專利名稱：T1r異源寡聚的味覺受體和表達所述受體的細胞系及其在鑒定味覺化合物中的用途的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請要求對以下申請的優(yōu)先權(quán)，即2001年6月26日提出的美國臨時申請60/300,434、2001年7月3日提出的美國實用申請09/897,427、2001年7月13日提出的美國臨時申請60/304,749、2001年8月8日提出的美國臨時申請60/310,493、2001年11月21日提出的美國臨時申請60/331,771、2001年12月14日提出的美國臨時申請60/339,472、2002年1月3日提出的美國申請10/035,045、2002年4月15日提出的美國臨時申請60/372,090、2002年4月22日提出的美國臨時申請60/374,143，均全文引入以供參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明部分涉及有關(guān)T1R受體裝配形成功能性味覺受體的發(fā)現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)共表達T1R1和T1R3可產(chǎn)生響應(yīng)鮮味(umamitaste)刺激物(包括谷氨酸一鈉)的味覺受體。還發(fā)現(xiàn)共表達T1R2和T1R3受體可產(chǎn)生響應(yīng)甜味刺激物(包括天然存在以及人造甜味劑)的味覺受體。
本發(fā)明還涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的異寡聚味覺受體在分析中的用途，用于鑒定分別響應(yīng)鮮味刺激物和甜味刺激物的化合物。
本發(fā)明另外涉及構(gòu)建在組成型或誘導(dǎo)型條件下穩(wěn)定或瞬時共表達T1R1和T1R3、或T1R2和T1R3組合的細胞系。
本發(fā)明還提供了這些細胞系在基于細胞的分析、特別是利用熒光成像檢測受體活性的高通量篩選分析中的用途，用于鑒定鮮味和甜味覺調(diào)節(jié)化合物。
背景技術(shù)：
味覺系統(tǒng)提供了關(guān)于外界化學(xué)組分的感覺信息。人們相信哺乳動物具有至少5種基本味覺模式甜、苦、酸、咸和鮮(umami)。例如參見Kawamura等人，Introduction to UmamiA Basic Taste(1987)；Kinnamon等人，Ann.Rev.Physiol，54715-31(1992)；Lindemann，Physiol.Rev.，76718-66(1996)；Stewart等人，Am.J.Physiol，2721-26(1997)。人們認為每種味覺模式由舌頭表面的味覺受體細胞表達的一種或多種不同的蛋白質(zhì)受體介導(dǎo)(Lindemann，Physol.Rev.76718-716(1996))。識別苦、甜和鮮味刺激物的味覺受體屬于G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體(GPCR)超家族(Hoon等人，Cell 96451(1999)；Adler等人，Cell 100693(2000))。(據(jù)認為其它味覺模式由離子通道介導(dǎo)。)G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)許多其它的生理功能，例如內(nèi)分泌功能、外分泌功能、心率、脂解作用以及糖代謝。許多這類受體的生物化學(xué)分析和分子克隆已經(jīng)揭示了關(guān)于這些受體功能的許多基本原理。例如，美國專利5,691,188描述了在配體與GPCR結(jié)合后，該受體如何經(jīng)受構(gòu)象改變，通過促進Gα亞基表面GTP替代結(jié)合的GDP，隨后Gα亞基與Gβ和Gγ亞基分離，從而導(dǎo)致異源三聚G蛋白活化。游離的Gα亞基和Gβγ復(fù)合物可活化多種信號傳導(dǎo)途徑的下游元件。
本發(fā)明涉及味覺特異性GPCR的三元T1R類型。先前假設(shè)T1R受體行使甜味受體功能(Hoon等人，Cell 96541-51(1999)；Kitagawa等人，Biochem Biophys Res.Commun.283236-42(2001)；Max等人，Nat.Genet.2858-63(2001)；Montmayeur等人，Nat.Neurosci.4412-8(2001)；Sainz等人，J.Neurochem.77896-903(2001))，最近Nelson等人(2001)證明大鼠T1R2和T1R3在識別甜味刺激物中聯(lián)合作用。本發(fā)明涉及兩個發(fā)現(xiàn)。首先，與大鼠T1R2/T1R3相同，人T1R2和T1R3在識別甜味刺激物中聯(lián)合作用。其次，人T1R1和T1R3在識別鮮味刺激物中聯(lián)合作用。因此，在哺乳動物中，T1R2/T1R3可能發(fā)揮甜味受體功能，而T1R1/T1R3可能發(fā)揮鮮味受體功能。T1R1和T1R3、T1R2和T1R3的功能相互依賴性的可能解釋是，與結(jié)構(gòu)相關(guān)的GABAB受體類似(Jones等人，Nature 3965316-22(1998)；Kaupmann等人，Nature 396683-7(1998)；White等人，Nature 396679-82(1998)；Kuner等人，Science 28374-77(1999))，T1Rs以異源二聚復(fù)合物行使功能。然而，這種功能的相互依賴性還有可能反映一種必要但短暫的相互作用，最終產(chǎn)生功能無關(guān)的單體或同源多聚的味覺受體。
鑒定發(fā)揮甜味和鮮味受體功能的味覺受體的特征很有意義，將促進這些受體在識別可調(diào)節(jié)(增強或阻斷)甜味和鮮味覺的化合物的分析中的用途。這些化合物可用于改善人用或動物用食物、飲料、藥物的味道和可口性。特別而言，利用功能性甜味受體的分析可以用來鑒定新型甜味劑。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即不同組合的T1R在共表達時可以產(chǎn)生響應(yīng)味覺刺激物的功能性味覺受體。本發(fā)明特別涉及以下發(fā)現(xiàn)，即共表達T1R2和T1R3產(chǎn)生響應(yīng)甜味覺刺激物的異源寡聚的味覺受體。本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)，即共表達T1R1和T1R3產(chǎn)生響應(yīng)鮮味覺刺激物(例如谷氨酸一鈉)的異源寡聚味覺受體。
本發(fā)明還涉及共表達(優(yōu)選人)T1R1和T1R3、或(優(yōu)選人)T1R2和T1R3的細胞系。在優(yōu)選實施方案中，這些細胞系組成型或誘導(dǎo)型表達數(shù)量增多的受體。這些細胞系包括瞬時或穩(wěn)定表達T1R1和T1R3、或T1R2和T1R3的細胞。
本發(fā)明還提供分析方法，優(yōu)選利用T1R2/T1R3味覺受體或T1R1/T1R3受體的高通量篩選分析，優(yōu)選基于細胞的高通量分析，以鑒定可調(diào)節(jié)甜味或鮮味覺的化合物。本發(fā)明還提供包括味覺測試的分析方法，以證實這些化合物可調(diào)節(jié)甜味或鮮味覺。
發(fā)明目的為此，本發(fā)明的一個目的在于提供介導(dǎo)味覺的哺乳動物G蛋白偶聯(lián)受體家族，此處稱為T1R。
本發(fā)明的另一目在于提供保持例如由甜味或鮮味覺刺激物活化或與之結(jié)合活性的該T1R的片段和變體。
本發(fā)明的另一目的在于提供編碼該T1R、其片段或變體的核酸序列或分子。
本發(fā)明的另一目的在于提供表達載體，其中包含編碼該T1R或其片段或變體的核酸序列，該序列有效連接至少一種調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、增強子或參與正向或負向基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯、和/或蛋白質(zhì)輸出的其它序列。
本發(fā)明的另一目的在于提供功能性表達至少一種該T1R、或其片段或變體、優(yōu)選T1R或其片段或變體的組合的人類或非人類細胞，例如哺乳動物、酵母、蠕蟲或昆蟲細胞。
本發(fā)明的另一目在于提供T1R融合蛋白質(zhì)或多肽，其至少包含至少一種該T1R的片段。
本發(fā)明的另一目的在于提供編碼T1R多肽的分離的核酸分子，其包含的核酸序列與具有下述hT1R核酸序列及其保守性修飾變體之一的核酸序列具有至少50％、優(yōu)選75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本發(fā)明的又一目的在于提供分離的核酸分子，其包含編碼多肽的核酸序列，該多肽的氨基酸序列與選自下述T1R氨基酸序列及其保守性修飾變體之一的氨基酸序列具有至少35％-50％、優(yōu)選60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，其中該片段長度至少為20、優(yōu)選40、60、80、100、150、200或250個氨基酸。任選該片段是可結(jié)合抗-T1R抗體的抗原性片段。
本發(fā)明的另一目的在于提供包含所述片段變體的分離的多肽，其中至多在10、優(yōu)選5、4、3、2、或1個氨基酸殘基處存在變異。
本發(fā)明另一目的在于提供T1R1/T1R3組合，其中T1R1和/或T1R3是變體或片段，以及T1R2/T1R3組合，其中T1R2和/或T1R3是變體或片段。
本發(fā)明的另一個目的在于提供該T1R或其片段或變體的激動劑或拮抗劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用肽(此處稱為PDZIP)，其可促進表面表達質(zhì)膜整合蛋白質(zhì)、特別是GPCR，例如T1R。本發(fā)明的另一目的在于提供包括PDZIP的載體、表達該載體的宿主細胞、以及利用PDZIP促進表面表達的方法。
本發(fā)明的優(yōu)選目的在于提供分析方法、特別是高通量分析，用于鑒定可調(diào)節(jié)味覺的化合物，特別是可調(diào)節(jié)甜味覺和鮮味覺的化合物。該分析方法優(yōu)選利用此處公開的T1R或其片段或變體、或編碼該T1R或其片段或變體的基因的組合。該組合最優(yōu)選包含hT1R1/hT1R3以及hT1R2/hT1R3。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案是鑒定可調(diào)節(jié)T1R1/T1R3或T1R2/T1R3味覺受體(例如增強該受體響應(yīng)味覺刺激物的能力)的化合物。例如下文所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5’-IMP或5’-GMP可增強對L-谷氨酸鮮味(T1R1/T1R3)的響應(yīng)。這些調(diào)節(jié)劑化合物可增強不同甜味或鮮味覺刺激物的活性，并提供降低濃度的產(chǎn)生特定甜味或鮮味覺的化合物(可由使用本分析鑒定的味覺調(diào)節(jié)劑增強其活性)產(chǎn)生增強和/或相同的味覺。
本發(fā)明的另一目的在于提供評價一種或多種化合物的味覺的優(yōu)選分析方法，包括將所述一種或多種化合物與至少一種公開的T1R、其片段或變體、優(yōu)選人類T1R的組合相接觸的步驟。
本發(fā)明更特別的目的在于提供篩選在哺乳動物、優(yōu)選人類中具有增強、模擬、阻斷和/或調(diào)節(jié)甜味覺能力的一種或多種化合物的方法，其包含將一種或多種化合物與hT1R2和hT1R3的組合或包含hT1R2和/或hT1R3的片段、嵌合體或變體的復(fù)合物相接觸的步驟。
本發(fā)明的另一特定目的在于提供篩選在哺乳動物、優(yōu)選人類中具有增強、模擬、阻斷和/或調(diào)節(jié)味覺、特別是鮮味覺能力的一種或多種化合物的方法，其包含將一種或多種化合物與hT1R1和hT1R3的組合或包含hT1R1和/或hT1R3的片段、嵌合體或變體的復(fù)合物相接觸的步驟。
本發(fā)明的另一特定目的在于產(chǎn)生共表達hT1R1和hT1R3、或其片段、變體或嵌合體的細胞，用于鑒定可增強、模擬、阻斷和/或調(diào)節(jié)味覺、特別是甜味覺的化合物。
本發(fā)明的另一特定目的在于產(chǎn)生共表達hT1R1和hT1R3、或其片段、變體或嵌合體的細胞，用于鑒定可增強、模擬、阻斷和/或調(diào)節(jié)味覺、特別是鮮味覺的化合物的分析中。
本發(fā)明的另一目的在于產(chǎn)生經(jīng)基因修飾表達或不表達一種或多種T1R的非人動物。
本發(fā)明的另一目的在于將利用T1R、或其組合的分析鑒定的化合物用作食物和飲料組合物中的調(diào)味成分(flavor ingredient)。特別而言，本發(fā)明的一個目的在于，在食物和飲料組合物中將與hT1R2和/或hT1R3相互作用的化合物用作甜味阻斷劑、增強劑、調(diào)節(jié)劑或模擬劑，將與hT1R1和/或hT1R3相互作用的化合物用作鮮味阻斷劑、增強劑、調(diào)節(jié)劑或模擬劑。
本發(fā)明的另一目的在于使用T1R、特別是非人類T1R，鑒定可調(diào)節(jié)動物飼料制劑味道的化合物，例如用于魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖。
本發(fā)明的優(yōu)選目的在于提供穩(wěn)定共表達hT1R1/hT1R3或hT1R2/hT1R3的真核、優(yōu)選哺乳動物或昆蟲細胞系，優(yōu)選HEK-293細胞系，其同樣表達G蛋白例如Gα15蛋白、或與T1R2/T1R3或T1R1/T1R3聯(lián)合表達時可產(chǎn)生功能性味覺受體的其它G蛋白。
本發(fā)明的另一優(yōu)選目的在于提供穩(wěn)定表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3、優(yōu)選hT1R1/hT1R3或hT1R2/hT1R3的真核細胞系，優(yōu)選哺乳動物或昆蟲細胞。在優(yōu)選的實施方案中，該細胞包含穩(wěn)定表達Gα15、或與T1R1/T1R3或T1R2/T1R3結(jié)合可產(chǎn)生功能性鮮味或甜味覺受體的其它G蛋白的HEK-293細胞。
本發(fā)明的一個目的還在于提供在組成型或誘導(dǎo)型條件下使用穩(wěn)定或瞬時表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的HEK-293或其它細胞系的分析方法、優(yōu)選高通量分析，以鑒定可調(diào)節(jié)鮮味或甜味覺的化合物。
本發(fā)明的另一目的在于根據(jù)影響拉克替醇(lactisole)(一種甜味覺抑制劑)或結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物與T1R1/T1R3(鮮味)味覺受體結(jié)合的能力，鑒定可增強、模擬、阻斷和/或調(diào)節(jié)T1R1/T1R3鮮味受體的化合物。
附圖簡述

圖1包含人和大鼠T1R、人鈣敏感受體和大鼠代謝型(metabotropic)谷氨酸受體的序列比對。
圖2包含RT-PCR擴增實驗結(jié)果，顯示味覺組織中表達hT1R2和hT1R3。
圖3a-3b包含各種濃度的不同甜味覺刺激物在瞬時轉(zhuǎn)染人T1R2、T1R3和T1R2/T1R3的穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞中產(chǎn)生的功能性數(shù)據(jù)(細胞內(nèi)鈣反應(yīng))(圖3a)；人T1R2/T1R3對幾種甜味覺刺激物有響應(yīng)(圖3b)；人T1R2/T1R3在gurmarin存在下對蔗糖有響應(yīng)，內(nèi)源性β2-腎上腺素能受體在gurmarin存在下對異丙基腎上腺素有響應(yīng)。圖3c包含對不同甜味劑的標準化響應(yīng)。
圖4包含瞬時轉(zhuǎn)染hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3和rT1R2/hT1R3的穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞針對350mM蔗糖、25mM色氨酸、15mM天冬甜精(aspartame)以及0.05％應(yīng)樂果甜蛋白(monellin)的細胞內(nèi)鈣響應(yīng)。
圖5包含基于熒光平板反應(yīng)器分析的結(jié)果，其中將穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞瞬時轉(zhuǎn)染hT1R2和hT1R3、或單獨hT1R3，并接觸鈣染料Fluo-4和甜味覺刺激物(12.5mM環(huán)己氨基磺酸鹽(cyclamate))。
圖6包含標準化的劑量-反應(yīng)曲線，根據(jù)其與各種甜味刺激物(色氨酸、環(huán)己氨基磺酸鹽、蔗糖、紐甜(neotame)、天冬甜精(Aspartame)、糖精(saccharin)和Acek)的劑量特異性相互作用顯示hT1R2和hT1R3組合發(fā)揮人甜味受體的功能。
圖7包含有關(guān)mGluR1和T1R1的結(jié)構(gòu)性信息，顯示在這些分子中觀察到關(guān)鍵的配體結(jié)合殘基。
圖8a-8c包含功能性數(shù)據(jù)，顯示瞬時轉(zhuǎn)染T1R1/T1R3的穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞在細胞內(nèi)鈣分析中響應(yīng)谷氨酸。圖8a顯示細胞內(nèi)鈣響應(yīng)谷氨酸濃度的提高而提高；圖8b顯示細胞內(nèi)鈣對IMP(2mM)、谷氨酸(0.5mM)和0.2mM IMP的響應(yīng)；圖8c顯示人T1R1/T1R3在有無0.2mM IMP存在下對谷氨酸的響應(yīng)。
圖9a-9b分別包含使用Myc-標記的hT1R2的免疫熒光染色分析以及FACS實驗的結(jié)果，顯示引入PDZIP肽(SEQID No1)可增強T1R(hT1R2)在質(zhì)膜上的表達。
圖10a-10b包含鈣成像數(shù)據(jù)，表明h1TR2/hT1R3響應(yīng)不同的甜味刺激物。
圖11利用自動熒光成像，顯示穩(wěn)定表達hT1R1/hT1R3的細胞系對鮮味覺刺激物的響應(yīng)。
圖12利用自動熒光成像，顯示穩(wěn)定表達hT1R2/hT1R3的細胞系對甜味覺刺激物的響應(yīng)。
圖13顯示使用自動熒光成像測定的誘導(dǎo)型表達人T1R1/T1R3味覺受體的細胞系在有無0.2mM IMP存在下對L-谷氨酸的劑量-反應(yīng)曲線。
圖14和15顯示誘導(dǎo)型表達人T1R1/T1R3味覺受體的細胞系(克隆1-17)對一組L-氨基酸的響應(yīng)。圖14在有無1mM IMP存在下檢測10mM的不同C-氨基酸。圖15在有無0.2mM IMP存在下測定活性氨基酸的劑量-反應(yīng)。
圖16顯示拉克替醇抑制人T1R2/T1R3和人T1R1/T1R3的受體活性。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過共表達不同T1R的組合、優(yōu)選T1R1/T1R3或T1R2/T1R3，因而提供功能性味覺受體、優(yōu)選人味覺受體，以及相應(yīng)的分離的核酸序列或其片段、嵌合體或變體，其共表達后可產(chǎn)生功能性味覺受體，即甜味覺受體(T1R2/T1R3)或鮮味覺受體(T1R1/T1R3)。
如文獻報道，味覺細胞特異性GPCR的T1R家族成員已知并由Hoon等人，Cell，96541-551(1999)、WO 00/06592、WO 00/06593和U.S.Serial No.09/799,629鑒定，在此均全文引用以供參考。
更具體而言，本發(fā)明涉及共表達不同的味覺細胞特異性GPCR。這些核酸及其編碼的受體被稱為味覺細胞特異性GPCR的“T1R”家族成員。在本發(fā)明的特定實施方案中，共表達的T1R家族成員包括rT1R1、rT1R2、rT1R3、mT1R1、mT1R2、mT1R3、hT1R1、hT1R2和hT1R3。不希望局限于理論，人們認為這些味覺細胞特異性GPCR是味覺傳導(dǎo)途徑的組分，并參與甜味和鮮味刺激物和/或產(chǎn)生其它味覺模式的味覺刺激物的味覺檢測。
此處證明，T1R家族成員與其它T1R家族成員聯(lián)合作用，行使甜味覺和鮮味覺受體功能。正如下文實施例所進一步詳細公開的，已經(jīng)證明共表達hT1R2和hT1R3的異源細胞可由甜味覺刺激物以類似(mirror)人甜味覺的方式選擇性活化。例如，共表達hT1R2和hT1R3的HEK-293-Gα15細胞特異性響應(yīng)環(huán)己氨基磺酸鹽、蔗糖、天冬甜精和糖精，這些化合物的劑量響應(yīng)與身心味覺檢測閾值相關(guān)。因此，共表達hT1R2和hT1R3的細胞可用于篩選、優(yōu)選高通量篩選方法，以鑒定可模擬、調(diào)節(jié)、阻斷和/或增強甜味覺感受的化合物。
同樣在實施例實驗數(shù)據(jù)支持下，已經(jīng)表明共表達hT1R1和hT1R3的細胞可由谷氨酸(谷氨酸一鈉)和5’-核糖核苷酸以類似人鮮味覺的方式選擇性活化。例如，共表達hT1R1和hT1R3的HEK-293-Gα15細胞特異性響應(yīng)谷氨酸，對該鮮味化合物的劑量響應(yīng)與身心味覺檢測閾值相關(guān)。此外，5’-核糖核苷酸例如IMP可增強T1R1/T1R3受體的谷氨酸響應(yīng)，這是鮮味覺的協(xié)同作用特征。因此，共表達hT1R1和hT1R3的細胞可用于篩選、優(yōu)選高通量篩選方法，以鑒定可模擬、調(diào)節(jié)、阻斷和/或增強鮮味覺感受的化合物。
