetylcholine Receptors from Conus vexillum Delineates a New Conotoxin Superfamily· PLoS ONE, 8(1): e54648 (1-10) ,2013)。芋螺毒素（肽）按其受 體靶位可分為α、ω、μ、δ等多種藥理學(xué)家族。其中的α類芋螺毒素 （a *-C〇n〇t〇Xins) 具有阻斷煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs)的功能；不含有半胱氨酸的芋螺毒素肽Conantokins 具有阻斷 N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA 受體，N-methyl-D-aspartic acid receptor， NMDAR)的特殊功能。每個(gè)超家族芋螺毒素根據(jù)受體靶類型，又可分為α、α Α、κΑ(Α_超家 族），ω、δ、κ、μ 〇(〇-超家族），μ、φ、κ Μ(Μ_超家族）等家族（亞型）。
[0010] 近來，α 9 α 10 nAChR在生物醫(yī)藥領(lǐng)域引起了廣泛興趣，新的α 9 α 10 nAChR阻斷 劑是很有價(jià)值的工具藥，可用來研究分析這個(gè)受體亞型的結(jié)構(gòu)與功能，并且還是與該受體 有關(guān)的疾病，如神經(jīng)痛、癌癥化療、乳腺癌、肺癌、傷口愈合、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎等 的潛在治療藥物。
[0011]目前，尚需要開發(fā)新的具有活性的芋螺毒素肽或其代替多肽，特別是序列短，不含 有二硫鍵，人工合成更容易，成本更低的多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，人工合成了一類新的多肽。本發(fā)明人 將這些多肽稱為芋螺毒素肽（芋螺肽），但是盡本發(fā)明人的知識而言，并沒有發(fā)現(xiàn)這些多肽 在天然的芋螺或者其它海洋軟體動物中存在，并且這些多肽不含有半胱氨酸。本發(fā)明人驚 奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新芋螺毒素肽能夠特異性地阻斷乙酰膽堿受體（nAChRs)，特別是對神 經(jīng)痛藥物靶點(diǎn)、乳腺癌、肺癌等的靶點(diǎn)α 9α 10 nAChR的阻斷活性最強(qiáng)，具有在制備鎮(zhèn)痛藥 物或抗癌癥的藥物，以及神經(jīng)科學(xué)工具藥等方面的良好應(yīng)用前景。由此提供了下述發(fā)明：
[0013] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種多肽，其為或者包含一個(gè)或多個(gè)相同或者不同的選自 如下的（1)至（3)中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列：
[0014] (l)SEQ ID N0 :1 - 14中任一序列所示的氨基酸序列；
[0015] (2)與上述（1)所述氨基酸序列至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其 優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少97 %相同的氨基酸序列；或
[0016] (3)被1 一 5個(gè)、優(yōu)選1 一 3個(gè)、更優(yōu)選1 一 2個(gè)、最優(yōu)選1個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失、插入和/或添加而與上述（1)所述序列有所不同的氨基酸序列。
[0017] 其中，SEQ ID N0 :1命名為K41JM，其余為該肽的類似物，命名詳見表1。
[0018] 為了本發(fā)明的一個(gè)目的，兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列之間的相同程度是通過 BLAST2. 0蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢程序（Aaltschul等，1997,核酸研究25 :3389 - 3402)并采用 下列參數(shù)確定的：blastall-p blastp-a4-el〇-E〇-v50〇-b25〇-I[查詢文檔]_d prot_all， 其中-P指程序名稱，_a指將要用到的服務(wù)器數(shù)，-e指期望值，-E指延伸缺口的代價(jià)，-V指 單線描述（one-line description)數(shù)，-b指將要顯示的比對數(shù)，-I指查詢文檔，-d指用于 查詢的數(shù)據(jù)庫。
[0019] 同源多肽的氨基酸序列與SEQ ID N0 :1 - 4中任一氨基酸序列不同之處可能在于 取代、插入、添加和/或缺失了 1或多個(gè)、優(yōu)選1 一 5個(gè)、更優(yōu)選1 一 3個(gè)、尤其優(yōu)選1 一 2 個(gè)、最優(yōu)選1個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，氨基酸改變是性質(zhì)改變較小的變化，即是不會顯著影 響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大約5個(gè)、優(yōu)選 1 一 3個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸 殘基；有多達(dá)大約20 - 25個(gè)殘基的小連接肽；或可通過改變凈電荷或者其它功能而有助 于純化的小延伸如多聚組氨酸片段、抗原表位或結(jié)合區(qū)。
