一種分離5(6)-羧基羅丹明異構(gòu)體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用電泳分離5 (6)-羧基羅丹明異構(gòu)體的方法，特別涉及一種利 用瓊脂糖凝膠電泳分離5 (6)-羧基羅丹明異構(gòu)體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光探針在表達(dá)分子間識(shí)別行為，傳遞復(fù)雜生命和環(huán)境體系的內(nèi)部狀態(tài)信息等方 面具有優(yōu)異的性能。羅丹明類(lèi)化合物因其螺環(huán)結(jié)構(gòu)變化伴隨的分子熒光〇ff-〇n轉(zhuǎn)換特性， 被廣泛的應(yīng)用于構(gòu)建熒光探針?lè)肿?。近年?lái)羅丹明基熒光探針的發(fā)展呈現(xiàn)功能化的趨勢(shì)， 其中利用5(6)-羧基羅丹明的底環(huán)(苯環(huán)）羧基衍生化構(gòu)建功能探針?lè)肿拥牟呗砸鹆藦V 泛的關(guān)注（參見(jiàn)圖4)。Yuan 2012，14(2): 432-435)等利用羅丹明底環(huán)羧基 與香豆素連接，構(gòu)建了性能優(yōu)異的比率突光探針。Yan等2012，2(10): 988-998)和 I^nia 等（/7/?〇作?沿ocAe?, 2013，121: 156-166)通過(guò)羅丹明底環(huán)羧基將 革巴向基團(tuán)引入探針?lè)肿?，?gòu)建了革巴向定位探針。Ryan等（泛6? Cb遞《//?，2002，21(18): 2092-2093)將羅丹明底環(huán)羧基與多肽連接，合成了一種可用于酶活性研究的功能探針。以 上工作的特點(diǎn)是利用5 (6)-羧基羅丹明的底環(huán)(苯環(huán)）羧基將功能基團(tuán)組合到探針?lè)肿又校?從而實(shí)現(xiàn)了探針的某種特殊功能。
[0003] 由于5-、6_羧基羅丹明的熒光光譜存在著不可忽視的差異（054? 5bi， 2006，25(2): 147-155)，采用羅丹明底環(huán)羧基衍生化構(gòu)建功能探針?lè)肿訒r(shí)，必須采用異構(gòu) 純的5-羧基羅丹明或6-羧基羅丹明為原料。遺憾的是異構(gòu)純的5-、6_羧基羅丹明并不易 得。按照合成羅丹明類(lèi)化合物的一般方法，采用比鄰苯二甲酸酐多一個(gè)羧基的苯三酸酐與 間氨基酚縮合制備羧基羅丹明時(shí)，只能得到比例接近的5和6位羧基羅丹明異構(gòu)體的混合 物，而且兩種異構(gòu)體的理化性質(zhì)接近，難以用常規(guī)方法進(jìn)行分離2003，5(20): 3675-3677)。因此制備高純度的羧基羅丹明異構(gòu)體，已成為發(fā)展該類(lèi)熒光探針的關(guān)鍵性問(wèn) 題之一。
[0004]目前為了獲得異構(gòu)純的5-、6_羧基羅丹明化合物，主要采用以下幾種方法。方法 一，使用高效制備液相色譜分離5 (6)-羧基羅丹明混合物。這種方法是現(xiàn)在獲得異構(gòu)純羧 基羅丹明的主要方法，但是其成本高，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。方法二，對(duì)合成羧基羅丹明的中間 體一兩種異構(gòu)體混合物進(jìn)行拆分，然后分別用異構(gòu)純中間體進(jìn)行第二步縮合，由此得到 異構(gòu)純羧基羅丹明（Aioco/u?收ate泛￡麗2009，20, 1673-1682)。合成路線見(jiàn)下述的方程 式。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是適用于大規(guī)模生產(chǎn)，但是其異構(gòu)純中間體的產(chǎn)率很低，成本也較高。 方法三，利用柱前衍生法對(duì)5 (6)-羧基羅丹明混合物進(jìn)行分離。這種方法是先將5 (6)-羧 基羅丹明混合物衍生化，增加異構(gòu)體間的結(jié)構(gòu)差異并降低分子極性，然后使用柱色譜進(jìn)行 分離。本申請(qǐng)人曾經(jīng)對(duì)5(6)-羧基羅丹明110混合物采用酯化、柱色譜分離、水解的方法， 成功地實(shí)現(xiàn)了克級(jí)量的異構(gòu)體分離(有機(jī)化學(xué)，2007,27(2): 269-271)。與此類(lèi)似，肖義 等（CN201210080853)將5 (6)-取得羅丹明混合物與水合肼或羥胺反應(yīng)得到5 (6)-取代的 羅丹明螺內(nèi)酰胺混合物，然后柱色譜分離、水解，制備得到5-、6_取代羅丹明異構(gòu)純化合 物。這種方法優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率較高，但是步驟多，操作復(fù)雜。綜上所述，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、廉價(jià)分離 5(6)-羧基羅丹明異構(gòu)體的方法仍然是一個(gè)尚未圓滿解決的問(wèn)題。