另外，如實施例的實驗數(shù)據(jù)所示，已經(jīng)表明穩(wěn)定和誘導(dǎo)型共表達T1R1/T1R3的細胞可選擇性響應(yīng)鮮味覺刺激物L-谷氨酸和L-天冬氨酸，并只對很高濃度的其它L-氨基酸較弱響應(yīng)，從而提供了進一步的證據(jù)，證明T1R1/T1R3受體可用于分析方法，以鑒定可調(diào)節(jié)(增強或阻斷)鮮味覺刺激物的化合物。
同樣在實施例的實驗數(shù)據(jù)支持下，已經(jīng)表明共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的細胞分別響應(yīng)鮮味或甜味刺激物，其定量的劑量-反應(yīng)性方式進一步支持以下結(jié)論，即T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受體可用于鑒定受體激動劑和拮抗劑，例如MSG取代物、鮮味阻斷劑、新型人造及天然甜味劑以及甜味阻斷劑。
同樣在實施例的實驗數(shù)據(jù)支持下，已經(jīng)表明甜味覺阻斷劑拉克替醇抑制T1R2/T1R3甜味受體和T1R1/T1R3鮮味受體。這提示篩選可影響拉克替醇結(jié)合T1R2/T1R3或T1R1/T1R3的化合物的分析方法可用于鑒定可增強、模擬、調(diào)節(jié)或阻斷甜或鮮味覺的化合物。拉克替醇可抑制T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受體，提示這些受體可能共有相同的亞基，該亞基與拉克替醇、并可能與其它調(diào)節(jié)劑結(jié)合。因此，提示可增強、模擬、調(diào)節(jié)或阻斷甜味覺的某些化合物可能對鮮味覺具有類似作用，反之亦然。
在實施例實驗數(shù)據(jù)的進一步支持下，利用自動化熒光成像分析已經(jīng)證明，穩(wěn)定共表達T1R、即T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的細胞系非常有效地響應(yīng)各種甜味和鮮味覺刺激物，也就是說，其程度大大超過瞬時轉(zhuǎn)染的細胞。因此，這些細胞系特別適合用于高通量篩選分析，以鑒定可調(diào)節(jié)、阻斷、模擬或增強甜味或鮮味覺的化合物。然而，本發(fā)明同樣包括利用瞬時表達一種T1R或其組合的細胞的分析方法。
此外，盡管本申請包含的數(shù)據(jù)表明，某些T1R聯(lián)合作用，特別是T1R1/T1R3和T1R2/T1R3，而且這種受體組合可能用于分析方法、優(yōu)選高通量分析，但應(yīng)認識到，本發(fā)明同樣包括單獨或與其它蛋白質(zhì)、例如其它GPCR聯(lián)合使用T1R1、T1R2和T1R3的分析方法。
在此方面，預(yù)測到甜味受體可能只由T1R2組成，和/或鮮味受體可能只由T1R1組成，而T1R3受體可能具有促進T1R2或T1R1表面表達的功能。
或者，也可能甜味受體和鮮味受體可能只由T1R3組成，在T1R1和/或T1R2控制下進行不同加工。該受體表達類型可能類似于降鈣素相關(guān)受體的RAMP依賴性加工。
利用T1R分析方法鑒定的化合物可用于調(diào)節(jié)食物和飲料的味道。下文更詳細描述的合適分析方法包括例如完整細胞分析和生物化學(xué)分析，其中包括使用不同T1R受體、其嵌合體或片段(特別是包含N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段)的組合的直接結(jié)合分析。下文詳述了適于本發(fā)明使用的分析實例，并為GPCR領(lǐng)域已知。
可以設(shè)計分析方法，定量不同化合物或化合物的混合物與T1R味覺受體、或T1R味覺受體的組合、或與其它異源(非T1R)蛋白質(zhì)、例如其它GPCRs聯(lián)合表達的T1R味覺受體的結(jié)合，或定量表達T1R味覺受體的細胞的活化。通過在異源細胞、例如HEK-293、CHO和COS細胞中穩(wěn)定或瞬時表達味覺受體，可以做到這一點。
該分析方法優(yōu)選使用同時表達(優(yōu)選穩(wěn)定表達)G蛋白(例如Gα15或Gα16)、或其它混棲(promiscuous)G蛋白或G蛋白變體、或內(nèi)源性G蛋白的細胞。此外，其中還可表達Gβ和Gγ蛋白。
利用各種方法，包括使用鈣敏感性染料、電壓敏感性染料、cAMP分析、利用熒光標記配體或放射性配體例如3H-谷氨酸的直接結(jié)合分析、或轉(zhuǎn)錄分析(使用合適的報告分子，例如螢光素酶或β-內(nèi)酰胺酶)，可使用表達或包含上述鑒定的受體或受體組合的細胞或組合物測定化合物對甜味或鮮味覺的作用。
可使用本發(fā)明的一種或多種T1R的分析方法包括，例如利用活細胞基因選擇的分析；利用完整細胞或膜片段或純化的T1R蛋白質(zhì)的分析；利用第二信使、例如cAMP和IP3的分析；檢測抑制蛋白易位到細胞表面的分析；利用待測配體檢測細胞表面受體表達喪失(內(nèi)化)的分析；直接配體結(jié)合分析，利用抑制劑的競爭性結(jié)合分析，利用體外翻譯蛋白質(zhì)的分析，檢測配體結(jié)合后構(gòu)象變化(例如通過蛋白質(zhì)水解、熒光或NMR證明)的分析，利用表達T1R或T1R組合的轉(zhuǎn)基因非人動物(例如蒼蠅、蠕蟲或小鼠)的行為分析，利用包含T1R基因的重組病毒感染的細胞的分析。
基于結(jié)構(gòu)的分析同樣位于本發(fā)明范圍之內(nèi)，其中測定T1R或T1R片段(或T1R組合、或T1R與另一蛋白質(zhì)的組合)的x射線晶體結(jié)構(gòu)，并用來通過分子模建技術(shù)預(yù)測可結(jié)合和/或增強、模擬、阻斷或調(diào)節(jié)特定T1R受體或受體組合的化合物。更具體而言，本發(fā)明包括測定T1R1/T1R3(優(yōu)選hT1R1/hT1R3)和/或T1R2/T1R3(優(yōu)選hT1R2/hT1R3)的晶體結(jié)構(gòu)，以及該晶體結(jié)構(gòu)在基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計方法中的用途，用于鑒定可調(diào)節(jié)T1R受體活性的分子。
本發(fā)明特別包括使用表達一種或多種全長T1R受體或片段、優(yōu)選T1R1、T1R2和/或T1R3的N端結(jié)構(gòu)域的細胞、例如哺乳動物、酵母、昆蟲或其它異源細胞進行的生物化學(xué)分析。使用競爭性結(jié)合分析，例如使用放射性的谷氨酸或IMP、熒光(例如熒光偏振、FRET)或GTPγ35S結(jié)合分析，可以測定化合物在上述分析中的作用。如優(yōu)選實施方案所述，上述分析使用穩(wěn)定共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3以及合適的G蛋白、例如Gα15的細胞系。其它合適的G蛋白包括公開于美國申請09/984,292和60/243,770(在此全文引用以供參考)的G蛋白的嵌合體和變體。
此外，可以構(gòu)建并表達具有改善性質(zhì)(例如增強的表面表達或G蛋白偶聯(lián))的改變的受體?？梢栽诨诩毎姆治鲆约吧锘瘜W(xué)分析中引入這些T1R變體。
可以想象，與人T1R有關(guān)的這些發(fā)現(xiàn)可擴展到其它物種，例如嚙齒類、豬、猴、狗和貓，還可能甚至擴展到非哺乳動物，例如魚類。在此方面，以下實施例1鑒定了幾種魚類T1R片段。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于篩選供動物飼料制劑中使用的化合物。
本發(fā)明另外包括使用各種T1R的不同等位基因變體及其組合，從而鑒定可在表達這些等位變體的個體、或所有個體中引起特定味覺感受的化合物。可使用這種化合物使食物更普遍可口。
T1R編碼核酸在味覺細胞中特異性表達，因而這些核酸還為鑒定味覺細胞提供了有價值的探針。例如，T1R多肽和蛋白質(zhì)的探針可用于鑒定存在于葉狀、輪廓和菌狀乳頭中的味覺細胞，以及存在于geschmackstreifen、口腔、胃腸道上皮和會厭中的味覺細胞。特別是檢測T1R的方法，可用于鑒定對甜味和/或鮮味覺刺激物、或代表其它味覺模式的其它味覺刺激物敏感的味覺細胞。例如，根據(jù)此處工作可以預(yù)測，穩(wěn)定或瞬時表達T1R2和/或T1R3的細胞可響應(yīng)甜味覺刺激物。類似地，可以預(yù)測表達T1R1和/或T1R3的細胞可響應(yīng)鮮味覺刺激物。依據(jù)WO 00/035374公開的方法，可以從多種來源分離、基因工程、擴增、合成、和/或重組表達本發(fā)明編碼T1R蛋白質(zhì)和多肽的核酸，該專利申請在此全文引用以供參考。實施例提供了本發(fā)明可以表達的T1R的清單。但是應(yīng)當強調(diào)，本發(fā)明包括其它特定T1R或片段、變體、或以這些T1R序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的嵌合體、特別是其它物種的T1R的表達及用途。
本發(fā)明公開的一個重要方面在于，篩選這些味覺細胞特異性GPCR的調(diào)節(jié)劑例如活化劑、抑制劑、刺激劑、增強劑、激動劑和拮抗劑的多種方法。這些味覺傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑對于味覺信號途徑的調(diào)節(jié)十分有用。這些篩選方法可用于鑒定味覺細胞活性的高親和力激動劑和拮抗劑。這些調(diào)節(jié)性化合物因而可用于食品工業(yè)來定制味道，例如調(diào)節(jié)食品的甜味和/或鮮味覺。
本發(fā)明鑒定了介導(dǎo)甜味和鮮味覺感受的特異性T1R以及T1R受體組合，因而糾正了先前對有關(guān)甜味和鮮味覺缺少了解的情況。因此，一般而言，本申請涉及本發(fā)明人有關(guān)T1R類味覺特異性G蛋白偶聯(lián)受體及其在味覺中特定功能的發(fā)現(xiàn)，以及這些發(fā)現(xiàn)之間的關(guān)系，以更好理解味覺的分子基礎(chǔ)。
甜味覺和鮮味覺-谷氨酸一鈉的味道-的分子基礎(chǔ)是個謎團。最近鑒定了三個成員類型的味覺特異性G蛋白偶聯(lián)受體，稱為T1R。重疊的T1R表達模式以及證明結(jié)構(gòu)相關(guān)的GABAB受體為異源二聚體，提示T1R具有異源二聚味覺受體的功能。在以下實施例中，本發(fā)明人描述了在異源細胞中功能性共表達人T1R1、T1R2和T1R3；共表達T1R1和T1R3的細胞可由鮮味覺刺激物活化；共表達T1R2和T1R3的細胞可由甜味覺刺激物活化。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的活性與身心檢測閾值相關(guān)。此外，發(fā)現(xiàn)5’-核糖核苷酸IMP可增強T1R1/T1R3受體對谷氨酸響應(yīng)，這是鮮味覺的協(xié)同作用特征。這些發(fā)現(xiàn)證明，特定T1R、特別是T1R的不同組合具有甜味和鮮味覺受體的功能。
據(jù)認為人類的苦、甜和鮮味覺由G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)(Lindemann，B.，Physiol.Res.76718-66(1996))。最近，測定人類基因組揭示了T2R類苦味受體(Adler等人，Cell 100613-702(2000)；Chandrasgekar等人，Cell 100703-11(2000)；Matsunami等人，Nature 404601-604(2000))，但尚未鑒定甜味和鮮味受體。最近鑒定了另一類候選的味覺受體，T1R。T1R的鑒定首先是通過來源于大鼠味覺組織的消減cDNA文庫的大規(guī)模測序鑒定了T1R1，隨后通過基于T1R1的簡并PCR鑒定了T1R2(Noon等人，Cell 96541-551(1999))。本發(fā)明人和他人最近在人基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了T1R家族的第3個、可能是最后一個成員，T1R3(Kitagawa等人，BiochemBiophys.Res Commun.283(1)236-42(2001)；Max等人，Nat.Genet.28(1)58-63(2001)；Sainz等人，J.Neurochem.77(3)896-903(2001)；Montmayeur等人，Nat.Neurosci.4，492-8.(2001))。最說明問題的是，小鼠T1R3定位于包含影響小鼠甜味覺的基因座Sac的基因組間隔(Fuller等人，J.Hered.6533-6(1974)；Li等人，Mamm.Genome 1213-16(2001))。因此，預(yù)測T1R3具有甜味覺受體功能。最近的高分辨率遺傳圖譜研究加強了小鼠T1R3和Sac之間的關(guān)聯(lián)(Fuller等人，J.Hered. 65(1)33-36(1974)；Li等人，Mammal.Genome 12(1)13-16(2001))。
有趣的是，已經(jīng)表明迄今功能性表達的所有C家族受體-代謝型谷氨酸受體、GABAB受體、鈣敏感受體(Conigrave，A.D.，Quinn，S.J.&Brown，E.M.，Proc Natl Acad Sci USA97，4814-9.(2000))、魚嗅覺受體(Speca，D.J.等人，Neuron 23，487-98.(1999))-均可由氨基酸活化。這個共同特征表明，有可能T1R可識別氨基酸，除甜味覺氨基酸以外，T1R可能還涉及谷氨酸的檢測。另外，有人提議mGluR4代謝型谷氨酸受體的轉(zhuǎn)錄變體是鮮味覺受體，因為它選擇性表達于大鼠味覺組織，而且其受體活化閾值類似于谷氨酸的身心檢測閾值(Chaudhari等人，Nat.Neurosci.3113-119(2000))。該假設(shè)與mGIuR4變體在味覺組織中表達水平極低以及mGluR4敲除小鼠的谷氨酸味覺沒有多少改變不相符(Chaudhari和Roper，Ann.N.Y.AcadSci.855398-406(1998))。另外，該味覺變體在結(jié)構(gòu)上不可信，不僅缺少形成野生型受體的谷氨酸結(jié)合口袋的大部分殘基，也缺少大約半數(shù)的N端球狀谷氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Kunishima等人，Nature407971-7(2000))。
嚙齒類T1R表達模式的比較性分析證明，T1R2、還可能T1R1分別與T1R3共表達(Hoon等人，Cell 96541-51(1999)；Kitagawa等人，Biochem Biophy.Res.Commun.283236-242(2001)；Max等人，Nat.Genet.2858-63(2001)；Montmayeur等人，Nat.Neurosci 4492-8(2001)；Sainz等人，J.Neurochem 77896-903(2001))。另外，二聚體化顯現(xiàn)為C-家族受體的共同特征代謝型谷氨酸和鈣敏感受體是同源二聚體(Romomano等人，J.Biol.Chem.27128612-6(1996)；Okamoto等人，J.Biol.Chem.27313089-96(1998)；Han等人，J.Biol.Chem.274100008-13(1999)；Bai等人，J.Biol.Chem.27323605-10(1998))，結(jié)構(gòu)上相關(guān)的GABAB受體是異源二聚的(Jones等人，Nature 396674-9(1998)；Kaupmann等人，Nature396683-687(1998)；White等人，Nature 396679-682(1998)；Kuner等人，Science 28374-77(1999))。本發(fā)明人通過在異源細胞中功能性共表達T1R證明，人T1R2與人T1R3聯(lián)合行使甜味覺受體功能，人T1R1與人T1R3聯(lián)合行使鮮味覺受體功能。
以前因缺少甜味覺分析方法而妨礙了改善的人造甜味劑的開發(fā)，此處討論的這些發(fā)現(xiàn)因而特別有意義。實際上，5種常用的商品化人造甜味劑(均活化hT1R2/hT1R3)都是偶然發(fā)現(xiàn)的。類似地，除了感覺測試這一艱辛方法以外，尚無鑒定可調(diào)節(jié)鮮味覺的化合物的分析方法。如今這些困難減小了，如下文討論的實驗結(jié)果所示，已經(jīng)鑒定了人的甜味和鮮味受體，并開發(fā)了這些受體的分析方法，特別是使用穩(wěn)定表達功能性T1R味覺受體、即甜味覺或鮮味覺受體的細胞的分析方法。
基于此，本發(fā)明提供了檢測和鑒定味道調(diào)節(jié)化合物的分析方法，其中T1R家族成員如同在味蕾中那樣，作為報告分子作用于味道調(diào)節(jié)化合物的甜味和鮮味覺。特別提供了鑒定可分別調(diào)節(jié)、模擬、增強和/或阻斷甜味和鮮味覺的化合物，并屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。眾所周知分析GPCR活性、特別是影響GPCR活性的化合物活性的方法，適用于本發(fā)明T1R家族成員及其功能性組合。上文已經(jīng)指明了合適的分析方法。
特別而言，所述GPCR可用于分析中，例如在體內(nèi)和體外測量配體結(jié)合、離子濃度、膜電位、電流、離子通量、轉(zhuǎn)錄、受體配體相互作用、第二信使?jié)舛鹊淖兓?。在另一實施方案中，可以在細胞中重組表達T1 R家族成員，通過測定Ca++水平和其它細胞內(nèi)信使如cAMP、cGMP或IP3的變化，分析通過GPCR活性對味覺傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。
在某些分析中，T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，例如細胞外、跨膜或細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，與異源多肽融合，從而形成嵌合多肽，例如具有GPCR活性的嵌合蛋白質(zhì)。本發(fā)明特別包括包含N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的T1R1、T1R2或T1R3片段的用途。該蛋白質(zhì)十分有用，例如可用于鑒定T1R受體的配體、激動劑、拮抗劑或其它調(diào)節(jié)劑的分析中。例如，T1R多肽可在真核細胞內(nèi)表達，與促進質(zhì)膜運輸或成熟以及通過分泌途徑定向的異源、伴侶序列一起表達為嵌合受體。可選的異源序列可以是PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用肽，例如C端PDZIP片段(SEQ ID NO 1)。PDZIP是ER輸出信號，本發(fā)明已經(jīng)表明，它可以促進異源蛋白質(zhì)、例如此處所述T1R受體的表面表達。更特別而言，在本發(fā)明的一個方面中，PDZIP可用于促進可疑膜蛋白質(zhì)例如嗅覺受體、T2R味覺受體以及此處所述T1R味覺受體的合適定向。
這種嵌合T1R受體可以在任何真核細胞如HEK-293細胞中表達。優(yōu)選地，這些細胞包含G蛋白，優(yōu)選例如Gα15或Gα16或另一類型的混棲G蛋白，這些蛋白質(zhì)能夠?qū)V泛的GPCR與細胞內(nèi)信號途徑、或信號蛋白質(zhì)如磷脂酶C相聯(lián)系?？梢允褂萌魏螛藴史椒z測細胞內(nèi)這種嵌合受體的活化，例如通過檢測細胞內(nèi)FURA-2依賴性熒光來檢測細胞內(nèi)鈣的變化。如果優(yōu)選的宿主細胞不表達合適的G蛋白，可以利用編碼混棲G蛋白的基因轉(zhuǎn)染，例如美國申請60/243,770、2001年10月29日提交的美國申請09/984,297以及2001年11月21日提交的美國申請09/989,497所述，在此全文引用以供參考。
分析味覺傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的其它方法包括體外配體結(jié)合試驗，其中使用T1R多肽、其部分即細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合、或包含T1R家族成員一種或多種結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白質(zhì)；表達T1R多肽、片段或融合蛋白質(zhì)的卵母細胞或組織培養(yǎng)細胞；T1R家族成員的磷酸化和去磷酸化；結(jié)合GPCR的G蛋白；配體結(jié)合分析；電壓、膜電位和電導(dǎo)變化；離子通量分析；細胞內(nèi)第二信使如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇(IP3)的變化；以及細胞內(nèi)鈣水平的變化。
此外，本發(fā)明提供檢測T1R核酸和蛋白質(zhì)表達的方法，以進行味覺傳導(dǎo)調(diào)節(jié)研究以及味覺受體細胞的特異性鑒定。T1R家族成員也提供用于親子和法醫(yī)鑒定的核酸探針。T1R基因也用作鑒定味覺受體細胞，如葉狀、菌狀、輪廓狀、geschmackstreifen以及會厭味覺受體細胞的核酸探針。也可使用T1R受體產(chǎn)生用于鑒定味覺受體細胞的單克隆和多克隆抗體。