[0020] 保守性取代的例子是在堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸和組氨酸）、酸性氨基酸（谷 氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸 和纈氨酸）、形狀相似的氨基酸（精氨酸和絲氨酸之間）、與半胱氨酸密碼子相差一個(gè)堿 基的氨基酸（半胱氨酸、精氨酸、絲氨酸、色氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）、芳香族氨 基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）和小氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫 氨酸）內(nèi)進(jìn)行的取代。通常不會改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例 如 H. Neurath 和 R. L. Hill，1979,在《蛋白質(zhì)》一書，Academic Press, New York 中描述過。 最常見的替換是 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/ Val,Ser/Gly, Arg/Ser, Cys/Ser, Arg/Cys, Arg/Ala, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/ Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly 等以及反向進(jìn)行的替換。
[0021] 本發(fā)明還包括在本發(fā)明芋螺毒素肽K41JM及其類似物的N-末端和/或C-末端融 合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)已 知，包括連接編碼本發(fā)明肽的編碼序列與編碼所述其它肽/多肽的編碼序列，使它們在同 一讀框中，并且融合多肽的表達(dá)受控于相同的啟動子和終止子。
[0022] 本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽的制備方法，包括下述步驟：
[0023] 1)在多肽合成儀上或者手工方法合成多肽，F(xiàn)moc氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基 為：卩111(3(厶找）、1'1'1:(〇5^)、13111:(1'111'、361'、15^)、013111:(厶8卩）、13〇(3(1^8);或者用七13〇(3多肽合成 方法合成。
[0024] 2)將步驟1)中得到的線性多肽從樹脂上切割下來，并用冰乙醚沉淀和洗滌回收 線性多肽粗品，用制備型反向HPLC C18柱純化。
[0025] 具體地，步驟1)所述多肽合成儀為ABI Prism 433a多肽合成儀；
[0026] 具體地，步驟2)所述制備型反向HPLC C18柱為Vydac制造。
[0027] 本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽，或者 包含本發(fā)明的融合蛋白；可選地，其還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
[0028] 本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外阻斷乙酰膽堿受體的方法，包括使用 有效量的本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽或者融合蛋白的步驟；具體地，所述乙酰膽堿受體是 α 9 α 10乙酰膽堿受體，或其他乙酰膽堿受體亞型。
[0029] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述在體外阻斷乙酰膽堿受體的方法是非治療目的 的。
[0030] 本發(fā)明的再一方面涉及一種確定乙酰膽堿受體亞型的方法，該方法包括將乙酰膽 堿受體亞型與本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽或者融合蛋白進(jìn)行接觸的步驟；具體地，所述方法 為確定乙酰膽堿受體是否是α 9α 10乙酰膽堿受體。當(dāng)芋螺肽K41JM或其類似物在低濃度 下能夠特異阻斷α 9 α 10乙酰膽堿受體時(shí)，則推斷該乙酰膽堿受體是α 9 α 10亞型的乙酰 膽堿受體。
[0031] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽或者融合蛋白用于阻斷乙酰膽 堿受體的用途；具體地，所述乙酰膽堿受體是α 9 α 10乙酰膽堿受體，或其他乙酰膽堿受體 亞型。
[0032] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽或者融合蛋白在制備阻斷乙酰 膽堿受體的藥物或試劑中的用途；具體地，所述乙酰膽堿受體是α 9α 10乙酰膽堿受體。
[0033] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽或者融合蛋白在制備治療和/ 或預(yù)防和/或輔助治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如神經(jīng)痛、成癮、帕金森癥、癲癇癥、局部缺血、興奮 性神經(jīng)元細(xì)胞死亡、癡呆、乳腺癌、肺癌、腦脊髓炎，或者制備治療傷口愈合或者鎮(zhèn)痛的藥物 中的用途；具體地，所述神經(jīng)痛由如下因素中的一種或多種導(dǎo)致：癌癥與癌癥化療、酒精中 毒、坐骨神經(jīng)痛、糖尿病、三叉神經(jīng)痛、硬化癥、帶狀皰疹、機(jī)械傷和手術(shù)傷、艾滋病、頭部神 經(jīng)癱瘓、藥物中毒、工業(yè)污染中毒、淋巴神經(jīng)痛、骨髓瘤、多點(diǎn)運(yùn)動神經(jīng)痛、慢性先天性感覺 神經(jīng)病、急性劇烈自發(fā)性神經(jīng)痛、擠壓神經(jīng)痛、脈管炎、血管炎、局部缺血、尿毒癥、兒童膽汁 肝臟疾病、慢性呼吸障礙、復(fù)合神經(jīng)痛、多器官衰竭、膿毒病/膿血癥、肝炎、撲啉癥、維生素 缺乏、慢性肝臟病、原生膽汁硬化、高血脂癥、麻瘋病、萊姆關(guān)節(jié)炎、感覺神經(jīng)束膜炎或過敏 癥。