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離5 (6)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，包括如下步驟： (1) 樣品的準(zhǔn)備 將5-駿基羅丹明和6-駿基羅丹明的混合物溶于溶劑中，配制成一定濃度的溶液，將其 在一定溫度下超聲分散一定時(shí)間后獲得樣品溶液，備用； (2) 凝膠的制備 制備一定濃度的瓊脂糖凝膠液，將其冷卻到65C后小也地倒入電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi) 槽中，添加一定抑值的Tris堿緩沖溶液至沒(méi)過(guò)凝膠板為止； (3) 電泳分離 用移液器將步驟（1)的樣品溶液加到樣品孔中，控制一定的電場(chǎng)強(qiáng)度，對(duì)凝膠板通電進(jìn) 行電泳，當(dāng)凝膠上原有的一條樣品譜帶在移動(dòng)中分裂為兩條紫紅色譜帶后，結(jié)束電泳； (4) 樣品后處理 取出凝膠板后，用小刀將兩個(gè)譜帶的凝膠切割分離，分別將兩個(gè)膠帶研磨后用有機(jī)溶 劑萃取，濃縮萃取液即可分別得到異構(gòu)純的5-駿基羅丹明化合物、6-駿基羅丹明化合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于所述 的5-駿基羅丹明異構(gòu)體或6-駿基羅丹明異構(gòu)體具有下列結(jié)構(gòu)通式：
其中；馬、R2、Rs同時(shí)為氨，或者R 1、R2、Rs選自氨、2-6個(gè)碳原子焼基中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于所述 步驟（1)中溶劑為無(wú)水己醇、丙麗、己離、己酸己醋、甲醇或含有上述溶劑與水的任意比率的 水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于所述 步驟（1)中樣品溶液的濃度在0.02?4 mol/L之間。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于步驟 (1)中所述的一定溫度在l〇~5(TC之間；步驟（1)中所述的一定時(shí)間在10?120分鐘之間。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于所述 步驟（2)中瓊脂糖凝膠液的濃度在0. 5?2wt%之間。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于所述 步驟（2)中抑值在4?10. 5之間，其Tris堿緩沖溶液的濃度為0. 04?2. 00 mol/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于所述 步驟（2)中Tris堿緩沖溶液選自Tris-己酸、Tris-磯酸或Tris-測(cè)酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離5化)-駿基羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于步驟 (3)中所述的一定電場(chǎng)強(qiáng)度在0. 5 ~20 V/cm之間。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9所述的一種分離5 (6)-駿基 羅丹明異構(gòu)體的方法，其特征在于所述步驟（4)中有機(jī)溶劑至少有一種選自甲醇、己醇、己 膳、二氯甲焼、氯仿或己離。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種分離5(6)-羧基羅丹明異構(gòu)體的方法，包括如下步驟：將5-羧基羅丹明和6-羧基羅丹明的混合物溶于溶劑中，配制成一定濃度的溶液，一定溫度下超聲分散后獲得樣品溶液；制備一定濃度的瓊脂糖凝膠液，將其冷卻到65℃后小心地倒入電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽中，添加Tris堿緩沖溶液至沒(méi)過(guò)凝膠板為止；將步驟（1）的樣品溶液加到樣品孔中，控制一定的電場(chǎng)強(qiáng)度，對(duì)凝膠板通電進(jìn)行電泳，當(dāng)凝膠上原有的一條樣品譜帶在移動(dòng)中分裂為兩條紫紅色譜帶后，結(jié)束電泳。取出凝膠板后，用小刀將兩個(gè)譜帶的凝膠切割分離，分別將兩個(gè)膠帶研磨后用有機(jī)溶劑萃取，即可分別得到異構(gòu)純的5-羧基羅丹明化合物、6-羧基羅丹明化合物。具有簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C25B7-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104593813
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510078343
【發(fā)明人】高勇, 余喜娣, 付妹, 張曉偉, 汪軍
【申請(qǐng)人】福建師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日