功能上，T1R多肽包含一個相關(guān)的7跨膜G蛋白偶聯(lián)受體的家族，其被認為參與味覺傳導(dǎo)，可能與G蛋白相互作用以介導(dǎo)味覺信號傳導(dǎo)(例如參見，F(xiàn)ong，Cell Signal，8217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.Cell Biol.，6180(1994))。結(jié)構(gòu)上，T1R家族成員的核苷酸序列編碼包含一個細胞外結(jié)構(gòu)域、7個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相關(guān)多肽。來自其它物種的相關(guān)T1R家族基因與此處實施例公開的T1R核酸序列、或其保守性修飾的變體中至少約50個核苷酸長度、可選地100、200、500或更多核苷酸長度的區(qū)域，具有至少約50％、可選地60％、70％、80％或90％核苷酸序列同一性，或編碼的多肽與下文實施例公開的T1R多肽序列、或其保守性修飾的變體中至少約25個氨基酸長度、任選地50-100個氨基酸長度的區(qū)域，具有至少約35-50％、可選地60％、70％、80％或90％氨基酸序列同一性。
已經(jīng)鑒定了T1R家族成員特征性的若干共有氨基酸序列或結(jié)構(gòu)域。例如，T1R家族成員通常包含與T1R共有序列1和2(分別為SEQ ID NO2和3)具有至少約50％、可選地55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95-99％或更高的同一性的序列。這些保守的結(jié)構(gòu)域因而可用于通過一致性、特異雜交或擴增、或與針對結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的抗體的特異結(jié)合鑒定T1R家族的成員。T1R共有序列包括例如以下序列T1R家族共有序列1(SEQ ID NO2)(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)ET1R家族共有序列2(SEQ ID NO3)(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)這些共有序列包含在此處所述的T1R多肽中發(fā)現(xiàn)的序列，但是可預(yù)期其它生物體的T1R家族成員包含與此處特別描述的共有序列具有約75％或更高同一性的共有序列。
T1R核苷酸和氨基酸序列的特異性區(qū)域可能用于鑒定T1R家族成員的多態(tài)性變體、種間同源體和等位基因。該鑒定可以體外進行，例如在嚴謹雜交條件下或通過PCR(例如，使用編碼上述T1R共有序列的引物)，或在計算機系統(tǒng)中利用序列信息與其它核苷酸序列進行比較。單一物種群內(nèi)T1R基因的不同等位基因也可用于確定等位基因序列差異是否控制種群不同成員之間的味覺感知差異。經(jīng)典PCR類型的擴增和克隆技術(shù)對于分離新的T1R很有用處，例如簡并引物足以檢測物種間的相關(guān)基因。
通常，通過比較大約25個氨基酸或更多、例如50-100個氨基酸的氨基酸序列，可以進行T1R家族成員多態(tài)性變體和等位基因的鑒定。大約至少35-50％、可選地60％、70％、75％、80％、85％、90％、95-99％或更高的氨基酸同一性通常表明蛋白質(zhì)是T1R家族成員的多態(tài)性變體、種間同源體或等位基因?？梢允褂孟率鋈魏我环N序列比較算法進行序列比較。特異性結(jié)合T1R多肽或其保守區(qū)的抗體也可用于鑒定等位基因、種間同源體和多態(tài)性變體。
可以通過檢驗推定的T1R多肽或蛋白質(zhì)的味覺細胞特異性表達來確認T1R基因的多態(tài)性變體、種間同源體和等位基因。通常，具有此處公開的氨基酸序列的T1R多肽可用作陽性對照，與推定的T1R多肽相比較，以證明T1R家族成員的多態(tài)性變體或等位基因的身份。預(yù)期多態(tài)性變體、等位基因和種間同源體保留有G蛋白偶聯(lián)受體的7個跨膜結(jié)構(gòu)。更詳細內(nèi)容參見WO 00/06592，其中公開了相關(guān)的T1R家族成員GPCR-B3，其內(nèi)容以符合本公開的方式在此引用以供參考。GPCR-B3受體在此處稱為rT1R1和mT1R1。另外參見WO 00/06593，其中也公開了相關(guān)的T1R家族成員GPCR-B4，其內(nèi)容以符合本公開的方式在此引用以供參考。GPCR-B4受體在此處稱為rT1R2和mT1R2。如前所述，本發(fā)明也包括利用T1R或T1R組合、例如hT1R2/hT1R3或hT1R1/hT1R3的X射線晶體結(jié)構(gòu)的基于結(jié)構(gòu)的分析方法，鑒定可調(diào)節(jié)T1R受體活性、從而調(diào)節(jié)甜味和/或鮮味覺的分子。
本發(fā)明同樣提供分析方法、優(yōu)選高通量分析方法，以鑒定可增強、模擬、阻斷和/或調(diào)節(jié)T1R受體的分子。在某些分析方法中，將一個T1R家族成員的特定結(jié)構(gòu)域與另一T1R家族成員的特定結(jié)構(gòu)域聯(lián)合使用，例如細胞外、跨膜、或細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或區(qū)。在另一實施方案中，細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合可以結(jié)合固相基質(zhì)，用來例如分離配體、激動劑、拮抗劑、或能夠結(jié)合T1R多肽和/或調(diào)節(jié)其活性的任何其它分子。
各種保守性突變和替換均被認為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如，利用已知的重組基因技術(shù)方法，包括PCR、基因克隆、cDNA定點突變、宿主細胞轉(zhuǎn)染和體外轉(zhuǎn)錄，進行氨基酸替換，處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。從而可以篩選到具有活性的變體。
定義除非另外指明，此處使用的下列術(shù)語具有其所述含義。
“味覺細胞”包括神經(jīng)上皮細胞，其成組后形成舌的味蕾，例如葉狀、菌狀和輪廓狀細胞(例如參見，Roper等人，Ann.Rev.Neurosci.12329-353(1989))。味覺細胞也見于顎和其它組織，如食管和胃。
“T1R”指G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一個或多個成員，這些受體在味覺細胞如葉狀、菌狀和輪廓狀細胞以及顎和食管的細胞中表達(例如參見，Hoon等人，Cell，96541-551(1999)，在此全文引用以供參考)。該家族成員在WO 00/06592中也稱為GPCR-B3和TR1，在WO00/06593中也稱為GPCR-B4和TR2。此處GPCR-B3也稱為rT1R1，GPCR-B4也稱為rT1R2。味覺受體細胞也可以根據(jù)形態(tài)學(xué)(例如參見，Roper，同上)、或通過味覺細胞特異性表達蛋白質(zhì)的表達來鑒定。T1R家族成員可能具有作為甜味覺傳導(dǎo)受體、或辨別其它各種不同味覺模式的能力。下文實施例鑒定了代表性的T1R序列，包括hT1R1、hT1R2和hT1R3。
“T1R”核酸編碼擁有7個跨膜區(qū)的GPCR家族，其具有“G蛋白偶聯(lián)受體活性”，例如它們可以響應(yīng)外界刺激物而與G蛋白結(jié)合并在一些酶如磷脂酶C和腺苷酸環(huán)化酶(關(guān)于GPCR結(jié)構(gòu)和功能的描述，參見例如，F(xiàn)ong，同上，和Baldwin，同上)的刺激下，促進產(chǎn)生第二信使如IP3、cAMP、cGMP和鈣離子。單個味覺細胞可能包含很多不同的T1R多肽。
因此，術(shù)語“T1R”家族是指多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源體，其(1)與T1R多肽、優(yōu)選實施例1鑒定的T1R多肽在大約25個氨基酸、可選地50-100個氨基酸的窗口上相比，具有至少約35-50％氨基酸序列同一性、可選地約60、75、80、85、90、95、96、97、98、或99％氨基酸序列同一性；(2)特異性結(jié)合針對免疫原產(chǎn)生的抗體，該免疫原包含優(yōu)選選自實施例1公開的T1R多肽序列及其保守性修飾變體的氨基酸序列；(3)由一種核酸分子編碼，該分子可在嚴謹雜交條件下與選自實施例1所包含的T1R核酸序列及其保守性修飾變體的序列特異性雜交(大小至少約100、可選地至少約500-1000個核苷酸)；或(4)包含一種序列，該序列與選自實施例1鑒定的T1R氨基酸序列的氨基酸序列具有至少約35-50％一致性。
拓撲結(jié)構(gòu)上，某些化學(xué)感受GPCR具有“N末端結(jié)構(gòu)域”、“細胞外結(jié)構(gòu)域”、包含7個跨膜區(qū)以及相應(yīng)胞質(zhì)和細胞外環(huán)的“跨膜結(jié)構(gòu)域”；“胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”和”C末端結(jié)構(gòu)域”(參見例如，Hoon等人，Cell，96541-551(1999)；Buck&Axel，Cell，65175-187(1991))。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以在結(jié)構(gòu)上鑒定這些結(jié)構(gòu)域，例如鑒定疏水和親水結(jié)構(gòu)域的序列分析程序(參見例如，Stryer，Biochemistry，(3rd ed.1988)；另見任何基于因特網(wǎng)的序列分析程序，例如可以在dot.imgen.bcm.tmc.edu上找到的程序)。這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谥苽淝逗系鞍踪|(zhì)以及本發(fā)明的體外分析、例如配體結(jié)合分析十分有用。
因而“細胞外結(jié)構(gòu)域”指從細胞膜向外突出并暴露于細胞外側(cè)的T1R多肽的結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域一般包括暴露到細胞的細胞外側(cè)的“N端結(jié)構(gòu)域”、可選地可以包括暴露到細胞的細胞外側(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞外環(huán)部分，即跨膜區(qū)2和3之間、跨膜區(qū)4和5之間、跨膜區(qū)6和7之間的環(huán)。
“N末端結(jié)構(gòu)域”區(qū)開始于N末端并延伸至靠近第一個跨膜結(jié)構(gòu)域開始部位的區(qū)域。更具體而言，在本發(fā)明的一個實施方案中，該結(jié)構(gòu)域開始于N末端，并大約在位于563±約20個氨基酸位置的保守性谷氨酸處結(jié)束。這些細胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ谌芤汉凸滔嘀械捏w外配體結(jié)合試驗十分有用。另外，下述跨膜區(qū)與細胞外結(jié)構(gòu)域聯(lián)用也能夠結(jié)合配體，因而對于體外配體結(jié)合試驗也十分有用。
包含7個“跨膜區(qū)”的“跨膜結(jié)構(gòu)域”，是指位于質(zhì)膜內(nèi)的T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，也可能包括相應(yīng)的胞質(zhì)(細胞內(nèi))和細胞外環(huán)。在一個實施方案中，該區(qū)對應(yīng)于T1R家族成員大致開始于約563±20個氨基酸位置處的保守性谷氨酸殘基、終止于約812±10個氨基酸位置處的保守性酪氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域。使用如Kyte&Doolittle，J.Mol.Biol.，157105-32(1982)，或Stryer(同上)所描述的標準方法，可以對7個跨膜區(qū)和細胞外和胞質(zhì)環(huán)進行鑒定。
“胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”是指朝向細胞內(nèi)部的T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，例如“C末端結(jié)構(gòu)域”和跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞內(nèi)環(huán)，如跨膜區(qū)1和2之間、跨膜區(qū)3和4之間以及跨膜區(qū)5和6之間的細胞內(nèi)環(huán)?！癈末端結(jié)構(gòu)域”是指跨越最后一個跨膜結(jié)構(gòu)域末端和蛋白質(zhì)C末端的區(qū)域，通常位于胞質(zhì)內(nèi)。在一個實施方案中，該區(qū)開始于約812±10個氨基酸位置處的保守性酪氨酸殘基，并延續(xù)至多肽的C末端。
術(shù)語“配體結(jié)合區(qū)”或“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指來源于味覺受體、特別是基本上至少包含受體細胞外結(jié)構(gòu)域的味覺受體的序列。在一個實施方案中，配體結(jié)合區(qū)的細胞外結(jié)構(gòu)域可能包括N末端結(jié)構(gòu)域，以及可選地，跨膜結(jié)構(gòu)域的一部分，例如跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞外環(huán)。配體結(jié)合區(qū)可能結(jié)合配體，特別是可增強、模擬、阻斷和/或調(diào)節(jié)味覺、例如甜味或鮮味覺的化合物。
關(guān)于本發(fā)明T1R受體或多肽的術(shù)語”異源多聚體”或”異源多聚復(fù)合物”是指至少一種T1R受體和另一種受體，一般是另一種T1R受體多肽(或者另一種非T1R受體多肽)的功能性聯(lián)合。明白而言，本申請描述T1R的功能性相互依賴反映了其可能具有異源二聚的味覺受體復(fù)合物的功能。然而，如前所述，功能性相互依賴還可能反映間接的相互作用。例如，T1R3可能只是具有促進T1R1和T1R2表面表達的功能，T1R1和T1R2可能獨立作為味覺受體。或者，功能性味覺受體可能只由T1R3組成，T1R3在T1R1或T1R2控制下進行不同的加工，類似于鈣相關(guān)受體的RAMP依賴性加工。
在測試可調(diào)節(jié)T1R家族成員介導(dǎo)的味覺傳導(dǎo)的化合物的分析中，短語“功能性效應(yīng)”包括確定任何一個間接或直接受受體影響的參數(shù)，例如功能性、物理和化學(xué)效應(yīng)。它包括體內(nèi)、體外和離體(ex vivo)的配體結(jié)合，離子通量、膜電位、電流、轉(zhuǎn)錄、G蛋白結(jié)合、GPCR磷酸化或去磷酸化、基于構(gòu)象變化的分析、信號傳導(dǎo)、受體配體相互作用、第二信使?jié)舛?如cAMP、cGMP、IP3，或細胞內(nèi)鈣++)的變化，還包括其它生理學(xué)效應(yīng)，例如神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放的增加或減少。
在分析中的“確定功能性效應(yīng)”是指分析可使直接或間接受T1R家族成員影響的參數(shù)(例如功能性、物理和化學(xué)效應(yīng))增加或減少的化合物。這些功能性效應(yīng)可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行測量，例如光譜特征(例如熒光、吸收、折射率)、流體動力學(xué)(如形狀)、色譜或溶解特性、膜片鉗試驗(patch clamping)、電壓敏感性染料、全細胞電流、放射性同位素流出、可誘導(dǎo)標志、卵母細胞T1R基因表達的變化；組織培養(yǎng)細胞T1R表達；T1R基因的轉(zhuǎn)錄活化；配體結(jié)合分析；電壓、膜電位和電導(dǎo)變化；離子通量分析、細胞內(nèi)第二信使如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的變化；細胞內(nèi)鈣水平的變化；神經(jīng)遞質(zhì)釋放、構(gòu)象分析等。
T1R基因或蛋白質(zhì)的“抑制劑”、“活化劑”和“調(diào)節(jié)劑”用來指利用體內(nèi)和體外味覺傳導(dǎo)分析鑒定的抑制性、活化性或調(diào)節(jié)性的分子，例如配體、激動劑、拮抗劑及其同源物和模擬物。
抑制劑是指例如結(jié)合、部分或完全阻斷刺激、降低、防止、延遲活化、失活、脫敏或下調(diào)味覺傳導(dǎo)的化合物，例如拮抗劑?；罨瘎┦侵咐缈山Y(jié)合，刺激、增加、打開、活化、促進、增強活化、增敏或上調(diào)味覺傳導(dǎo)的化合物，例如激動劑。調(diào)節(jié)劑包括例如可改變受體與以下物質(zhì)相互作用的化合物可結(jié)合活化劑或抑制劑的細胞外蛋白質(zhì)(例如ebnerin和其它疏水載體家族成員)；G蛋白；激酶(例如參與受體失活和脫敏的視紫紅質(zhì)激酶和β腎上腺素能受體激酶的類似物)；以及同樣可使受體失活和脫敏的抑制蛋白(arrestin)。調(diào)節(jié)劑包括基因修飾的T1R家族成員，例如活性改變的、天然存在的以及合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學(xué)分子等。這些抑制劑和活化劑的分析包括，例如在細胞或細胞膜內(nèi)表達T1R家族成員，在有或無促味劑例如甜味促味劑的情況下，應(yīng)用推測的調(diào)節(jié)劑化合物，然后如上所述確定對味覺傳導(dǎo)的功能性效應(yīng)。包含T1R家族成員的樣品或分析經(jīng)過可能的激活劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理后與不用激活劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑的對照樣品比較，檢測調(diào)節(jié)的程度。陽性對照樣品(例如不加調(diào)節(jié)劑的甜味促味劑)的相對T1R活性值定為100％。
陰性對照樣品(例如不加味覺刺激物的緩沖液)的相對T1R活性值定為0％。當陽性對照樣品和調(diào)節(jié)劑的混合物使相對于陽性對照的T1R活性值約為80％、可選地50％或25-0％時，就獲得了對T1R的抑制。當相對于陽性對照樣品的T1R活性值為10％、25％、50％、75％、可選地150％、可選地150％、可選地200-500％或1000-3000％或更高時，就獲得了單獨調(diào)節(jié)劑對T1R的活化。
此處所用術(shù)語“純化的”、“基本純化的”和“分離的”是指不含其它不同化合物的狀態(tài)(這些不同化合物在自然狀態(tài)下通常與本發(fā)明化合物結(jié)合在一起)，從而按給定樣品的重量計，“純化的”、“基本純化的”和“分離的”物質(zhì)至少包含樣品質(zhì)量的0.5％、1％、5％、10％或20％、最優(yōu)選至少50％或70％。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些術(shù)語是指包含(以重量計)指定樣品至少95％質(zhì)量的本發(fā)明化合物。涉及核酸或多肽時，此處所用術(shù)語“純化的”、“基本純化的”和“分離的”是指不同于哺乳動物、特別是人體內(nèi)天然存在的一種純度或濃度。高于哺乳動物特別是人體內(nèi)天然存在的任何程度的純度或濃度，包括(1)從其它相關(guān)結(jié)構(gòu)或化合物中純化或(2)與通常在哺乳動物特別是人體內(nèi)不相關(guān)的結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合，均屬于“分離的”含義之內(nèi)。此處所述核酸或蛋白質(zhì)、或核酸或蛋白質(zhì)種類可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和過程分離，或與自然狀態(tài)下無關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物相連。
術(shù)語“核酸”或“核酸序列”指或者是單鏈或是雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。該術(shù)語包括核酸，即含有天然核苷酸已知類似物的寡核苷酸。該術(shù)語還包括具有合成主鏈的核酸樣結(jié)構(gòu)(參見例如，Oligonucleotides and Analogues，a PracticalApproach，ed.F.Eckstein，Oxford Univ.Press(1991)；AntisenseStrategies，Annals ofthe N.Y.Academy of Sciences，Vol.600，Eds.Baserga等人.(NYAS 1992)；Milligan，J.Med.chem.361923-1937(1993)；Antisense Researchand Applications(1993，CRC Press)，WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197(1997)；Strauss-Soukup，Biochemistry368692-8698(1997)；Samstag，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，6153-156(1996))。