[0034] 本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防和/或輔助治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如 神經(jīng)痛、成癮、帕金森癥、癲癇癥、局部缺血、興奮性神經(jīng)元細(xì)胞死亡、癡呆、乳腺癌、肺癌、腦 脊髓炎，或者治療傷口愈合或者鎮(zhèn)痛的方法，包括給予有效量的本發(fā)明的多肽（芋螺肽或 其類似物）或者融合蛋白或者本發(fā)明的藥物組合物的步驟；具體地，所述神經(jīng)痛由如下原 因?qū)е拢喊┌Y與癌癥化療、酒精中毒、坐骨神經(jīng)痛、糖尿病、三叉神經(jīng)痛、硬化癥、帶狀皰疹、 機(jī)械傷和手術(shù)傷、艾滋病、頭部神經(jīng)癱瘓、藥物中毒、工業(yè)污染中毒、淋巴神經(jīng)痛、骨髓瘤、多 點(diǎn)運(yùn)動神經(jīng)痛、慢性先天性感覺神經(jīng)病、急性劇烈自發(fā)性神經(jīng)痛、擠壓神經(jīng)痛、脈管炎、血管 炎、局部缺血、尿毒癥、兒童膽汁肝臟疾病、慢性呼吸障礙、復(fù)合神經(jīng)痛、多器官衰竭、膿毒病 /膿血癥、肝炎、撲啉癥、維生素缺乏、慢性肝臟病、原生膽汁硬化、高血脂癥、麻瘋病、萊姆關(guān) 節(jié)炎、感覺神經(jīng)束膜炎或過敏癥。
[0035] 具體地，所述腦脊髓炎是自身免疫性腦脊髓炎，更具體地，是實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦 脊髓炎。
[0036] 本發(fā)明的芋螺毒素肽可通過結(jié)合α 9α 10乙酰膽堿受體（nAChR)發(fā)揮作用，具有 鎮(zhèn)痛活性?？蓱?yīng)用于研究、診斷和治療神經(jīng)痛、乳腺癌、肺癌、腦脊髓炎等多種疾病、以及作 為有用的分子探針用于研究等方面。不同的α類芋螺毒素對脊椎動物受體的親和性不同， 有時(shí)相差幾個(gè)數(shù)量級。這種種系間的差異使得α類芋螺毒素可作為有用的探針用于研究 脊椎動物nAChR的種系發(fā)生，可作為分子探針來確定nAchR的不同亞型，及其結(jié)構(gòu)與功能。 它們是新藥開發(fā)的候選藥物、先導(dǎo)藥物和治療藥物。
[0037] 下面給出了本發(fā)明涉及的術(shù)語的解釋。
[0038] 神經(jīng)痛
[0039] 本發(fā)明所述多肽涉及到治療各種神經(jīng)痛的用途。神經(jīng)痛是周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)原 發(fā)或繼發(fā)性損害或功能障礙或短暫紊亂引起的疼痛，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺超敏、痛覺過 敏等。很多疾病都會引起神經(jīng)痛，包括癌癥與癌癥化療、酒精中毒、坐骨神經(jīng)痛、糖尿病、三 叉神經(jīng)痛、硬化癥、帶狀皰疹、機(jī)械傷和手術(shù)傷、艾滋病、頭部神經(jīng)癱瘓、藥物中毒、工業(yè)污染 中毒、淋巴神經(jīng)痛、骨髓瘤、多點(diǎn)運(yùn)動神經(jīng)痛、慢性先天性感覺神經(jīng)病、急性劇烈自發(fā)性神經(jīng) 痛、擠壓神經(jīng)痛、脈管炎（血管炎）/局部缺血、尿毒癥、兒童膽汁肝臟疾病、慢性呼吸障礙、 復(fù)合神經(jīng)痛、多器官衰竭、膿毒病/膿血癥、肝炎、撲啉癥、維生素缺乏、慢性肝臟病、原生膽 汁硬化、高血脂癥、麻瘋病、萊姆關(guān)節(jié)炎、感覺神經(jīng)束膜炎、過敏癥等。
[0040] 藥物組合物
[0041] 本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明肽和藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑的藥物組合物。所述 藥物組合物可用于研究、診斷、緩解或治療與神經(jīng)痛、乳腺癌、肺癌、智障、成癮、疼痛、帕金 森癥、精神病、抑郁、重癥肌無力、癲癇癥、局部缺血等有關(guān)的疾病或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案 中，含有治療有效量的本發(fā)明肽的藥物組合物以利于藥用的方式配制和給藥，并需考慮到 個(gè)體病人的臨床狀況、運(yùn)送位點(diǎn)、給藥方法、給藥日程安排和醫(yī)生已知的其它因素。因此用 于本文目的的"有效量"由這些方面的考慮決定。
[0042] 含治療有效量的本發(fā)明多肽的藥物組合物非腸道給藥、口服、腦池內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給 藥等。"藥學(xué)可接受載體"指無毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋液、膠囊材料或任何類 型的配方輔助物。本文所用術(shù)語"非腸道的"表示的給藥方式包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、 胸骨內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。本發(fā)明多肽還可通過緩釋系統(tǒng)恰當(dāng)?shù)亟o藥。
[0043] 本發(fā)明還涉及特異阻斷nAChRs受體的藥物組合物。
[0044] 可應(yīng)用本發(fā)明的芋螺毒素肽作為有用的探針來用于研究動物nAChRs的種系發(fā) 生；作為分子探針來確定nAChRs的不同亞型；作為分子模型，設(shè)計(jì)新藥；作為研究、診斷神 經(jīng)性疾病如帕金森氏病、行動障礙、精神分裂癥、癲癇癥、局部缺血等的工具藥和治療藥物； 治療神經(jīng)痛、成癮、乳腺癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、腦脊髓炎、癲癇癥、局部缺血等的侯選藥物。
[0045] 發(fā)明的有益效果
[0046] 本發(fā)明的芋螺毒素肽能夠特異地阻斷乙酰膽堿受體（nAChRs)，并且具鎮(zhèn)痛活性和 抑制乳腺癌和肺癌細(xì)胞生長的功效，以及治療腦脊髓炎、癲癇癥、局部缺血等的功效。
【附圖說明】
[0047] 注：若圖中沒有標(biāo)明的各種nAChRs受體的亞型來源，均為大鼠的相應(yīng)受體，圖注 和圖中對大鼠的受體類型來源進(jìn)行省略。
[0048] 圖1 :10 μ M K41JM對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響I情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡（~ 0nA)，Ach脈沖時(shí)間為Is ;縱坐標(biāo)是電流大小，單位為nA，橫坐標(biāo)為累計(jì)時(shí)間，單位為ms，溫 育前后每相鄰2個(gè)電流軌跡之間相隔時(shí)間為60s。10 μΜ K41JM完全阻斷了 α 9α 10 nAChR 電流，且洗脫速度很快。
[0049] 圖2. K41JM對大鼠 α 9 α 10 nAChR的濃度劑量反應(yīng)曲線。橫坐標(biāo)為所用多肽的摩 爾濃度（M)的對數(shù)值；縱坐標(biāo)為劑量反應(yīng)百分?jǐn)?shù)Response)，是相應(yīng)濃度的毒素作用下 乙酰膽堿受體電流與對照電流的比值百分?jǐn)?shù)，每個(gè)劑量反應(yīng)百分?jǐn)?shù)為5 - 6個(gè)非洲爪蟾卵 母細(xì)胞記錄的數(shù)據(jù)平均值（mean)，曲線同時(shí)顯示標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM)。
[0050] 圖3 :10 μ M K41JM對人類α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡（~ OnA), Ach脈沖時(shí)間為Is ;縱坐標(biāo)是電流大小，單位為nA，橫坐標(biāo)為累計(jì)時(shí)間，單位為ms，溫 育前后每相鄰2個(gè)電流軌跡之間相隔時(shí)間為60s。10 μΜ K41JM幾乎完全阻斷了 α 9α 10 nAChR電流，且洗脫速度很快。
[0051] 圖4. K41JM對人類α 9 α 10 nAChR的濃度劑量反應(yīng)曲線。橫坐標(biāo)為所用多肽的摩 爾濃度（M)的對數(shù)值；縱坐標(biāo)為劑量反應(yīng)百分?jǐn)?shù)Response)，是相應(yīng)濃度的毒素作用下 乙酰膽堿受體電流與對照電流的比值百分?jǐn)?shù)，每個(gè)劑量反應(yīng)百分?jǐn)?shù)為4 一 6個(gè)非洲爪蟾卵 母細(xì)胞記錄的數(shù)據(jù)平均值（mean)，曲線同時(shí)顯示標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM)。
[0052] 圖5 :10 μΜ K41JMX1對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μΜ K41JM XI溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡，Ach 脈沖時(shí)間為Is ;縱坐標(biāo)是電流大小，單位為nA，橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位為min，溫育前后每相鄰 2個(gè)電流軌跡之間相隔時(shí)間為60s。下述圖6 - 10的坐標(biāo)和方法與此圖相同。
[0053] 圖6 :10 μΜ K41JM13對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM13溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0054] 圖7 :10 μΜ K41JM19對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM19溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0055] 圖8 :10 μΜ K41JM31對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM31溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0056] 圖9 :10 μΜ K41JM14對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM14溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0057] 圖10 :10 μΜ K41JM28對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM28溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0058] 圖11 :10 μΜ K41JM18對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM18溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0059] 圖12 :10 μΜ K41JM24對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM24溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0060] 