除非另外指定，特定的核酸序列也暗指包括其保守性修飾變體(例如，簡并密碼子替換)和互補序列，以及清楚指明的序列。特別是，簡并密碼子替換可以通過產(chǎn)生例如其中一種或多種選定密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基替代的序列來實現(xiàn)(Batzer等人，NucleicAcidRes.，195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，2602605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，891-98(1994))。術(shù)語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸交替使用。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”此處可交替使用，是指氨基酸殘基多聚物。該術(shù)語適用于其中一種或多種氨基酸殘基是對應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸多聚物，以及天然存在的氨基酸多聚物和非天然存在的氨基酸多聚物。
術(shù)語“質(zhì)膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)(plasma membrane translocation domain)域”或簡稱“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”是指當其摻入多肽編碼序列時，與沒有該結(jié)構(gòu)域相比，能夠有效地把雜合(“融合”)蛋白“伴隨(chaperone)”或“轉(zhuǎn)位”至細胞質(zhì)膜的多肽結(jié)構(gòu)域。例如，“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”可來源于牛視紫紅質(zhì)受體多肽(一個7跨膜受體)的氨基末端。但是，可以使用任何哺乳動物的視紫紅質(zhì)，以及其它的轉(zhuǎn)位促進序列。因此，轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)位7跨膜融合蛋白至質(zhì)膜時特別有效，并且包含氨基末端轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如味覺受體多肽)比沒有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)更容易有效地被運輸至質(zhì)膜上。但是，如果多肽N末端結(jié)構(gòu)域在結(jié)合中具有活性，例如本發(fā)明的T1R受體，則可優(yōu)選使用其它的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。例如，可使用此處所述PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用肽。
此處所述“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”、“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和嵌合受體組分也包括具有與示例序列基本一致的結(jié)構(gòu)和活性的“類似物”、或“保守性變體”和“模擬物”(“肽模擬物”(peptidomimetic))。因此，術(shù)語“保守性變體”或“類似物”或“模擬物”指具有修飾的氨基酸序列的多肽，這類變化基本上不改變此處定義的多肽的(保守性變體的)結(jié)構(gòu)和/或活性。這包括氨基酸序列的保守性修飾變異，即對于蛋白質(zhì)活性無關(guān)緊要的殘基的氨基酸替換、添加或缺失，或性質(zhì)類似的殘基的氨基酸替換(例如酸性、堿性、正電或負電、極性或非極性等)，使得甚至替換關(guān)鍵的氨基酸也基本上不改變結(jié)構(gòu)和/或活性。
更具體而言，”保守性修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守性修飾變體是指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者如果該核酸不編碼氨基酸序列，則指基本相同的序列。由于遺傳密碼子的簡并性，大量功能性相同的核酸可編碼任一特定的蛋白質(zhì)。
例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼子決定的丙氨酸每一個位置，可以將該密碼子改變?yōu)槿我凰鰧?yīng)密碼子，而不改變編碼的多肽。
該核酸變異為“沉默變異”，是一種保守性修飾的變異。此處每一個編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸的每一個可能的沉默變異。技術(shù)人員應(yīng)當認識到，核酸中的每個密碼子(除了通常情況下甲硫氨酸的唯一密碼子AUG，以及通常情況下色氨酸的唯一密碼子TGG)都可以經(jīng)修飾產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每一個沉默變異均隱含在每個描述的序列中。
能夠提供功能相似的氨基酸的保守性替換表在本領(lǐng)域眾所周知。例如，一個選擇保守性替換的示例性指南包括(原始殘基，其后是示例替換)ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。另一示例指南使用下列六組，每組包含相互保守性替換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(I)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(參見例如，Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Vrlag(1979))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解上述替換并非唯一可能的保守性替換。例如，出于某些目的，人們可能將所有帶電氨基酸互為保守性替換體，而不管是正電還是負電。另外，在編碼序列中改變、添加或缺失單個氨基酸或小部分氨基酸的各個替換、缺失或添加也被認為是“保守性修飾變異”。
術(shù)語“模擬物”和“肽模擬物”是指合成的化學(xué)化合物，它具有與本發(fā)明多肽基本相同的結(jié)構(gòu)和/或功能性特征，例如轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或嵌合受體。模擬物可以完全由合成的非天然氨基酸類似物組成，或者是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。模擬物也可以具有任意數(shù)量的天然氨基酸保守性替換，只要該替換也基本上不改變模擬物的結(jié)構(gòu)和/或活性即可。
對于本發(fā)明保守性變體的多肽，常規(guī)實驗將確定模擬物是否屬于本發(fā)明的范圍，即其結(jié)構(gòu)和/或活性基本沒有改變。多肽模擬物組分可包含任何非天然結(jié)構(gòu)性組分的組合，其通常來自三個結(jié)構(gòu)基團a)除天然酰胺鍵(“肽鍵”)連接之外的殘基連接基團；b)非天然殘基替代天然存在的氨基酸殘基；或c)可誘導(dǎo)二級結(jié)構(gòu)模擬物的殘基，即誘導(dǎo)或穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)例如β轉(zhuǎn)角、γ轉(zhuǎn)角、β折疊片和α螺旋構(gòu)象等的殘基。當多肽的全部或某些殘基是通過化學(xué)手段而非天然肽鍵連接時，該多肽就可以被鑒定為模擬物。各個肽模似物殘基可以通過肽鍵、其它化學(xué)鍵或偶聯(lián)手段連接，諸如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰亞胺、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)。可以作為傳統(tǒng)酰胺鍵(“肽鍵”)的替代物的連接基團包括，例如酮亞甲基(例如-C(＝O)-CH2-替換-C(＝O)-NH-)、氨亞甲基(CH2-NH)、乙烯、烯烴(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(參見例如，Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp267-357，“Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY(1983))。包含全部或某些非天然殘基替代天然存在的氨基酸殘基的多肽也可以被鑒定為模擬物；在科學(xué)和專利文獻中對非天然殘基有詳盡描述。
“標記”或”可檢測的部分”是可以通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測到的組分。例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如通常用于ELISA的)、生物素、地高辛、或半抗原以及可被檢測(例如通過在肽中摻入放射性標記)或可用于檢測可特異性與肽反應(yīng)的抗體的蛋白質(zhì)。
“標記的核酸探針或寡核苷酸”是指或通過接頭或化學(xué)鍵的共價結(jié)合，或通過離子、范德華力、靜電、或氫鍵的非共價結(jié)合而與標記物結(jié)合的核酸或寡核苷酸，這樣通過檢測探針上結(jié)合的標記就可以檢測探針的存在。
此處所用“核酸探針或寡核苷酸”定義為能夠通過一種或多種類型的化學(xué)鍵，一般是通過氫鍵形成的互補堿基配對，而與互補序列的靶核酸結(jié)合的核酸。此處所用探針可包括天然(即A、G、C或T)或修飾堿基(7-脫氮鳥苷酸、肌苷等)。另外，探針中的堿基可以由磷酸二酯鍵之外的連接相連，只要不影響雜交即可。因此，例如探針可以是其組成堿基由肽鍵而非磷酸二酯鍵相連的肽核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針可以結(jié)合與探針序列不完全互補的靶序列。探針任選直接標記同位素、發(fā)色團、發(fā)光團、色原，或間接標記如可隨后結(jié)合鏈霉親和素復(fù)合物的生物素。通過分析探針的有無，人們可以檢測是否存在選擇序列或亞序列。
當針對核酸部分使用術(shù)語“異源”時，表示該核酸包含在天然狀態(tài)下沒有同樣相互關(guān)系的兩個或多個亞序列。例如，所述核酸一般重組產(chǎn)生，組織兩個或多個非相關(guān)基因序列形成新的功能性核酸分子，例如，一個來源的啟動子以及另一個來源的編碼區(qū)。類似地，異源蛋白質(zhì)表示該蛋白質(zhì)包含在天然狀態(tài)下沒有同樣相互關(guān)系的兩個或多個亞序列(例如，融合蛋白質(zhì))。
“啟動子”定義為指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。此處所用啟動子包括在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必要核酸序列，例如在聚合酶II型啟動子情況下的TATA元件。啟動子還任選包括遠端增強子或阻遏子元件，可位于離轉(zhuǎn)錄起始位點多達幾千堿基對處?！敖M成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下都具有活性的啟動子。
“誘導(dǎo)型”啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動子。術(shù)語“有效連接”是指核酸表達控制序列(例如啟動子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點陣列)和第二個核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列指導(dǎo)第二個序列所對應(yīng)核酸的轉(zhuǎn)錄。
此處所用“重組”是指合成或其它體外操作的多核苷酸(例如，“重組多核苷酸”)，以及使用重組多核苷酸在細胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白質(zhì)”)?！爸亟M方法”也包括將具有不同來源的各種編碼區(qū)或結(jié)構(gòu)域或啟動子序列的核酸連接到表達盒或載體中表達，例如誘導(dǎo)型或組成型表達包含本發(fā)明易位結(jié)構(gòu)域以及使用本發(fā)明引物擴增的核酸序列的融合蛋白。
此處所用”穩(wěn)定細胞系”是指穩(wěn)定、即長期表達異源核酸序列、即T1R或G蛋白的細胞系。在優(yōu)選實施方案中，利用包含T1R表達構(gòu)建體、即T1R1、T1R2和/或T1R3的線性化載體轉(zhuǎn)染合適的細胞，通常是哺乳動物細胞，例如HEK-293細胞，產(chǎn)生這種穩(wěn)定細胞系。最優(yōu)選地，通過共轉(zhuǎn)染表達hT1R1和hT1R3、或hT1R2和hT1R3的兩種線性化質(zhì)粒，并通過合適篩選方法產(chǎn)生其中穩(wěn)定整合這些基因的細胞系，從而產(chǎn)生這種穩(wěn)定細胞系。最優(yōu)選地，該細胞系還穩(wěn)定表達G蛋白，例如Gα15。
短語“選擇性(或特異性)雜交”指在嚴謹性雜交條件下，一種分子僅與存在于復(fù)雜混合物中(例如，總細胞或文庫DNA或RNA)的特定核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈或雜交。
短語“嚴謹性雜交條件”是指在這樣的條件下，探針僅與通常存在于核酸復(fù)雜混合物中的靶序列雜交，而不與其它序列雜交。嚴謹性條件是序列依賴性的，并且在不同情況下會有所不同。長序列在較高溫度下特異性雜交。有關(guān)核酸雜交的詳盡指南參見Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of Principles ofHybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays”(1993)。一般而言，選擇的嚴謹性條件比特定序列在指定離子強度pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10℃。Tm是指(在指定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡后與靶序列互補的探針中有50％與靶序列雜交時的溫度(靶序列過量時，在Tm下，平衡后利用了50％的探針)。嚴謹性條件為鹽濃度小于約1.0M鈉離子、一般為約0.01-1.0M鈉離子(或其它鹽)濃度、pH7.0-8.3、短探針(例如10-50個核苷酸)時溫度至少約30℃、長探針(例如大于50個核苷酸)時溫度至少約60℃。加入去穩(wěn)定的試劑如甲酰胺也可以形成嚴謹性條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是背景的兩倍，可選10倍于雜交背景。典型嚴謹性雜交條件如下50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS，42℃溫育，或者5xSSC、1％SDS，65℃溫育，在0.2xSSC和0.1％SDS、65℃下洗滌。該雜交和洗滌步驟可以進行例如1、2、5、10、15、30、60分鐘或更長時間。
如果核酸編碼的多肽基本上相關(guān)，則在嚴謹性條件下互不雜交的核酸仍然基本上相關(guān)。例如，利用遺傳密碼允許下的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時就會發(fā)生這種情況。在這些情況下，核酸通常在中等嚴謹性雜交條件下雜交。典型的”中等嚴謹性雜交條件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的緩沖液中、于37℃雜交，并于1xSSC、45℃洗滌。該雜交和洗滌步驟可以進行例如1、2、5、10、15、30、60分鐘或更長時間。陽性雜交至少是背景值的兩倍。普通技術(shù)人員很容易認識到，可以利用其它的雜交和洗滌條件提供類似嚴謹性的條件。
“抗體”是指包含免疫球蛋白基因或其片段的構(gòu)架區(qū)域的多肽，其可特異性地結(jié)合并識別抗原。公認的免疫球蛋白基因包括к、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及許多免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈可分類為к或λ。重鏈可分類為γ、μ、α、δ或ε，它們依次分別確定了免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對多肽鏈具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈N末端確定了一個約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，主要負責抗原識別。術(shù)語”可變輕鏈”(VL)和”可變重鏈”(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
“嵌合抗體”是指一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替換或交換，以至于抗原結(jié)合位點(可變區(qū))與類別、效應(yīng)物功能和/或物種不同或被改變的恒定區(qū)相連，或與可賦予嵌合抗體以新的特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)相連接；或(b)可變區(qū)或其部分被改變、替換或交換成具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)。
“抗T1R”抗體是可特異性結(jié)合T1R基因、cDNA或其亞序列編碼的多肽的抗體或抗體片段。
術(shù)語“免疫分析”是使用抗體特異性結(jié)合抗原的分析。免疫分析的特征在于使用特定抗體的特異性結(jié)合特性來分離、定向和/或定量抗原。
在涉及蛋白質(zhì)或肽時，短語與抗體“特異性(或選擇性)結(jié)合”或“特異性(或選擇性)進行免疫反應(yīng)”是指可在異源蛋白質(zhì)和其它生物產(chǎn)品的群體中確定蛋白質(zhì)存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫分析條件下，指定抗體與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合至少是背景值的兩倍，并且基本上不與樣品中存在的其它蛋白質(zhì)明顯結(jié)合。這些條件下與抗體的特異性結(jié)合可能需要針對特定蛋白質(zhì)的特異性進行選擇的抗體。例如，可選擇針對特定物種如大鼠、小鼠、或人T1R家族成員產(chǎn)生的多克隆抗體，以獲得那些僅與T1R多肽或其免疫原部分而非其它蛋白質(zhì)(T1R多肽直向進化同源物(ortholog)或多態(tài)性變體和等位基因除外)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的多克隆抗體。這種選擇過程可以通過去除與其它物種T1R分子、或其它T1R分子交叉反應(yīng)的抗體來完成。也可以選擇只識別T1R GPCR家族成員而非其它家族GPCR的抗體。
多種免疫分析形式可以用于選擇與特定蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，一般使用固相ELISA免疫分析選擇與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體(例如參見，Harlow&Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，(1988)，其中有關(guān)可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫分析形式和條件的描述)。典型特異性或選擇性反應(yīng)至少是背景信號或噪聲的兩倍，更典型地大于背景10-100倍。
短語“選擇性結(jié)合”是指核酸與另一核酸如上所述“選擇性雜交”的能力，或抗體與蛋白質(zhì)如上所述“選擇性(特異性)結(jié)合”的能力。
術(shù)語“表達載體”是指意在于任何細胞包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞中，體內(nèi)或體外、組成型或誘導(dǎo)型表達本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達系統(tǒng)。該術(shù)語包括線性或環(huán)狀表達系統(tǒng)。該術(shù)語包括保持附加體或整合至宿主細胞基因組中的表達系統(tǒng)。表達系統(tǒng)可具有自我復(fù)制能力，或者沒有，即在細胞內(nèi)只驅(qū)動瞬時表達。該術(shù)語包括重組表達“盒”，其中只包含重組核酸轉(zhuǎn)錄所需的最少元件。
“宿主細胞”是指包含表達載體并支持該表達載體復(fù)制或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲動物、蠕蟲或哺乳動物細胞如CHO、Hela和HEK-293等，例如培養(yǎng)的細胞、外植體(explants)和體內(nèi)細胞。