圖13 :10 μΜ K41JM X4對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JMX4溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0061] 圖14 :10 μΜ K41JM1對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM1溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0062] 圖15 :10 μΜ K41JM25對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM25溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0063] 圖16 :10 μΜ K41JM23對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM23溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0064] 圖17 :10 μΜ K41JM22對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM22溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0065] 圖18 :10 μΜ K41JM6對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的對 照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM6溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0066] 圖19 :10 μΜ K41JM20對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM20溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0067] 圖20 :10 μΜ K41JM21對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM21溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0068] 圖21 :10 μΜ K41JM30對大鼠 α 9 α 10 nAChR的電流影響情況。圖中"C"是指的 對照電流，箭頭所指的是10 μ M K41JM30溫育5分鐘后，第一個(gè)Ach脈沖形成的電流軌跡。
[0069] 圖22 :每只大鼠給藥劑量為15nmol K41JM時(shí)，在CCI神經(jīng)痛模型上的鎮(zhèn)痛作用。 圖中陰性對照Saline為生理鹽水，大鼠體重范圍250 - 300g。圖中各個(gè)點(diǎn)的縱坐標(biāo)為痛閾 值（PWT)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean土SD)，單位為克（g)。橫坐標(biāo)是給藥后的時(shí)間，單位為小 時(shí)（h)。顯著性差異比較概率為*p〈0. 05，極顯著差異比較概率為**p〈0. 01。
[0070] 圖23 :每只大鼠給藥劑量為20nmol K41JM時(shí)，在CCI神經(jīng)痛模型上的鎮(zhèn)痛作用。 圖中陰性對照Saline為生理鹽水，大鼠體重范圍250 - 300g。圖中各個(gè)點(diǎn)的縱坐標(biāo)為痛閾 值（PWT)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean土SD)，單位為克（g)。橫坐標(biāo)是給藥后的時(shí)間，單位為小 時(shí)（h)。顯著性差異比較概率為*p〈0. 05，極顯著差異比較概率為**p〈0. 01。
【具體實(shí)施方式】
[0071] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0072] 實(shí)施例1 :新的芊螺毒素肽K41TM及其類似物的序列與人工合成
[0073] K41JM及其系列類似物的氨基酸序列和命名見下面的表1。表1中的氨基酸序列 可以委托公司進(jìn)行人工合成，也可以采用下面的方法：
[0074] 采用Fmoc化學(xué)方法人工合成樹脂肽。用reagent K(trifluoroacetic acid/ water/ethanedithiol/phenol/thioanisole ;90:5:2. 5:7. 5:5, v/v/v/v/v)將多肽從樹脂 上切割下來，并用冰乙醚沉淀和洗滌回收線性肽粗品，用制備型反向HPLC C18柱（Vydac) 純化，洗脫線性梯度為在40min內(nèi)10-50% B60.溶劑B是60% ACN(acetonitrile)，40% H20, (λ 92% TFA(trifluoroacetic acid);溶劑A是1% TFA的水溶液。純化后的多肽用分 析型的HPLC C18柱（Vydac)進(jìn)行純度檢測，其純度達(dá)到HPLC色譜檢測單一峰，質(zhì)譜（MS) 檢測也是單一峰，方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0075] 表1.芋螺肽K41JM及其類似物（突變體）的名稱和氨基酸序列
[0078] 注：Hyp 是輕脯氨酸（4-trans hydroxyproline) 〇
[0079] 實(shí)施例2 :太鼠、小鼠和人類nAChRs各種亞塑在非洲爪蟾卵母細(xì)朐中的表迖
[0080] 參照文獻(xiàn)（Azam L，Yoshikami D，McIntosh JM. Amino acid residues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin Mil[S4A, E11A, L15A]. J Biol Chem. 2008 ；283 (17):11625-32.) 中的方法，以及體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion，Austin，TX))說明書，制備各種大鼠神經(jīng)型nAChRs亞型（a 3 β 2，a 6/ a 3β 2β 3? α6/α3β4， a 9 a l〇? a 4β 2? a 4β4? a 3β4? a 2β 2? a 2β4? a 7)、 人類神經(jīng)型nAChRs亞型（a 9 a 10，a 6/ a 3 β 2 β 3，a 7)，以及小鼠和人類肌肉型 nAChRs ( a 1 β 1 δ ε )的CRNA，其濃度用UV 260nm下的0D值進(jìn)行測算。解剖收集非洲爪 蟾（Xenopus laveis)卵母細(xì)胞（蛙卵），將cRNA注射入蛙卵中，每個(gè)亞基的注射量為5ng cRNA。肌肉nAChR每個(gè)亞基注射0. 5-2. 5ng DNA。蛙卵在ND-96中培養(yǎng)。蛙卵收集后的1 一 2天內(nèi)注射cRNA，注射后1 一 4天內(nèi)用于nAChRs的電壓鉗記錄。制得的樣品用于下面的實(shí) 施例。
[0081] 實(shí)施例3 :芊螺肽K41TM陽斷大鼠各種nAChRs亞銦的實(shí)驗(yàn)
[0082] 將1個(gè)注射過cRNA的娃卵置于30 yL的Sylgard記錄槽中（直徑4mmX深度2mm)， 重力灌注含有 〇· lmg/ml BSA (bovine serum albumin)的 ND% 灌流液（96.0mM NaCl，2.0mM KC1, 1. 8mM CaCl2, 1. OmM MgCl2, 5mM HEPES, pH 7· 1 - 7· 5)或含有 ImM atropine 的 ND96(ND96A)，流速為lml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0. lmg/ml BSA以減少毒素的 非特異性吸附，用轉(zhuǎn)換閥（SmartValve，Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA) 可以在灌注毒素或乙酰膽堿（ACh)之間進(jìn)行自由切換，以及一系列三通螺線閥（solenoid valves, model 161T031, Neptune Research, Northboro, ΜΑ)使灌注 ND96 與 ACh 等之間進(jìn) 行自由切換。Ach門控的電流由雙電極電壓箝放大器（model 0C-725B, Warner Instrument Corp., Hamden, CT)設(shè)置在"慢"箝，以及clamp gain在最大值（X2000)位置時(shí)進(jìn)行在線記 錄。用 1mm外徑 X0. 75 內(nèi)徑mm 的玻璃毛細(xì)管（fiber-filled borosilicate capillaries， WPI Inc.，Sarasota，F(xiàn)L)拉制玻璃電極，并充滿3M KC1作為電壓和電流電極。膜電壓箝制 在-70mV.整個(gè)系統(tǒng)均由電腦控制和記錄數(shù)據(jù)。ACh脈沖為每隔5min自動灌注Is的ACh。 ACh的濃度分別為，表達(dá)肌肉型的nAChRs和神經(jīng)型α 9 α 10 nAChRs卵為10 μ Μ ;表達(dá)神經(jīng) 型的nAChRs之α 7為200 μ Μ，其他的亞型都為100 μ Μ。至少記錄4個(gè)卵表達(dá)某個(gè)亞型對 不同毒素濃度的電流反應(yīng)情況，以及電流軌跡。
[0083] 測試的電流數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件（San Diego, CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制劑 量反應(yīng)曲線，計(jì)算芋螺毒素的半阻滯濃度IC5。等多種有關(guān)毒素阻斷nAChRs的各種參數(shù)。
[0084] 結(jié)果表明，10 μΜ K41JM(實(shí)施例1制備）完全阻斷了由Ach門控的大鼠 α 9 α 10 nAChR開放產(chǎn)生的電流，且洗脫很快，阻斷是可逆的（圖1)。它對α 9 α 10 nAChR的半 阻斷劑量IC5。和誤差范圍為167. 5nM(129 - 217nM)(表2,圖2)。K41JM劑量反應(yīng)曲線的 斜率（Hillslope)及誤差范圍為 0. 93 (0. 71 - 1. 15)(表 2,圖 2)。K41JM 對 α 7 和 Mouse α?β?δ ε (肌肉型）亞型具有微弱阻斷活性，其半阻斷劑量Κ5(]>3μΜ，而對其他亞型 在1〇以1高濃度下均沒有阻斷活性，這些亞型包括€130 2，€130 4，€16/€130 20 3，€16/ α3β4，α4β2，α4β4，α2β2，α2β4。因而，K41JM 是 α 9 α 10 nAChR 的高選擇性強(qiáng)阻 斷劑。
[0085] 表2 :K41JM對大鼠（Rat)各種nAChRs亞型的半阻斷劑量IC5。和劑量反應(yīng)曲線的 斜率
[0086]
[0087] 注：a括號中的數(shù)值是置信度為95%的區(qū)間。
[0088] 實(shí)施例4 :芊螺肽K41TM陽斷人類各種nAChRs亞銦的實(shí)驗(yàn)