T1R多肽的分離和表達可如下所述完成本發(fā)明T1R或其片段或變體的分離和表達?？梢允褂肞CR引物擴增編碼味覺受體配體結(jié)合區(qū)的核酸，可選地建立這些核酸的文庫。可以使用各個表達載體或表達載體文庫感染或轉(zhuǎn)染宿主細胞，用來功能性表達這些核酸或文庫。這些基因和載體可在體外或體內(nèi)制備并表達。技術(shù)人員應(yīng)認識到，通過調(diào)節(jié)本發(fā)明載體中基因和核酸(例如啟動子、增強子等)的表達或活性，可以得到改變和控制核酸表達的理想表型?？梢允褂盟鲇糜谔岣呋蚪档捅磉_或活性的任何已知方法?？梢越Y(jié)合本領(lǐng)域任何已知的方法或方案實施本發(fā)明，這些方法或方案在科學(xué)和專利文獻中有詳盡描述。
本發(fā)明的核酸序列以及用于實施本發(fā)明的其它核酸分子，不論RNA、cDNA、基因組DNA、載體、病毒或其雜合體，可以從多種來源分離、基因工程、擴增、和/或重組表達?？梢允褂萌魏沃亟M表達系統(tǒng)，除哺乳動物細胞外包括例如細菌、酵母、昆蟲或植物系統(tǒng)。
另外，可利用下述公知的化學(xué)合成技術(shù)體外合成這些核酸分子，例如Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444(1997)；Frenkel，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.19373-380(1995)；Blomers，Biochemistry 337886-7896(1994)；Narang，Metb.Enzymol.6890(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.221859(1981)；美國專利4,458,066所述。然后或者通過合成互補鏈并在適當條件下一起退火，或通過利用合適的引物序列及DNA聚合酶加入互補鏈，可以獲得雙鏈DNA片段。
核酸操作技術(shù)，例如產(chǎn)生序列突變、亞克隆、標記探針、測序、雜交等，在科學(xué)和專利文獻中有詳盡描述。參見例如，Sambrook，ed.，Molecular Cloninga Laboratory Manual(2nd ed)，Vols.1-3，ColdSpring Harbor laboratory (1989)；Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley&Sons，Inc.，NewYork(1997)；Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
核酸、載體、衣殼(capsids)、多肽等可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的眾多通用方法中任何一個來分析和定量。其中包括，例如分析生物化學(xué)方法如NMR、分光光度法、放射顯影、電泳、毛細管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)和超擴散層析等，各種免疫學(xué)方法如流體或凝膠沉淀素反應(yīng)、免疫擴散、免疫電泳、放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、免疫熒光分析，Southern分析、Northern分析、點印跡分析、凝膠電泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶物質(zhì)或信號擴增方法、放射性標記、閃爍計數(shù)以及親和層析。
寡核苷酸引物可以用來擴增編碼味覺受體配體結(jié)合區(qū)的核酸片段。此處所述核酸還可以利用擴增技術(shù)進行克隆或定量測量。擴增方法也為本領(lǐng)域公知，包括例如聚合酶鏈反應(yīng)、PCR(PCRProtocols，aGuide to Methods and Applications，ed.Innis.Academic Press，N.Y.(1990)以及PCR Strategies，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995)、連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR，例如參見，Wu，Genomics 4560(1989)；Landegren，Science 2411077，(1988)；Barringer，Gene 89117(1990))；轉(zhuǎn)錄擴增(例如參見，Kwoh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))；自動維持序列復(fù)制(例如參見，Guatelli，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874(1990))；Q-β復(fù)制酶擴增(例如參見，Smith，J.Clin.Microbiol.351477-1491(1997))；自動Q-β復(fù)制酶擴增分析(例如參見，Burg，Mol.Cell.Probes 10257-271(1996))以及其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；還參見Berger，Methods Enzymol.152307-316(1987)；Sambrook；Ausubel；美國專利4,683,195和4,683,202；Sooknanan，Biotechnology13563-564(1995)。引物可以設(shè)計成保留“供體”7膜受體的原始序列?；蛘?，引物可以編碼保守性替換(例如疏水性殘基換成疏水性殘基，參見上述)或功能上有利的替換(例如，不干擾質(zhì)膜插入、導(dǎo)致肽酶裂解、導(dǎo)致受體非正常折疊等)的氨基酸殘基。擴增以后，如有需要，使用常規(guī)分子生物學(xué)方法，按照本領(lǐng)域已知的方法，將核酸逐一或以文庫形式克隆到任一載體；擴增核酸的體外克隆方法如美國專利5,426,039所述。
引物對可以設(shè)計成選擇性擴增T1R家族成員的配體結(jié)合區(qū)。對于不同的配體或促味劑，這些區(qū)域可能有所變化。因此，可能是一種促味劑的最小結(jié)合區(qū)域，對于第二種促味劑則可能太局限。因此，可能擴增包含不同細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的不同大小的配體結(jié)合區(qū)。
設(shè)計簡并引物對的范例為本領(lǐng)域眾所周知。例如，COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CODEHOP)策略計算機程序可以從http//blocks.fhcrc.org/codehop.html獲得，并從Blockmaker多序列比對地址直接連接，由一套相關(guān)的蛋白質(zhì)序列如已知的味覺受體配體結(jié)合區(qū)開始，進行雜合引物預(yù)測(例如參見，Rose，Nucleic Acids Res.261628-1635(1998)；Singh，Biotechniques 24318-319(1998))。
合成寡核苷酸引物對的手段為本領(lǐng)域公知?？梢允褂谩疤烊弧眽A基對或合成堿基對。例如，使用人工核苷酸堿基能夠提供操作引物序列、產(chǎn)生更加復(fù)雜的擴增產(chǎn)物混合物的通用方法。人工核苷酸堿基的多個家族能夠通過內(nèi)部鍵旋轉(zhuǎn)而采取多種氫鍵方向，從而提供簡并分子識別的方法。這些類似物摻入PCR引物的單個位點可產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的復(fù)雜文庫。例如參見，Hoops，Nucleic Acids Res.254866-4871(1997)。也可以使用非極性分子模仿天然DNA堿基的形狀。腺嘌呤的非氫鍵形狀模擬物可以有效和選擇性地針對胸腺嘧啶非極性形狀的模擬物進行復(fù)制(例如參見，Morales，Nat.Struct.Biol.5950-954(1998))。例如，兩個簡并堿基可以是嘧啶堿基6H，8H-3，4-二羥基嘧啶并[4，5-c][1，2]嗪-7-酮、或嘌呤堿基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(例如參見，Hill，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 954258-4263(1998))。本發(fā)明示例性簡并引物摻入有核堿基(nucleobase)類似物5’-二甲氧三苯甲基-N-苯甲?；?2’-脫氧胞苷、3’-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(參見上文序列中的術(shù)語“P”)。這種嘧啶類似物與嘌呤，包括A和G殘基形成氫鍵。
與此處公開的味覺受體基本相同的多態(tài)性變體、等位基因和種間同源體，可以使用上述核酸探針進行分離。或者，通過利用針對T1R多肽制備的抗血清或純化抗體對表達同源體進行免疫學(xué)檢測(其同樣識別并選擇性結(jié)合T1R同源體)，可以使用表達文庫克隆T1R多肽及其多態(tài)性變體、等位基因和種間同源體。
可以使用簡并引物對擴增(如PCR)合適的核酸序列，得到編碼味覺受體的配體結(jié)合區(qū)的核酸。被擴增的核酸可以來自任何細胞或組織的基因組DNA、或來源于味覺受體表達細胞的mRNA或cDNA。
在一個實施方案中，可以構(gòu)建包含與轉(zhuǎn)位序列融合的編碼T1R的核酸的雜合蛋白質(zhì)編碼序列。同樣提供了包含轉(zhuǎn)位基序以及化學(xué)感受受體、特別是味覺受體其它家族的促味劑結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合T1Rs。這些核酸序列可以有效連接轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，例如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列、啟動子和增強子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列、以及對DNA轉(zhuǎn)錄成RNA有用的其它序列。在重組表達盒、載體和轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)成中，可以利用啟動子片段指導(dǎo)目的核酸在所有目的細胞或組織中表達。
在另一實施方案中，融合蛋白質(zhì)可能包括C末端或N末端轉(zhuǎn)位序列。此外，融合蛋白質(zhì)可以包含另外的元件，例如用于蛋白質(zhì)檢測、純化或其它應(yīng)用。促進檢測和純化的結(jié)構(gòu)域包括，例如金屬鰲合肽如聚組氨酸序列段、組氨酸色氨酸組件或其它可以在固定化的金屬上進行純化的結(jié)構(gòu)域；麥芽糖結(jié)合蛋白；可以在固定化的免疫球蛋白上進行純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域；或FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)域(Immunex Corp，Seattle WA)。
在轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(供有效的質(zhì)膜表達)以及新翻譯多肽的其余部分之間，包含可斷裂的連接物序列，例如Xa因子(例如參見，Ottavi，Biochimie 80289-293(1998))、枯草桿菌蛋白酶識別基序(例如參見，Polyak，Protein Eng.10615-619(1997))、腸激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等，可能有利于促進純化。例如，一個構(gòu)建體可以包括一條與6個組氨酸殘基相連的多肽編碼核酸序列，后接硫氧還蛋白、腸激酶裂解位點(例如參見，Williams，Biochemistry 341787-1797(1995)))以及一個C末端轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。該組氨酸殘基可促進檢測和純化，而腸激酶裂解位點提供了從其余融合蛋白中純化目的蛋白質(zhì)的手段。有關(guān)編碼融合蛋白質(zhì)的載體以及融合蛋白質(zhì)應(yīng)用的技術(shù)在科學(xué)和專利文獻中已有詳細描述，例如參見，Kroll，DNA Cell.Biol.12441-53(1993)。
包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼序列的表達載體(不管是單個的表達載體還是表達載體文庫)可以引入細胞的基因組或胞質(zhì)或細胞核中，并利用各種常規(guī)技術(shù)進行表達，這在科學(xué)和專利文獻中有詳盡描述。例如參見，Roberts，Nature 328731(1987)；Berger同上；Schneider，Protein Expr.Purif.643510(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。生物試劑和實驗設(shè)備廠家的產(chǎn)品信息也提供有關(guān)已知生物學(xué)方法的信息。載體可以從天然來源分離、從ATCC或GenBank文庫諸如此類的來源獲得、或通過合成或重組方法制備。
核酸可以使用在細胞內(nèi)穩(wěn)定或瞬時表達(例如附加體表達系統(tǒng))的表達盒、載體或病毒進行表達?？梢詫⑦x擇標志引入表達盒和載體中，從而賦予轉(zhuǎn)化細胞和序列以可選擇的表型。例如，選擇標志可以編碼供附加體維持和復(fù)制，以至于不需要整合至宿主基因組中。例如，標志可能編碼抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素)或除草劑抗性(例如chlorosulfuron或Basta)，以選擇轉(zhuǎn)化了目的DNA序列的細胞(例如參見，Blondelet-Rouault，Gene 190315-317(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281992-997(1997))。由于賦予新霉素或潮霉素這類底物抗性的選擇標志基因只能用于組織培養(yǎng)，也可以使用化學(xué)抗性基因作為體外和體內(nèi)的選擇性標志。
嵌合核酸序列可編碼位于任何7跨膜多肽內(nèi)部的T1R配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。由于7跨膜受體多肽具有相似的一級序列以及二級和三級結(jié)構(gòu)，通過序列分析可以很容易地鑒定結(jié)構(gòu)域(例如細胞外結(jié)構(gòu)域、TM結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域等)。例如，同源性模建、傅立葉分析和螺旋周期檢測可以鑒定并表征7跨膜受體序列的7個結(jié)構(gòu)域?？焖俑盗⑷~轉(zhuǎn)換(FFT)算法可用于評價表征被分析序列疏水性和可變性概況的顯性周期。周期檢測增強和α螺旋周期指數(shù)可以通過例如Donnelly，Protein Sci.255-70(1993)的方法完成。其它比對和模建算法為本領(lǐng)域所公知，例如參見Peitsch，Receptors Channels 4161-164(1996)；kyte&Doolittle，J.Md.Bio.，157105-132(1982)；Cronet，Protein Eng.659-64(1993)。
本發(fā)明還包括具有指定核苷酸和氨基酸序列的DNA和蛋白質(zhì)，而且包括DNA片段，特別是例如40、60、80、100、150、200或250、或更多核苷酸的片段，以及例如10、20、30、50、70、100或150、或更多氨基酸的蛋白質(zhì)片段。可選地，核酸片段可編碼能夠與針對T1R家族成員產(chǎn)生的抗體相結(jié)合的抗原性多肽。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段可選地是能夠與針對T1R家族成員產(chǎn)生的抗體相結(jié)合的抗原性片段。
本發(fā)明還包括嵌合蛋白質(zhì)，其包含至少一種此處所述T1R多肽的至少10、20、30、50、70、100或150、或更多的氨基酸，與代表另一GPCR、優(yōu)選7跨膜超家族成員的全部或部分的另外的氨基酸序列相偶聯(lián)。這些嵌合子可以由此處受體和另一個GPCR制備，或組合兩種或多種所述T1R受體而制備。在一個實施方案中，該嵌合子的一部分對應(yīng)或來源于本發(fā)明T1R多肽的細胞外結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，該嵌合子的一部分對應(yīng)或來源于此處描述的T1R多肽的細胞外結(jié)構(gòu)域以及一個或多個跨膜結(jié)構(gòu)域，其余部分來自另一個GPCR。嵌合受體為本領(lǐng)域所公知，其制備技術(shù)以及引入其中的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)域或片段的選擇及界定也為本領(lǐng)域所公知。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員這方面的知識很容易用于制備這種嵌合受體。使用這種嵌合受體可以提供例如此處特別公開的一種受體的味覺選擇性特征，并與另一個受體的信號傳導(dǎo)特征相偶聯(lián)，例如現(xiàn)有技術(shù)分析系統(tǒng)中使用的公知的受體。
如上所述，這種嵌合體、天然T1R受體的類似物、或天然T1R受體組合或聯(lián)合可以結(jié)合到通常影響甜味覺或鮮味覺的分子、或由其活化。功能性嵌合的T1R受體或受體組合是這樣的分子，其單獨或與其它T1R或其它GPCR組合(其自身可能就是嵌合體)表達時可以結(jié)合到味覺刺激物、特別是甜(T1R2/3)或鮮(T1R1/3)味覺刺激物，或者由其活化。引起甜味覺的分子包括天然和人工甜味劑，例如蔗糖、天冬甜精(aspartame)、木糖醇、環(huán)己氨基磺酸鹽等，引起鮮味覺的分子包括谷氨酸及其類似物、以及可結(jié)合天然T1R1和/或T1R3的其它化合物，例如5’-核苷酸。
例如，諸如配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、N末端結(jié)構(gòu)域、C末端結(jié)構(gòu)域或其任意組合的結(jié)構(gòu)域，可以共價連接到異源蛋白質(zhì)。例如，T1R細胞外結(jié)構(gòu)域可連接至異源GPCR跨膜結(jié)構(gòu)域，或異源GPCR細胞外結(jié)構(gòu)域可連接至T1R跨膜結(jié)構(gòu)域?？梢允褂闷渌蛇x的異源蛋白質(zhì)，例如綠色熒光蛋白質(zhì)。
表達本發(fā)明的T1R、片段、嵌合體或變體的宿主細胞也處在本發(fā)明范圍之內(nèi)。為了獲得克隆的基因或核酸(例如編碼本發(fā)明的T1R、片段或變體的cDNA)的高水平表達，技術(shù)人員通常將目的核酸序列亞克隆至包含指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子的表達載體中，對于編碼蛋白質(zhì)的核酸，其中還包含供翻譯起始的核糖體結(jié)合位點。合適的細菌啟動子為本領(lǐng)域所公知，例如Sambrook等人所述。然而可以使用細菌或真核表達系統(tǒng)。
可以使用任何公知的將外源核苷酸序列引入宿主細胞的方法。其中包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、polybrene、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、微注射、胞質(zhì)載體(plasma vector)、病毒載體以及將克隆基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質(zhì)引入宿主細胞的其它任何公知方法(例如參見，Sambrook等人)。只要求所用特定基因工程方法能夠成功地將至少一個核酸分子引入能夠表達目的T1R、片段或變體的宿主細胞中。
將表達載體引入細胞以后，轉(zhuǎn)染細胞在適合目的受體、片段或變體表達的條件下培養(yǎng)，然后使用標準技術(shù)將其從培養(yǎng)物中回收。這種技術(shù)的實例為本領(lǐng)域公知。例如參見WO 00/06593，按符合本公開內(nèi)容的方式引用，以供參考。
T1R多肽的檢測除了使用核酸雜交技術(shù)檢測T1R基因及基因表達以外，還可以使用免疫分析檢測T1R，例如鑒定味覺受體細胞以及T1R家族成員的變體?？梢允褂妹庖叻治龆ㄐ曰蚨糠治鯰1R。適用技術(shù)的綜述參見Harlow&Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)。
1.T1R家族成員的抗體制備與T1R家族成員特異性反應(yīng)的單克隆抗體和多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(例如參見Coligan，Current Protocols inImmunology(1991)；Harlow&Lane，supra；Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice(2d ed.1986)；以及Kohler&Milstein，Nature，256495-497(1975))。此類技術(shù)包括通過從噬菌體或類似載體的重組抗體文庫中選擇抗體來制備抗體，以及通過免疫兔或小鼠來制備單克隆抗體和多克隆抗體(例如參見Huse等人，Science，2461275-1281(1989)；Ward等人，Nature，341544-546(1989))。
許多包含T1R的免疫原可用于制備與T1R家族成員特異性反應(yīng)的抗體。例如，可如此處所述分離重組T1R多肽、或其抗原性片段。合適的抗原性區(qū)包括，例如用于鑒定T1R家族成員的共有序列。重組蛋白質(zhì)可以如上所述在真核或原核細胞中表達，并如上文一般所述進行純化。重組蛋白質(zhì)是制備單克隆或多克隆抗體的優(yōu)選免疫原。另外，來源于此處公開序列并綴合載體蛋白質(zhì)的合成肽可以用作免疫原。也可以使用純凈或非純凈形式的天然存在蛋白質(zhì)。然后將產(chǎn)物注射到能夠產(chǎn)生抗體的動物中。可產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體，其后用于免疫分析以測量蛋白質(zhì)。
制備多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。例如，使用標準佐劑例如弗氏佐劑和標準免疫程序，用蛋白質(zhì)免疫近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔。通過采血并測定與T1R的反應(yīng)滴度來監(jiān)測動物對免疫原制劑的免疫應(yīng)答。當獲得合適的針對免疫原的高滴度抗體后，收集動物血液并制備抗血清。如果需要，可以進一步分級分離抗血清來富集與蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體(參見Harlow&Lane，同上)。
可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的多種技術(shù)獲得單克隆抗體。簡而言之，通常經(jīng)過與骨髓瘤細胞融合，可使目的抗原免疫動物的脾細胞永生化(參見kohler&Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976))。永生化的另外方法包括利用E-B病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、或反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化、或本領(lǐng)域公知的其它方法。篩選由單個永生化細胞形成的克隆，以產(chǎn)生針對抗原具有所需特異性和親和性的抗體，利用多種技術(shù)可以提高這些細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量，包括注射到脊椎動物宿主的腹腔內(nèi)。或者，按照Huse等人，Science，2461275-1281(1989)概述的一般方法，通過篩選人B細胞DNA文庫，可以分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。
收集單克隆抗體和多克隆血清并在免疫分析中利用免疫原蛋白質(zhì)滴定，例如利用固定于固相支持物的免疫原進行的固相免疫分析。通常，選擇具有104或更高滴度的多克隆抗血清，并使用競爭結(jié)合免疫分析，測試其對非T1R多肽、或甚至其它T1R家族成員、或其它生物體的其它相關(guān)蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體通常結(jié)合Kd為至少約0.1mM，更通常至少約1pM，可選地至少約0.1pM或更好，并且可選地0.01pM或更好。
一旦獲得T1R家族成員特異性抗體，則可以利用多種免疫分析方法檢測各個T1R蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段。有關(guān)免疫學(xué)和免疫分析方法的綜述，參見Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr eds.，7th ed.1991)。此外，本發(fā)明的免疫分析可以由幾種形式來完成，詳述于Enzyme Immuncassay(Maggio，ed.，1980)；以及Harlow&Lane，同上。
2.免疫學(xué)結(jié)合分析可利用任一公知的免疫學(xué)結(jié)合分析檢測和/或定量T1R蛋白、片段和變體(例如參見美國專利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。一般免疫分析的綜述還參見Methods in Cell BiologyAutibodies in Cell Biology，volume 37(Asai，ed.1993)；Basicand Clinical Immunology(Stiters&Terr，eds.，7th ed.1991)。免疫學(xué)結(jié)合分析(或免疫分析)通常使用能夠特異性結(jié)合所選蛋白質(zhì)或抗原(此處為T1R家族成員或其抗原性亞序列)的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的以及如上所述的多種方法中任一種制備抗體(例如抗-T1R)。
免疫分析也經(jīng)常使用標記物，特異性結(jié)合并標記抗體和抗原形成的復(fù)合物。標記物本身可能是包含抗體/抗原復(fù)合物的一個部分。因此，標記物可以是標記的T1R多肽或標記的抗T1R抗體?；蛘撸瑯擞浳锟梢允堑谌齻€部分，例如特異性結(jié)合抗體/T1R復(fù)合物的第二抗體(第二抗體通常對第一抗體所來源的物種的抗體是特異的)。能夠特異結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的其它蛋白質(zhì)，如蛋白A或蛋白G也可用作標記物。這些蛋白質(zhì)與許多物種的免疫球蛋白恒定區(qū)顯示強烈的非免疫原性反應(yīng)性(例如參見，Kronval等人，J.Immunol.，1111401-1406(1973)；Akerstrom等人，J.Immunol.，1352589-2542(1985))?？衫每蓹z測部分修飾標記物，例如生物素，其可與另一分子特異性結(jié)合，如鏈霉親和素。多種可檢測部分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
貫穿整個分析，每次結(jié)合試劑都需要溫育和/或漂洗步驟。溫育步驟從約5秒鐘到幾小時不等，可選地約5分鐘-24小時。但是，溫育時間取決于分析形式、抗原、溶液體積、濃度等。分析通常在室溫下進行，盡管可以在例如10℃-40℃的溫度范圍內(nèi)進行。
A.非競爭性分析形式檢測樣品中T1R多肽的免疫分析既可以是競爭性或非競爭性的。非競爭性免疫分析是直接測定抗原量的分析。例如在一個優(yōu)選的“夾心”(sandwich)分析中，抗T1R抗體可直接被結(jié)合到其所固定的固相基質(zhì)上。然后這些固定化抗體捕獲試樣中的T1R多肽。T1R多肽因而被固定化，然后結(jié)合標記物，例如帶有標記的第二T1R抗體?；蛘?，第二抗體可能沒有標記，但是它可以被標記了的第三抗體結(jié)合，該第三抗體特異性針對第二抗體所來源的物種的抗體。通常利用可檢測部分修飾第二抗體或第三抗體，例如生物素，其可與另一分子如鏈霉親和素特異性結(jié)合，以提供可檢測部分。
B.競爭性分析形式在競爭性分析中，通過測量由樣品中未知的T1R多肽從抗T1R抗體中取代(競爭去除)已知的外加(外源)T1R多肽的量，從而間接測量樣品中T1R多肽的量。在一個競爭性分析中，將已知量的T1R多肽加入樣品中，然后將樣品與可特異性結(jié)合T1R的抗體接觸。與抗體結(jié)合的外源T1R多肽的量與樣品中T1R多肽濃度成反比。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，抗體被固定化在固相基質(zhì)上。通過刻量T1R/抗體復(fù)合物中T1R多肽的量，或測量未形成復(fù)合物的剩余蛋白質(zhì)的量，可以確定與抗體結(jié)合的T1R多肽的量。通過提供標記的T1R分子，可以檢測T1R多肽的量。
另一優(yōu)選的競爭性分析是半抗原抑制分析。在此分析中，已知的T1R多肽被固定化在固相基質(zhì)上。將已知量的抗T1R抗體加入樣品中，然后將樣品與固定化的T1R接觸。與已知的固定化T1R多肽結(jié)合的抗T1R抗體的量與樣品中T1R多肽的量成反比。同樣，通過檢測抗體的固定化部分、或溶液中剩余的抗體部分，可以檢測固定化抗體的量?？贵w被標記時可以直接檢測，或隨后加入上述可特異性結(jié)合抗體的標記部分進行間接檢測。
C.交叉反應(yīng)性測定競爭結(jié)合形式的免疫分析也可用來測定交叉反應(yīng)性。例如，可以將一種至少部分由此處公開的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)固定化在固相基質(zhì)上。將蛋白質(zhì)(例如T1R多肽和同源物)加入分析體系中，與固定化抗原競爭性結(jié)合抗血清。加入的蛋白質(zhì)同固定化蛋白質(zhì)競爭性結(jié)合抗血清的能力，與由此處公開的核酸序列編碼的T1R多肽同自身競爭的能力相比較。使用標準算法計算上述蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性百分比。選擇并合并與加入的上述每種蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性小于10％的抗血清。通過加入特定蛋白質(zhì)、例如遠源(distantly related)同源物進行免疫吸收，任選從合并的抗血清中去除交叉反應(yīng)的抗體。另外，用于鑒定T1R家族成員的包含代表保守性基序的氨基酸序列的肽，可用于測定交叉反應(yīng)性。
經(jīng)免疫吸收并合并的抗血清然后可用于上述競爭結(jié)合免疫分析，將被認為可能是T1R家族成員的等位基因或多態(tài)性變體的第二蛋白質(zhì)與免疫原蛋白質(zhì)(即由此處公開的核酸序列編碼的T1R多肽)相比較。為進行比較，在一個寬的濃度范圍內(nèi)對兩種蛋白質(zhì)分別進行分析，確定抑制抗血清與固定化蛋白質(zhì)50％結(jié)合所需的每一種蛋白質(zhì)的量。如果抑制50％結(jié)合所需第二蛋白質(zhì)的量比由此處公開的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)抑制50％結(jié)合所需的量低10倍，那么就認為該第二蛋白質(zhì)可特異性結(jié)合針對T1R免疫原產(chǎn)生的多克隆抗體。
針對T1R保守性基序產(chǎn)生的抗體也可用于制備只與T1R家族GPCR特異性結(jié)合、而不與其它家族的GPCR結(jié)合的抗體。
通過使用其它T1R家族成員消減去除交叉反應(yīng)性抗體，可以制備特異性結(jié)合特定T1R家族成員的多克隆抗體。按類似方式可以制備種特異性多克隆抗體。例如，通過消減去除與直向進化同源物序列例如大鼠T1R1或小鼠T1R1交叉反應(yīng)的抗體，可以制備人T1R1特異性抗體。
D.其它分析形式Westem印跡(免疫印跡)分析可用于檢測和定量樣品中存在的T1R多肽。該技術(shù)一般包含利用凝膠電泳根據(jù)分子量分離樣品蛋白質(zhì)、將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜或衍生尼龍膜)、將樣品與可特異性結(jié)合T1R多肽的抗體溫育?？筎1R多肽抗體可特異性結(jié)合固相支持物上的T1R多肽。這些抗體可能被直接標記，或隨后使用可特異性結(jié)合抗T1R抗體的標記抗體(例如標記的綿羊抗小鼠抗體)進行檢測。
其它分析形式包括脂質(zhì)體免疫分析(LIA)，其利用設(shè)計成可結(jié)合特定分子(例如抗體)并釋放所包被的試劑或標志的脂質(zhì)體。然后按照標準技術(shù)檢測釋放出的試劑(參見Monroe等人，Amer.Clin.Prod.Rev.，534-41(1986))。
E.非特異結(jié)合的降低本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，免疫分析中經(jīng)常希望將非特異性結(jié)合降至最低。特別是當該分析涉及固定在固相基質(zhì)上的抗原或抗體時，希望將非特異性結(jié)合到基質(zhì)上的量降至最低。降低該非特異結(jié)合的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。一般而言，該技術(shù)涉及使用蛋白質(zhì)性質(zhì)的組分來包被基質(zhì)。特別而言，廣泛使用蛋白質(zhì)組分，例如牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、明膠，最優(yōu)選奶粉。
F.標記物分析中使用的特定標記物或可檢測基團不是本發(fā)明的關(guān)鍵因素，只要它不顯著影響分析中抗體的特異性結(jié)合即可?？蓹z測基團可以是具有可檢測的物理或化學(xué)性質(zhì)的任何物質(zhì)。這類可檢測標記在免疫分析領(lǐng)域發(fā)展完善，一般情況下，用于這些方法中的大多數(shù)標記物都可以應(yīng)用于本發(fā)明。因此，標記物是可用光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法檢測的任何組分。本發(fā)明有用的標記物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅(Texas red)、羅丹明等)、放射性標記物(如3H、125I、14C、35S)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、以及顯色標記物，例如膠體金、或彩色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙乙烯、乳膠等)。
按照本領(lǐng)域已知的方法，標記物可與分析的目的組分直接或間接偶聯(lián)。如上所述，根據(jù)所需靈敏度、與化合物綴合的難易度、穩(wěn)定性要求、現(xiàn)有儀器及處置規(guī)定，可以選擇使用各種標記物。
通常利用間接方法連上非放射性標記物。一般而言，配體分子(如生物素)共價結(jié)合到分子上。然后該配體結(jié)合另一分子(如鏈霉親和素)，該分子本身可被檢測或共價連接至信號系統(tǒng)，例如可檢測的酶、熒光化合物、或化學(xué)發(fā)光化合物。配基及其靶物質(zhì)可以與識別T1R多肽的抗體、或識別抗T1R的第二抗體以任意適當?shù)慕M合使用。
分子也可以直接綴合產(chǎn)生信號的化合物，例如與酶或熒光團綴合。作為標記物的目的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、脂酶和糖苷酶、或氧化酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺?；衔铩阈瓮??；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括螢光素(luciferin)和2，3-二氫吩嗪二酮類(2，3-dihydrophthalazinediones)，例如魯米諾(luminol)。可能使用的各種標記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)參見美國專利4,391,904的綜述。
檢測標記物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。因此，例如當標記物是放射標記物時，檢測方法包括閃爍計數(shù)器或感光膜放射自顯影。當標記物是熒光標記物時，可能通過合適波長的光激發(fā)熒光色素并檢測產(chǎn)生的熒光進行檢測。熒光可以通過感光膜、利用電子檢測器如電荷耦聯(lián)裝置(CCD)或光電倍增器等進行目視檢測。類似地，酶標記物可以通過提供酶的合適底物并檢測反應(yīng)產(chǎn)物來進行檢測。最后，簡單的顯色標記物可以通過觀察與標記物相關(guān)的顏色進行簡單檢測。因此，在各種試紙條(dipstick)分析中，綴合的金通常顯粉紅色，而各種綴合的小珠顯示該小珠的顏色。
某些分析形式不需要使用標記組分。例如，凝集試驗可用于檢測靶抗體的存在。在此情況下，抗原包被顆?？杀话锌贵w的樣品凝集。在該形式中，各組分均無需標記，通過肉眼簡單觀測就能檢測靶抗體的存在。
調(diào)節(jié)劑的檢測確定待測化合物是否可在體外和體內(nèi)特異性結(jié)合本發(fā)明的T1R受體的組合物和方法如下所述?？梢员O(jiān)測細胞生理學(xué)的許多方面，以評價配體結(jié)合本發(fā)明T1R多肽的效應(yīng)。可以對表達化學(xué)感受受體的完整細胞、通透化的細胞、或利用標準方法產(chǎn)生的膜成分或體外從頭合成的蛋白質(zhì)進行這些分析。
在體內(nèi)，味覺受體結(jié)合促味劑并引發(fā)化學(xué)刺激物轉(zhuǎn)導(dǎo)為電信號。活化或抑制的G蛋白依次改變目標酶、通道、或其它效應(yīng)蛋白質(zhì)的性質(zhì)。一些例子有，例如通過視覺系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)素(transducin)而活化cGMP磷酸二酯酶、通過刺激物性G蛋白活化腺苷酸環(huán)化酶、通過Gq和其它同類G蛋白活化磷脂酶C、以及通過Gi和其它G蛋白調(diào)節(jié)不同的通道調(diào)節(jié)。也可檢測下游結(jié)果，例如由磷脂酶C產(chǎn)生的二?；视秃虸P3，繼而由IP3引發(fā)鈣的動員。
該分析中的T1R蛋白質(zhì)或多肽優(yōu)選具有選自實施例1公開的T1R多肽序列的多肽、或其片段或保守性修飾變體。可選地，該片段和變體可以是能夠結(jié)合抗T1R抗體的抗原性片段和變體?？蛇x地，該片段和變體可以結(jié)合甜味劑或鮮味促味劑、或由其活化。
或者，該分析中的T1R蛋白質(zhì)或多肽可以來源于真核宿主細胞，可以包括與實施例1公開的T1R多肽、或其片段或保守性修飾變體具有氨基酸序列同一性的氨基酸亞序列。一般而言，該氨基酸序列同一性為至少35-50％，或可選75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％?？蛇x地，該分析中的T1R蛋白或多肽可以包含T1R蛋白的結(jié)構(gòu)域，例如細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域等。此外如上所述，T1R蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域可以共價連接異源蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生可用于此處所述分析的嵌合蛋白質(zhì)。
使用上述T1R蛋白質(zhì)或多肽，不論是重組的還是天然產(chǎn)生的，來測試T1R受體活性的調(diào)節(jié)劑。可以分離、在細胞中共表達、在來源于細胞的膜上共表達、在組織或動物中共表達重組或天然產(chǎn)生的T1R蛋白或多肽。例如，舌切片、從舌上分離的細胞、轉(zhuǎn)化細胞或膜都可以使用?？梢允褂么颂幩鲶w外或體內(nèi)分析之一來測試調(diào)節(jié)作用。
例如，如下文實施例實驗所公開，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些5’核苷酸、例如5，IMP或5’GMP，可增強L-谷氨酸活化鮮味覺受體的活性、或阻斷鮮味覺刺激物、例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸對鮮味覺受體的活化。
1.體外結(jié)合分析使用本發(fā)明的T1R多肽，利用可溶性或固相反應(yīng)，可以體外檢測味覺傳導(dǎo)。在特定實施方案中，可以使用T1 R配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以體外可溶性或固相反應(yīng)分析配體結(jié)合。
例如，預(yù)測T1R的N末端結(jié)構(gòu)域參與配體結(jié)合。具體而言，T1R屬于GPCR亞家族，其特征在于具有大的、約600個氨基酸的細胞外N末端片段。這些N末端片段據(jù)認為形成配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因而可用于鑒定T1R激動劑和拮抗劑的生物化學(xué)分析。配體結(jié)合域可能由細胞外結(jié)構(gòu)域的另外部分形成，例如跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞外環(huán)。
已經(jīng)使用了利用與T1R相關(guān)的其它GPCR、例如代謝型谷氨酸受體的體外結(jié)合分析(例如參見，Han和Hampson，J.Biol.Chem.27410008-10013(1999))。這些分析可能涉及替換放射性或熒光標記的配體，測量內(nèi)在熒光的變化或蛋白水解敏感性的變化等。
可以在溶液、雙層膜(可選附著于固相)、脂單層、或囊泡中檢測與本發(fā)明T1R多肽異源多聚復(fù)合物結(jié)合的配體?？梢允褂美绻庾V特征變化(例如熒光、吸收、折射率)、流體力學(xué)(例如形狀)、層析或溶解性測試調(diào)節(jié)劑的結(jié)合。