[0089] 按照實(shí)施例3的方法，檢測了 K41JM對人類（Human)各種nAChRs亞型的阻斷活 性。結(jié)果表明，10 μΜ K41JM(實(shí)施例1制備）幾乎完全阻斷了由Ach門控的人類α 9 α 10 nAChR開放產(chǎn)生的電流，且洗脫很快，阻斷是可逆的（圖3)。它對人類α 9 α 10 nAChR的 半阻斷劑量IC5。和誤差范圍為351. 5nM(249 - 496nM)(表2,圖2)。K41JM對人類α 9α 10 nAChR劑量反應(yīng)曲線的斜率（Hillslope)及誤差范圍為0.83(0. 62 - 1.04)(表3,圖4)。 1(41舅對11€17，11€130 2，11€16/€130203和11€110以￡，（肌肉型）亞型具有很微弱阻斷 活性，其半阻斷劑量IC 5(：> 5 μ M，而在10 μ Μ高濃度下對人類其他亞型均沒有阻斷活性，這 些亞型包括 α3β4, α6/α3β4, α4β2, α4β4, α2β2, α2β4。因而，K41JM 也是人類 α 9α 10 nAChR的高選擇性強(qiáng)阻斷劑，其阻斷活性與大鼠的接近。
[0090] 表3 :K41JM對人類（Human)各種nAChRs亞型的半阻斷劑量IC5。和劑量反應(yīng)曲線 的斜率
[0091]
[0092] 注：a括號中的數(shù)值是置信度為95%的區(qū)間。
[0093] 實(shí)施例5 :芊螺肽K41 TM類似物陽斷大鼠 α 9 α 10 nAChR亞銦的實(shí)驗(yàn)
[0094] 按照實(shí)施例3的方法，發(fā)現(xiàn)了另外13個(gè)K41JM的類似物（表1，SEQ ID NO :2 - 14,實(shí)施例1制備）對大鼠 α 9α 10 nAChR亞型都有阻斷活性。在10 μ Μ濃度下，K41JM 類似物對a9al〇 nAChR亞型都具有很強(qiáng)的阻斷活性。其中特別是K41JMXUK41JM13、 K41JM19、K41JM31、K41JM14、K41JM28、K41JM18、K41JM24(表 1，SEQ ID N0:7 - 14,實(shí)施例 1制備）的活性明顯強(qiáng)于K41JM以及其它的類似物，圖5 - 12分別顯示了 10 μΜ濃度下， 它們對α 9α 10 nAChR亞型阻斷的電流軌跡圖。其它5個(gè)類似物的活性與K41JM相當(dāng)，即 K41JMX4、K41JM1、K41JM25、K41JM23、K41JM22(表 1，SEQ ID N0 :2 - 6,實(shí)施例 1 制備），圖 13 - 17分別顯示了 10 μΜ濃度下，它們對α 9α 10 nAChR亞型阻斷的電流軌跡圖。它們都 是α 9 α 10 nAChR的有效阻斷劑。
[0095] 另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，其余的K41JM的4個(gè)類似物，K41JM6, K41JM20, K41JM21， K41JM30 (表1，SEQ ID N0 :15 - 18,實(shí)施例1制備）對α 9 α 10 nAChR沒有阻斷活性，圖 18 - 21分別顯示了 10 μ Μ濃度下，它們作用于α 9α 10 nAChR亞型的電流軌跡圖。
[0096] 實(shí)施例6 :K41TM的鎮(zhèn)痛活件實(shí)驗(yàn)
[0097] 利用大鼠 CCI神經(jīng)痛模型（坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷模型）測定了 K41JM的鎮(zhèn)痛活性， 結(jié)果顯示其鎮(zhèn)痛活性很強(qiáng)。
[0098] 利用SD (Sprague Dawley)大鼠，制作坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷模型（Chronic Constriction Injury model，CCI模型），用壓力痛覺測試儀（大鼠800G，型號為美國 IITC 2391)測定所試芋螺毒素對神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛活性。SD(Sprague Dawley)大鼠，體重 約250 - 300克。購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，大鼠實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證明許可證號： SCXK (粵）2008-0002 (大小鼠飼料亦購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）。CCI模型的制作參照 Bennett 等（Bennett G J, Xie Y K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man [J]. Pain, 1988, 33 (1) : 87)的方 法。經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉80mg/kg麻醉后，無菌條件下切開右下肢，暴露坐骨神經(jīng)主干， 用4-0鉻制羊腸線松扎四道，間距為1mm，結(jié)扎線的松緊以不影響神經(jīng)外膜的血運(yùn)為度，逐 層縫合。右側(cè)傷口縫合前均在局部涂以青霉素粉劑。術(shù)后腹腔注射青霉素1次/d，8萬單 位/次，連續(xù)3d。大鼠置管前每籠5只，置管后單籠飼養(yǎng)。將初選合格的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表 分成3組。分別在手術(shù)之前、手術(shù)后三天、一周、兩周測大鼠患足和對側(cè)足（左足）的機(jī)械 痛覺刺激值，經(jīng)檢測證明坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷模型（CCI)模型建立成功，可用作篩選神經(jīng) 痛藥物的整體動物模型。
[0099] 建模成功的3組CCI大鼠，分別肌肉注射生理鹽水（第1組）和不同劑量的 K41JM(第2-4組）。給藥劑量分別為每只15nmol和20nmol K41JM。各組肌肉注射給藥后 的痛閾值隨時(shí)間變化的曲線如圖22 - 23所示。