在本發(fā)明另一實施方案中，可以使用GTPγ35S分析。如上所述，在GPCR活化的情況下，刺激G蛋白復(fù)合物的Gα亞基，將結(jié)合的GDP交換為GTP。在生物化學(xué)分析中，測定所加入的放射性標記GTPγ35S在假定的配體存在下與G蛋白的結(jié)合，可以測定配體介導(dǎo)的對G蛋白交換活性的刺激。一般而言，包含目的化學(xué)感受受體的膜與G蛋白復(fù)合物相混合。在分析中加入潛在抑制劑和/或活化劑以及GTPγ35S，測量與G蛋白結(jié)合的GTPγ35S。通過液體閃爍計數(shù)或本領(lǐng)域已知的其它方法、包括閃爍親近測定法(SPA)，可以測量結(jié)合作用。在其它分析形式中，可以使用熒光標記的GTPγS。
2.熒光偏振分析在另一實施方案中，可以使用基于熒光偏振(“FP”)的分析檢測并監(jiān)測配體結(jié)合。熒光偏振是測量平衡結(jié)合、核酸雜交和酶活性的實驗室通用技術(shù)。熒光偏振分析是均一性的，因為它不需要分離步驟，例如離心、過濾、層析、沉淀或電泳。這些分析直接在溶液中實時進行，不需要固定化相。偏振值可重復(fù)測量，在加入試劑后測量偏振非?？焖?，所以不會破壞樣品。一般而言，本技術(shù)可用于測量熒光團(fluorophore)低至皮摩爾(picomolar)到微摩爾(micromolar)水平的偏振值。本節(jié)描述了怎樣簡單定量地使用熒光偏振測量配體與本發(fā)明T1R多肽的結(jié)合。
熒光標記分子被平面偏振光激發(fā)時，發(fā)出具有一定偏振程度的光，其偏振程度與分子旋轉(zhuǎn)成反比。大的熒光標記分子在激發(fā)態(tài)(對于熒光素而言為4納秒)保持相對靜止，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振保持相對恒定。小的熒光標記分子在激發(fā)態(tài)快速旋轉(zhuǎn)，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振顯著變化。因此，小分子偏振值低，大分子偏振值高。例如，單鏈熒光素標記的寡核苷酸的偏振值相對較低，但當它與互補鏈雜交時，就具有較高的偏振值。當使用FP來檢測和監(jiān)測可能活化或抑制本發(fā)明化學(xué)感受受體的促味劑結(jié)合時，可以使用熒光標記的促味劑或自發(fā)熒光促味劑。
熒光偏振(P)定義為 其中H是與激發(fā)光平面平行的發(fā)射光強度，Int⊥是與激發(fā)光平面垂直的發(fā)射光強度。P為光強度比值，是一個無量綱的數(shù)字。例如，Beacon和Beacon 2000TM系統(tǒng)可以與這些分析聯(lián)合使用。這類系統(tǒng)一般用毫偏振單位表示偏振值(1偏振單位＝1000mP單位)。
Perrin方程式描述了分子旋轉(zhuǎn)和大小之間的關(guān)系，讀者可以參考Jolley，M.E.(1991)在Journal of Analytical Toxicology，236-240頁，其中給出了該方程式的詳細解釋。概要地，Perrin方程式認定偏振與旋轉(zhuǎn)弛豫(rotational relaxation)時間、即分子旋轉(zhuǎn)約68.5°角所需時間直接成比例。旋轉(zhuǎn)弛豫時間按下列方程式與粘度(η)、絕對溫度(T)、分子體積(V)、和氣體常數(shù)(R)相關(guān) 旋轉(zhuǎn)弛豫時間對于小分子(如熒光素)很小(≈1納秒)，對于大分子(如免疫球蛋白)很大(≈100納秒)。如果粘度和溫度保持恒定，旋轉(zhuǎn)弛豫時間，也即偏振，與分子大小直接相關(guān)。分子體積的變化可能是由于熒光標記分子與其它分子的相互作用、解離、聚合、降解、雜交或構(gòu)象變化所致。例如，熒光偏振已經(jīng)用于測量蛋白酶、DNA酶和RNA酶酶促裂解大的熒光素標記的聚合物。還用于測量蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用、抗體/抗原結(jié)合以及DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合平衡。
A.固相和可溶性高通量分析在另一實施方案中，本發(fā)明提供了使用異源寡聚T1R多肽復(fù)合物、或共表達T1R多肽的細胞或組織進行的可溶性分析。優(yōu)選地，該細胞包含穩(wěn)定共表達功能性T1R1/T1R3(鮮)味覺受體或T1R2/T1R3(甜)味覺受體的細胞系。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了高通量形式的基于固相的體外分析，其中將T1R多肽、或表達T1R多肽的細胞或組織附著于固相基質(zhì)、或味覺刺激化合物，并與T1R受體相接觸，使用合適的標簽、或針對該T1R受體產(chǎn)生的抗體檢測結(jié)合作用。
在本發(fā)明的高通量分析中，一天之內(nèi)可能篩選多達數(shù)千種不同的調(diào)節(jié)劑或配體。特別而言，可以用微孔板的每個孔來進行針對所選的潛在調(diào)節(jié)劑的單獨分析，或者如果要觀察濃度或溫育時間效應(yīng)，每5-10個孔可以測試一種調(diào)節(jié)劑。因此，一塊標準微孔板可以分析約100種(例如96種)調(diào)節(jié)劑。如果使用1536孔板，那么一塊板可以輕松分析約1000-1500種不同的化合物。也可能在每個平板孔中分析多種化合物。每天可能分析數(shù)塊不同的平板；使用本發(fā)明集成的系統(tǒng)可能分析篩選多達約6,000-20,000種不同的化合物。最近發(fā)展了試劑操作的微流方法(microfluidic approaches)。
目的分子可以通過共價或非共價鍵(例如通過標簽)直接或間接與固態(tài)組分結(jié)合。標簽可以是多種組分任意一種。一般而言，將可結(jié)合標簽的分子(標簽結(jié)合物)固定在固相支持物上，通過標簽與標簽結(jié)合物的相互作用，將加標記的目的分子(例如味覺傳導(dǎo)目的分子)附著于固相支持物。
根據(jù)文獻詳述的已知的分子相互作用，可以使用多種標簽和標簽結(jié)合物。例如，如果標簽具有天然結(jié)合物，例如生物素、蛋白A、或蛋白G，它就可以與合適的標簽結(jié)合物(親和素、鏈霉親和素、中性親和素、免疫球蛋白Fc區(qū)等)結(jié)合使用。也可廣泛獲得針對具有天然結(jié)合物的分子(例如生物素)的抗體，這也是合適的標簽結(jié)合物(參見，SIGMA Immunochemicals 1998 Catalogue Sigma，St.Louis MO)。
類似地，任何半抗原或抗原性化合物都可與適當?shù)目贵w組合，以形成標簽/標簽結(jié)合物對?？梢陨唐坊@得數(shù)千種抗體，文獻描述了許多另外的抗體。例如，在一種常見的形式中，標簽是第一抗體，標而簽結(jié)合物是識別第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原相互作用外，受體-配體相互作用也適合作為標簽和標簽結(jié)合物對。例如，細胞膜受體的激動劑和拮抗劑(例如細胞受體-配體相互作用，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、c-kit、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整聯(lián)蛋白家族、選擇蛋白(selectin)家族等，例如參見Pogott&Power，The AdhesionMolecule Facts Book I(1993))。類似地，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如阿片制劑、類固醇等)、細胞內(nèi)受體(例如，其介導(dǎo)各種小配體的效應(yīng)，包括類固醇、甲狀腺激素、類維生素A(retinoids)和維生素D；肽)、藥物、凝集素、糖、核酸(線性和環(huán)狀聚合物構(gòu)型)、寡糖、蛋白質(zhì)、磷脂和抗體，都可以與各種細胞受體作用。
合成聚合物，例如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫化物、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯(polyacetates)，也可以形成合適的標簽或標簽結(jié)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員在瀏覽本公開內(nèi)容時顯而易見，許多其它的標簽/標簽結(jié)合物對也可用于此處所述分析系統(tǒng)。
常用接頭，例如肽、聚醚等，也可以用作標簽，包括多肽序列，例如約5-200個氨基酸的聚甘氨酸序列。這類柔性接頭為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。例如，聚(乙二醇)接頭可以得自Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama。這些接頭可選地具有酰胺鍵、巰鍵或異源功能鍵。
可以使用現(xiàn)有的各種方法將標簽結(jié)合物固定于固相基質(zhì)。固相基質(zhì)通常全部或部分暴露于化學(xué)試劑，將可與標簽結(jié)合物的一部分發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)基團固定于表面，從而進行衍生化或功能化。例如，適合連接于長鏈部分上的基團包括胺、羥基、硫醇和羧基基團。氨基烷基硅烷(aminoalkylsilanes)和羥烷基硅烷(hydroxyalkylsilanes)可用于多種表面的功能化，例如玻璃表面。文獻詳述了構(gòu)建此類固相生物聚合物陣列的方法。例如參見Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等人，J.Immun.Meth.，102259-274(1987)(描述了在針上的固相組分合成)；Frank&Doring，Tetrahedron，446031-6040(1988)(描述了在纖維素盤上合成各種肽序列)；Fodor等人，Science，251767-777(1991)；Sheldon等人，Clinical Chemistry，39(4)718-719(1993)；以及Kozal等人，Nature Medicine，2(7)753-759(1996)(均描述了固定于固相基質(zhì)上的生物聚合物陣列)。將標簽結(jié)合物固定于基質(zhì)上的非化學(xué)方法包括其它常用方法，例如加熱、UV輻射交聯(lián)等。
3.基于細胞的分析在優(yōu)選的處理實施方案中，將T1R蛋白質(zhì)或多肽組名在真核細胞中瞬時或穩(wěn)定共表達為未修飾形式、或嵌合體、變體或截短的受體，其帶有、或優(yōu)選沒有可促進其成熟并定向通過分泌途徑的異源伴侶序列。這類T1R多肽可在任何真核細胞中表達，例如HEK-293細胞。優(yōu)選地，該細胞包含功能性G蛋白如Gα15、或前述嵌合G蛋白、或能夠偶聯(lián)嵌合受體至細胞內(nèi)信號途徑或信號蛋白如磷脂酶C的另外蛋白質(zhì)。還優(yōu)選產(chǎn)生可穩(wěn)定共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的細胞，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(如實驗實施例所示)該細胞顯示增強的對味覺刺激物的響應(yīng)(相比瞬時表達相同T1R組合的細胞)。可以使用任何標準方法檢測這些細胞中T1R受體的活化，例如通過檢測細胞中Fluo-4依賴性熒光來檢測細胞內(nèi)鈣的變化。這類分析是本申請所示實驗發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)。
活化的GPCR受體通常是使受體C末端尾部(也可能其它位點)磷酸化的激酶的底物。因此，活化劑能促進32P從放射性標記的ATP轉(zhuǎn)移到受體，可利用閃爍計數(shù)器分析。C末端尾部的磷酸化能促進抑制蛋白(arrestin)樣蛋白質(zhì)的結(jié)合，并干擾G蛋白的結(jié)合。GPCR信號傳導(dǎo)及信號傳導(dǎo)分析方法的綜述參見，例如Methods in Enzymology，卷237和238(1994)以及卷96(1983)；Bourne等人，Nature，10349117-27(1991)；Bourne等人，Nature，348125-32(1990)；Pitcher等人，Annu.Rev.Biochem.，67653-92(1998)。
通過將經(jīng)推定的T1R調(diào)節(jié)劑處理的T1R多肽的響應(yīng)與未處理的對照樣品、或包含已知的”陽性”對照樣品的響應(yīng)作比較，從而分析T1R調(diào)節(jié)作用。這類推定的T1R調(diào)節(jié)劑可包括抑制或活化T1R多肽活性的分子。在一個實施方案中，將對照樣品(未經(jīng)活化劑或抑制劑處理)的相對T1R活性值定為100。如果相對于對照的T1R活性值為約90％、可選地50％、可選地25-0％，則獲得T1R多肽的抑制。如果相對于對照的T1R活性值為110％、可選地150％、200-500％或1000-2000％，則獲得T1R多肽的活化。
通過測定表達T1R多肽的細胞或膜的離子極化(即電勢)變化，可以評價離子通量變化。測定細胞極化變化的一個方法是利用電壓-鉗(voltage-clamp)和補丁-鉗(patch-clamp)技術(shù)測量電流變化(從而檢測極化的變化)(例如參見，“細胞附著”模式、“內(nèi)-外”模式、和“全細胞”模式，如Ackerman等人，New Engl. J Med.，3361575-1595(1997))。利用標準方法可以很方便地測量全細胞電流。其它已知的分析包括放射性標記離子通量分析以及使用電壓敏感性染料的熒光分析(例如參見，Vestergarrd-Bogind等人，J.Membrane Biol.，8867-75(1988)；Gonzales&Tsien，Chem.Biol.，4269-277(1997)；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.，25185-193(1991)；Holevinsky等人，J.Membrane Biol.，13759-70(1994))。
通過檢測上述任何一個參數(shù)，可以測定待測化合物對多肽功能的效應(yīng)。可以使用影響GPCR活性的任何適當?shù)纳韺W(xué)變化來評價待測化合物對本發(fā)明多肽的影響。當使用完整細胞或動物確定功能結(jié)果時，還可以測定各種效應(yīng)，例如遞質(zhì)釋放、激素釋放、已知或未鑒定遺傳標志的轉(zhuǎn)錄變化(例如Northern印跡)、細胞代謝變化(例如細胞生長或pH變化)以及細胞內(nèi)第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的變化。
優(yōu)選的GPCR分析包括帶有離子或電壓敏感性染料以報告受體活性的細胞。測定這類受體活性的分析也可使用其它G蛋白偶聯(lián)受體的已知激動劑和拮抗劑作為對照，來評價待測化合物的活性。在鑒定調(diào)節(jié)性化合物(例如激動劑、拮抗劑)的分析中，分別使用離子敏感性或膜電位熒光指示劑來監(jiān)測胞質(zhì)中離子水平或膜電位的變化?？赡苁褂玫碾x子敏感性指示劑和電壓探針公開見于Molecular Probes 1997Catalog?；鞐?promiscuous)G蛋白如Gα15和Gα16可用于選擇分析G蛋白偶聯(lián)受體(Wilkie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，8810049-10053(1991))。
受體活化啟動隨后的細胞內(nèi)事件，例如第二信使增加。某些G蛋白偶聯(lián)受體的活化通過磷脂酶C介導(dǎo)的磷脂酰肌醇水解作用刺激形成三磷酸肌醇(IP3)(Berridge&Irvine，Nature，312315-21(1984))。IP3繼而刺激細胞內(nèi)鈣離子庫存的釋放。因此，胞質(zhì)鈣離子水平的變化、或第二信使如IP3水平的變化可用于評價G蛋白偶聯(lián)受體的功能。由于細胞內(nèi)庫存鈣的釋放以及細胞外鈣通過質(zhì)膜離子通道進入的作用，表達該類G蛋白偶聯(lián)受體的細胞可能顯示胞質(zhì)中鈣離子水平提高。
在優(yōu)選實施方案中，通過在異源細胞中穩(wěn)定或瞬時、優(yōu)選穩(wěn)定共表達T1R基因以及可以將受體連接到磷脂酶C信號傳導(dǎo)途徑的混棲G蛋白，可以測定T1R多肽的活性(參見Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995))。在優(yōu)選實施方案中，該細胞系是HEK-293(其通常不表達T1R基因)，該混棲G蛋白是Gα15(Offermanns&Simon，同上)。細胞內(nèi)Ca2+水平可響應(yīng)由給予可結(jié)合T1R多肽的分子而調(diào)節(jié)的T1R信號傳導(dǎo)途徑而變化，通過測量細胞內(nèi)Ca2+水平的變化可分析味覺傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)?？蛇x地使用熒光Ca2+指示劑染料和熒光成像術(shù)測定Ca2+水平。
在另一實施方案中，可以根據(jù)美國專利5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解作用，在此引用以供參考。簡而言之，該分析包括用3H-肌醇標記細胞48小時或更長時間。標記的細胞利用待測化合物處理1小時。將處理的細胞裂解并用氯仿-甲醇-水抽提，其后通過離子交換層析分離磷酸肌醇，通過閃爍計數(shù)定量。計算存在激動劑時的cpm和存在緩沖液對照時的cpm的比率，確定刺激倍數(shù)。同樣，計算存在拮抗劑時的cpm和存在緩沖液對照(可能含有或不含有激動劑)時的cpm的比率，確定抑制倍數(shù)。
其它受體分析可包括測定細胞內(nèi)環(huán)核苷酸、例如cAMP或cGMP的水平。在受體活化導(dǎo)致環(huán)核苷酸水平降低的情況下，可能優(yōu)選在分析中將受體活化化合物加入細胞之前，將細胞暴露于可增加細胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平的試劑如福斯高林(Forskolin)中。在一個實施方案中，可以使用免疫分析測定細胞內(nèi)cAMP或cGMP的變化。Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995)所述方法可以用于測定cAMP水平。同樣，F(xiàn)elley-Bosco等人，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11159-164(1994)所述方法可以用于測定cGMP水平。此外，美國專利4,115,538描述了測定cAMP和/或cGMP的分析試劑盒，在此引用以供參考。
在另一實施方案中，可以測量轉(zhuǎn)錄水平，以評價待測化合物對信號傳導(dǎo)的效應(yīng)。將包含目的T1R多肽的宿主細胞與待測化合物接觸足夠長的時間，以實現(xiàn)任何相互作用，然后測量基因表達水平?？梢詰{經(jīng)驗確定實現(xiàn)這些相互作用的時間量，例如執(zhí)行一個時間進程并測量轉(zhuǎn)錄水平作為時間的函數(shù)。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當方法測量轉(zhuǎn)錄量。例如，可以使用Northern印跡檢測目的蛋白的mRNA表達，或使用免疫分析鑒定其多肽產(chǎn)物?；蛘撸梢允褂美脠蟾婊虻幕谵D(zhuǎn)錄的分析，如美國專利5,436,128所述，在此引用以供參考。報告基因可以是，例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶和堿性磷酸酶。此外，通過附著于第二報告分子如綠色熒光蛋白，可以將目的蛋白用作間接報告分子(例如參見，Mistili&Spector，Nature Biotechnology，15961-964(1997))。
然后將轉(zhuǎn)錄量與相同細胞在缺少待測化合物時的轉(zhuǎn)錄量相比較，或者與基本相同細胞在缺少目的T1R多肽時的轉(zhuǎn)錄量相比較。基本相同的細胞可以來源于制備重組細胞的相同細胞，但未引入異源DNA進行修飾。轉(zhuǎn)錄量的任何差異意味著待測化合物在某種意義上改變了目的T1R多肽的活性。
4.表達化學(xué)感受受體的非人類轉(zhuǎn)基因動物表達本發(fā)明T1R味覺受體序列組合的非人類動物也可用于受體分析。通過將穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染編碼化學(xué)感受受體或其配體結(jié)合區(qū)核酸的非人類動物與待測化合物接觸，并確定該動物是否通過特異性結(jié)合受體多肽復(fù)合物而與待測化合物反應(yīng)，從而可以使用這類表達確定待測化合物是否在體內(nèi)特異性結(jié)合哺乳動物味覺跨膜受體復(fù)合物，利用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染或感染的動物可用于鑒定和表征可結(jié)合特定或成組受體的味覺刺激物的分析中。這類經(jīng)載體感染、可表達人類味覺受體序列的動物，可用于體內(nèi)篩選味覺刺激物及其對例如細胞生理學(xué)(例如對味覺神經(jīng)元)、CNS或行為的作用。另外，表達T1R或其組合的穩(wěn)定細胞系可用作核酸供體，以產(chǎn)生穩(wěn)定表達特定T1R或其組合的轉(zhuǎn)基因克隆動物。使用核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生表達目的外源DNA的克隆動物的方法，是授予University of Massachusetts(授權(quán)給AdvancedCell Technology，Inc.)以及Roslin Institute(授權(quán)給Geron Corp.)的幾個授權(quán)的美國專利的主題。