[0100] 每只15nmol K41JM劑量組（圖22)與生理鹽水組痛閾值相比，在給藥后的1 - 6h 內(nèi)都有顯著性差異（P〈〇. 05)，每只20nmol K41JM劑量組（圖23)與生理鹽水組痛閾值相 比，在給藥后的1 一 6h內(nèi)都有極顯著性差異（p〈0. 01)。提示本發(fā)明人所試的K41JM芋螺 肽對大鼠的坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷疼痛有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果，且是通過簡便的肌肉注射發(fā)揮藥 效。
[0101] 盡管本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽，其為或者包含一個(gè)或多個(gè)相同或者不同的選自如下的（1)至（3)中任一 項(xiàng)所述的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO :1 - 14中任一序列所示的氨基酸序列； (2) 與上述（1)所述氨基酸序列至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其優(yōu)選 至少95%、最優(yōu)選至少97 %相同的氨基酸序列；或 (3) 被1 一 5個(gè)、優(yōu)選1 一 3個(gè)、更優(yōu)選1 一 2個(gè)、最優(yōu)選1個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、 插入和/或添加而與上述（1)所述序列有所不同的氨基酸序列。2. -種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1或2所述多肽的氨基酸序列。3. -種核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸。4. 一種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求3所述的核酸構(gòu)建體。5. -種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體。6. -種融合蛋白，其包含權(quán)利要求1所述的多肽。7. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述的多肽，或者包含權(quán)利要求6所述的融 合蛋白；可選地，其還包含藥學(xué)上可接受的輔料。8. 如下的⑴或⑵所述的方法： (1) 一種確定乙酰膽堿受體亞型的方法，包括將乙酰膽堿受體與權(quán)利要求1所述的多 肽或者權(quán)利要求6所述的融合蛋白進(jìn)行接觸的步驟；具體地，所述方法為確定乙酰膽堿受 體是否是α 9 α 10乙酰膽堿受體；或 (2) -種在體內(nèi)或體外阻斷乙酰膽堿受體或者調(diào)節(jié)乙酰膽堿水平的方法，包括使用有 效量的權(quán)利要求1所述的多肽或者權(quán)利要求6所述的融合蛋白的步驟；具體地，所述乙酰膽 堿受體是α 9 α 10乙酰膽堿受體。9. 如下的（1) 一（3)中任一項(xiàng)所述的用途： (1) 權(quán)利要求1所述的多肽或者權(quán)利要求6所述的融合蛋白用于阻斷乙酰膽堿受體的 用途；具體地，所述乙酰膽堿受體是α 9 α 10乙酰膽堿受體； (2) 權(quán)利要求1所述的多肽或者權(quán)利要求6所述的融合蛋白在制備阻斷乙酰膽堿受體 的藥物或試劑中的用途；具體地，所述乙酰膽堿受體是α 9α 10乙酰膽堿受體；或 (3) 權(quán)利要求1所述的多肽或者權(quán)利要求6所述的融合蛋白在制備治療和/或預(yù)防和/ 或輔助治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如神經(jīng)痛、成癮、帕金森癥、癲癇癥、局部缺血、興奮性神經(jīng)元細(xì) 胞死亡、癡呆、乳腺癌、肺癌、腦脊髓炎，或者制備治療傷口愈合或者鎮(zhèn)痛的藥物中的用途； 具體地，所述神經(jīng)痛由如下因素中的一種或多種導(dǎo)致：癌癥與癌癥化療、酒精中毒、坐骨神 經(jīng)痛、糖尿病、三叉神經(jīng)痛、硬化癥、帶狀皰疹、機(jī)械傷和手術(shù)傷、艾滋病、頭部神經(jīng)癱瘓、藥 物中毒、工業(yè)污染中毒、淋巴神經(jīng)痛、骨髓瘤、多點(diǎn)運(yùn)動神經(jīng)痛、慢性先天性感覺神經(jīng)病、急 性劇烈自發(fā)性神經(jīng)痛、擠壓神經(jīng)痛、脈管炎、血管炎、局部缺血、尿毒癥、兒童膽汁肝臟疾病、 慢性呼吸障礙、復(fù)合神經(jīng)痛、多器官衰竭、膿毒病/膿血癥、肝炎、Π 卜啉癥、維生素缺乏、慢性 肝臟病、原生膽汁硬化、高血脂癥、麻瘋病、萊姆關(guān)節(jié)炎、感覺神經(jīng)束膜炎或過敏癥。10. 權(quán)利要求1所述的多肽的制備方法，包括下述步驟： 1)在多肽合成儀上或者手工方法合成線性多肽，F(xiàn)moc氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基 為：卩111(3(厶找）、1'1'1:(〇5^)、13111:(1'111'、361'、15^)、013111:(厶8卩）、13〇(3(1^8);或者用七13〇(3多肽合成 方法合成； 2)將步驟1)中得到的線性多肽從樹脂上切割下來，并用冰乙醚沉淀和洗滌回收線性 多肽粗品，用制備型反向HPLC C18柱純化； 具體地，步驟1)中所述多肽合成儀為ABI Prism 433a多肽合成儀； 具體地，步驟2)中所述制備型反向HPLC C18柱為Vydac制造。
【文檔編號】A61K38/08GK105985410SQ201510081894
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月16日
【發(fā)明人】羅素蘭, 長孫東亭, 朱曉鵬, 吳勇, 胡遠(yuǎn)艷, 李曉丹, J·邁克爾·麥金托什, 戴維·J·克雷克
【申請人】海南大學(xué)