以單獨或文庫形式感染/表達核酸和載體的方法為本領(lǐng)域所公知。可以利用多種方法測量各種單個細胞、器官、或整體動物的參數(shù)。通過利用感染劑、例如腺病毒表達載體運送，可在例如動物味覺組織中共表達本發(fā)明的T1R序列。
內(nèi)源性味覺受體基因可保持功能性，并仍然表現(xiàn)野生型(天然)活性。在其它情況下，如果希望所有的味覺受體活性均通過引入外源雜合受體產(chǎn)生，優(yōu)選使用敲除系。構(gòu)建非人類轉(zhuǎn)基因動物、特別是轉(zhuǎn)基因小鼠，并選擇和制備產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細胞的重組構(gòu)建體的方法為本領(lǐng)域所公知。
構(gòu)建“敲除”細胞和動物根據(jù)的前提是，通過將用于干擾待抑制基因某部分DNA序列的新DNA序列引入基因組中，可以降低或完全消除哺乳動物細胞中特定基因的表達水平。同樣，“基因誘捕插入”(gene trap insertion)可用于破壞宿主基因，小鼠胚胎干(ES)細胞可用于產(chǎn)生敲除的轉(zhuǎn)基因動物(例如參見，Holzschu，TransgenicRes.697-106(1997))。通常利用互補核酸序列間的同源重組進行外源序列的插入。外源序列是待修飾靶基因的某一部分，例如外顯子、內(nèi)含子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，或可影響靶基因表達水平的任何基因組序列；或其組合。多能胚胎干細胞通過同源重組進行基因?qū)?，可以精確修飾目的基因組序列。任何技術(shù)都可用于產(chǎn)生、篩選、繁殖敲除動物，例如參見Bijvoet，Hum.Mol.Genet.753-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology19161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6321-328(1997)；美國專利5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。
本發(fā)明的核酸也可用作產(chǎn)生“敲除”人細胞及其后代的試劑。類似地，本發(fā)明的核酸也可用作產(chǎn)生小鼠“敲入(knock-ins)”的試劑。人或大鼠T1R基因序列可以替換小鼠基因組中的直向進化同源T1R。利用這種方式可以產(chǎn)生表達人或大鼠T1R的小鼠。該小鼠然后可用于分析人或大鼠T1R的功能，并鑒定這類T1R的配體。
a.調(diào)節(jié)子作為T1R家族成員調(diào)節(jié)劑進行測試的化合物可以是任何小的化學(xué)化合物、或生物學(xué)實體，例如蛋白質(zhì)、核酸或脂類。其實例包括5’IMP和5’GMP?；旧先魏位瘜W(xué)化合物都可以用作本發(fā)明分析中的潛在調(diào)節(jié)劑或配體，盡管最常測試可溶于含水溶液中的化合物。這些分析可以設(shè)計成通過自動化分析步驟以及提供來自任何方便來源的化合物，進行大的化學(xué)文庫的篩選；這些分析通常平行進行(例如，在機器人分析中，于微量滴定板上以微量滴定方式進行)。應(yīng)當理解，可以利用多種化學(xué)反應(yīng)之一(例如Senomyx proprietary chemistries)合成化學(xué)文庫。另外還有很多化學(xué)化合物供應(yīng)商，包括Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)等。
在一個優(yōu)選實施方案中，高通量篩選方法包括提供包含大量潛在味覺影響性化合物(潛在調(diào)節(jié)劑或配體化合物)的組合化學(xué)品或肽文庫。然后在上述一種或多種分析中篩選這類“組合化學(xué)品文庫”或“配體文庫”，以鑒定顯示所需特征性活性的文庫成員(特別是化學(xué)種類或亞類)。這樣鑒定的化合物可作為常規(guī)的“前導(dǎo)化合物(leadcompounds)”，或其本身可用作可能的或?qū)嶋H的味覺調(diào)節(jié)劑。
優(yōu)選針對穩(wěn)定表達T1R或T1R組合、即T1R1/T1R3或T1R2/T1R3并優(yōu)選合適的G蛋白、例如Gα15的細胞或細胞系，篩選這類文庫。如下文實施例所示，這類穩(wěn)定的細胞系對味覺刺激物、例如鮮味覺或甜味覺刺激物顯示非常顯著的響應(yīng)。然而，瞬時表達一種或多種T1R的細胞和細胞系也可用于這類分析中。
組合化學(xué)品文庫是由化學(xué)合成或生物合成產(chǎn)生的不同化學(xué)化合物的集合，經(jīng)大量化學(xué)“構(gòu)造部件(building blocks)”例如試劑組合而成。例如，線性組合化學(xué)品文庫、例如多肽文庫是由一系列化學(xué)構(gòu)造部件(氨基酸)按各種可能方式以指定化合物長度(即多肽化合物中的氨基酸的數(shù)目)組合而成。通過這種化學(xué)構(gòu)造部件的組合混合，可以合成出成千上百萬種化學(xué)化合物。
組合化學(xué)品文庫的制備和篩選為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。這類組合化學(xué)品文庫包括、但并不局限于肽文庫(例如參見，美國專利5,010,175，F(xiàn)urka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493(1991)以及Houghton等人，Nature，35484-88(1991))。也可以使用產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的其它化學(xué)物質(zhì)。這些化學(xué)物質(zhì)包括、但并不局限于類肽(peptoid)(例如PCT公開WO 91/19735)、編碼的肽(例如PCT公開WO 93/20242)、隨機生物寡聚物(PCT公開WO 92/00091)、苯并二氮雜(例如美國專利5,288,514)、異聚物(diversomers)例如乙內(nèi)酰脲和苯并二氮雜和二肽(Hubbs等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，906906-6913(1993))、聯(lián)乙烯(vinylogous)多肽(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽性肽模擬物(nonpeptidal petidomimetics)(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1992))、類似的有機合成小分子化合物文庫(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.，1162661(1994))、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等人，Science，2611303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.，59658(1994))、核酸文庫(Ausubel，Berger和Sambrook，均同上)、肽核酸文庫(美國專利5,539,083)、抗體文庫(Vaughn等人，NatureBiotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖類文庫(Liang等人，Science，2741520-1522(1996)和美國專利5,593,853)，有機小分子文庫(苯并二氮雜，Baum，C&EN，Jan 18，33頁(1993)；噻唑烷酮(thiazolidinones)和間噻嗪烷酮(metathiazanones)，美國專利5,549,974；pynrolidines，美國專利5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國專利5,506,337；苯并二氮雜，5,288,514等)。
制備組合文庫的裝置已可商品化獲得(例如參見，357 MPS，390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville KY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，9050Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，眾多組合文庫本身也可商品化獲得(例如參見，ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；Martek Biosciences；Columbia，MD等)。
在本發(fā)明的一個方面，T1R調(diào)節(jié)劑可用于任何食品、糖果、藥物組合物或其成分，從而按所需方式調(diào)節(jié)產(chǎn)品、組合物或成分的味道。例如，可以加入可增強甜味覺感受的T1R調(diào)節(jié)劑，使產(chǎn)品或組合物變甜，而在食品中加入可增強鮮味覺感受的T1R調(diào)節(jié)劑，可增加鮮美味道。另外，可以使用T1R拮抗劑阻斷甜味和/或鮮味覺。
b.試劑盒T1R基因及其同源體是鑒定化學(xué)感受受體細胞、法醫(yī)學(xué)和親子鑒定、以及檢驗味覺傳導(dǎo)的有用工具。可與T1R核酸特異性雜交的T1R家族成員特異性試劑，例如T1R探針和引物，以及可特異性結(jié)合T1R多肽的T1R特異性試劑，例如T1R抗體，可以用于檢驗味覺細胞表達和味覺傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。
確定樣品中存在T1R家族成員DNA和RNA的核酸分析包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的眾多技術(shù)，例如Southern分析、Northern分析、點印跡、RNA酶保護、S1分析、擴增技術(shù)例如PCR、以及原位雜交。例如在原位雜交中，將靶核酸從其細胞內(nèi)環(huán)境中釋放出來，以便能夠在細胞內(nèi)進行雜交，同時保持細胞形態(tài)，供隨后的解釋和分析。下列文章提供了原位雜交技術(shù)的概況Singer等人，Biotechniques，4230-250(1986)；Haase等人，Methods in Virology，卷VII189-226頁(1984)；以及Nucleic Acid HybridizationA PracticalApproach(Names等人，eds.1987)。另外，可以利用上述多種免疫分析技術(shù)檢測T1R多肽。測試樣品通常同時與陽性對照(例如，表達重組T1R多肽的樣品)和陰性對照作比較。
本發(fā)明還提供了用于篩選T1R家族成員調(diào)節(jié)劑的試劑盒。該試劑盒可以從易于獲得的材料和試劑中制備。例如，該試劑盒可以包含下列材料中的任何一種或多種T1R核酸或蛋白質(zhì)、反應(yīng)管以及測試T1R活性的說明書?？蛇x地，該試劑盒包含生物學(xué)活性的T1R受體、或可以穩(wěn)定或瞬時表達含生物學(xué)活性T1R的味覺受體的細胞系。按照本發(fā)明可以制備多種試劑盒及組分，這取決于該試劑盒的特定用戶以及用戶的特定需要。
實施例在上文詳述本發(fā)明的同時，提供以下實施例闡述其優(yōu)選實施方案。這些實施例意在說明、而非限制本發(fā)明的范圍。
在此處所示蛋白質(zhì)序列中，單字母編碼X或Xaa是指二十種常見氨基酸殘基中的任何一種。在此處所示DNA序列中，單字母編碼N或n是指四種常見核苷酸堿基A、T、C或G中的任何一種。
實施例1制備無內(nèi)含子的hT1R表達構(gòu)建體聯(lián)用基于cDNA和基因組DNA的方法，克隆無內(nèi)含子的hT1R表達構(gòu)建體。為了產(chǎn)生全長hT1R1表達構(gòu)建體，將在克隆的hT1R1間隔中(登錄號#AL159177)鑒定的兩個5’編碼的外顯子通過PCR-重疊進行組合，然后連接到5’-截短的睪丸cDNA克隆中。從部分測序的hT1R2基因組間隔中產(chǎn)生hT1R2表達構(gòu)建體。使用來源于大鼠對應(yīng)編碼序列的探針篩選所克隆的基因組間隔的鳥槍文庫(shotgun libraries)，鑒定缺少的兩個hT1R2 5’外顯子。然后通過PCR-重疊組合編碼外顯子，產(chǎn)生全長的表達構(gòu)建體。通過PCR-重疊從測序的hT1R3基因組間隔中(登錄號#AL139287)產(chǎn)生hT1R3表達構(gòu)建體。使用通過基于hT1R3的簡并PCR產(chǎn)生的rT1R3外顯子片段，從大鼠味覺組織來源的cDNA文庫中分離大鼠T1R3。從Dr.Charles Zuker(University ofCalifornia，San Diego)獲得部分hT1R1 cDNA、rT1R2 cDNA以及部分hT1R2序列。
上述鑒定的T1R克隆序列及其它全長和部分T1R序列的核酸和氨基酸序列如下所示SEQ ID NO4氨基酸序列rT1R3MPGLAILGLSLAAFLELGMGSSLCLSQQFKAQGDYILGGLFPLGTTEEATLNQRTQPNGILCTRFSPLGLFLAMAMKMAVEEINNGSALLPGLRLGYDLFDTCSEPVVTMKPSLMFMAKVGSQSIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELALITGKFFSFFLMPQVSYSASMDRLSDRETFPSFFRTVPSDRVQLQAVVTLLQNFSWNWVAALGSDDDYGREGLSIFSGLANSRGICIAHEGLVPQHDTSGQQLGKVVDVLRQVNQSKVQVVVLFASARAVYSLFSYSILHDLSPKVWVASESWLTSDLVMTLPNIARVGTVLGFLQRGALLPEFSHYVETRLALAADPTFCASLKAELDLEERVMGPRCSQCDYIMLQNLSSGLMQNLSAGQLHHQIFATYAAVYSVAQALHNTLQCNVSHCHTSEPVQPWQLLENMYNMSFRARDLTLQFDAKGSVDMEYDLKMWVWQSPTPVLHTVGTFNGTLQLQHSKMYWPGNQVPVSQCSRQCKDGQVRRVKGFHSCCYDCVDCKAGSYRKHPDDFTCTPCGKDQWSPEKSTTCLPRRPKFLAWGEPAVLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPRSASCLAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLVVLLATLVEAALCAWYLMAFPPEVVTDWQVLPTEVLEHCRMRSWVSLGLVHITNAVLAFLCFLGTFLVQSQPGRYNRARGLTFAMLAYFIIWVSFVPLLANVQVAYQPAVQMGAILFCALGILATFHLPKCYVLLWLPELNTQEFFLGRSPKEASDGNSGSSEATRGHSESEQ ID NO5氨基酸序列hT1R1MLLCTARLVGLQLLISCCWAFACHSTESSPDFTLPGDYLLAGLFPLHSGCLQVRHRPEVTLCDRSCSFNEHGYHLFQAMRLGVEEINNSTALLPNITLGYQLYDVCSDSANVYATLRVLSLPGQHHIELQGDLLHYSPTVLAVIGPDSTNRAATTAALLSPFLVPMISYAASSETLSVKRQYPSFLRTIPNDKYQVETMVLLLQKFGWTWISLVGSSDDYGQLGVQALENQATGQGICIAFKDIMPFSAQVGDERMQCLMRHLAQAGATVVVVFSSRQLARVFFESVVLTNLTGKVWVASEAWALSRHITGVPGIQRIGMVLGVAIQKRAVPGLKAFEEAYARADKKAPRPCHKGSWCSSNQLCRECQAFMAHTMPKLKAFSMSSAYNAYRAVYAVAHGLHQLLGCASGACSRGRVYPWQLLEQIHKVHFLLHKDTVAFNDNRDPLSSYNIIAWDWNGPKWTFTVLGSSTWSPVQLNINETKIQWHGKDNQVPKSVCSSDCLEGHQRVVTGFHHCCFECVPCGAGTFLNKSDLYRCQPCGKEEWAPEGSQTCFPRTVVFLALREHTSWVLLAANTLLLLLLLGTAGLFAWHLDTPVVRSA
GGRLCFLMLGSLAAGSGSLYGFFGEPTRPACLLRQALFALGFTIFLSCLTVRSFQLIIIFKFSTKVPTFYHAWVQNHGAGLFVMISSAAQLLICLTWLVVWTPLPAREYQRFPHLVMLECTETNSLGFILAFLYNGLLSISAFACSYLGKDLPENYNEAKCVTFSLLFNFVSWIAFFTTASVYDGKYLPAANMMAGLSSLSSGFGGYFLPKCYVILCRPDLNSTEHFQASIQDYTRRCGSTSEQ ID NO6氨基酸序列hT1R2MGPRAKTICSLFFLLWVLAEPAENSDFYLPGDYLLGGLFSLHANMKGIVHLNFLQVPMCKEYEVKVIGYNLMQAMRFAVEEINNDSSLLPGVLLGYEIVDVCYISMNVQPVLYFLAHEDNLLPIQEDYSNYISRVVAVIGPDNSESVMTVANFLSLFLLPQITYSAISDELRDKVRFPALLRTTPSADHHVEAMVQLMLHFRWNWIIVLVSSDTYGRDNGQLLGERVARRDICIAFQETLPTLQPNQNMTSEERQRLVTIVDKLQQSTARVVVVFSPDLTLYHFFNEVLRQNFTGAVWIASESWAIDPVLHNLTELGHLGTFLGITIQSVPIPGFSEFREWGPQAGPPPLSRTSQSYTCNQECDNCLNATLSFNTILRLSGERVVYSVYSAVYAVAHALHSLLGCDKSTCTKRVVYPWQLLEEIWKVNFTLLDHQIFFDPQGDVALHLEIVQWQWDRSQNPFQSVASYYPLQRQLKNIQDISWHTVNNTIPMSMCSKRCQSGQKKKPVGIHVCCFECIDCLPGTFLNHTEDEYECQACPNNEWSYQSETSCFKRQLVFLEWHEAPTIAVALLAALGFLSTLAILVIFWRHFQTPIVRSAGGPMCFLMLTLLLVAYMVVPVYVGPPKVSTCLCRQALFPLCFTICISCIAVRSFQIVCAFKMASRFPRAYSYWVRYQGPYVSMAFITVLKMVIVVIGMLATGLSPTTRTDPDDPKITIVSCNPNYRNSLLFNTSLDLLLSVVGFSFAYMGKELPTNYNEAKFITLSMTFYFTSSVSLCTFMSAYSGVLVTIVDLLVTVLNLLAISLGYFGPKCYMILFYPERNTPAYFNSMIQGYTMRRDSEQ ID NO7氨基酸序列hT1R3MLGPAVLGLSLWALLHPGTGAPLCLSQQLRMKGDYVLGGLFPLGEAEEAGLRSRTRPSSPVCTRFSSNGLLWALAMKMAVEEINNKSDLLPGLRLGYDLFDTCSEPVVAMKPSLMFLAKAGSRDIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPQVSYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDRVQLTAAAELLQEFGWNWVAALGSDDEYGRQGLSIFSALAAARGICIAHEGLVPLPRADDSRLGKVQDVLHQVNQSSVQVVLLFASVHAAHALFNYSISSRLSPKVWVASEAWLTSDLVMGLPGMAQMGTVLGFLQRGAQLHEFPQYVKTHLALATDPAFCSALGEREQGLEEDVVGQRCPQCDCITLQNVSAGLNHHQTFSVYAAVYSVAQALHNTLQCNASGCPAQDPVKPWQLLENMYNLTFHVGGLPLRFDSSGNVDMEYDLKLWVWQGSVPRLHDVGRFNGSLRT
ERLKIRWHTSDNQKPVSRCSRQCQEGQVRRVKGFHSCCYDCVDCEAGSYRQNPDDIACTFCGQDEWSPERSTRCFRRRSRFLAWGEPAVLLLLLLLSLALGLVLAALGLFVHHRDSPLVQASGGPLACFGLVCLGLVCLSVLLFPGQPSPARCLAQQPLSHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWADRLSGCLRGPWAWLVVLLAMLVEVALCTWYLVAFPPEVVTDWHMLPTEALVHCRTRSWVSFGLAHATNATLAFLCFLGTFLVRSQPGRYNRARGLTFAMLAYFITWVSFVPLLANVQVVLRPAVQMGALLLCVLGILAAFHLPRCYLLMRQPGLNTPEFFLGGGPGDAQGQNDGNTGNQGKHESEQ ID NO8核酸序列hT1R1ATGCTGCTCTGCACGGCTCGCCTGGTCGGCCTGCAGCTTCTCATTTCCTGCTGCTGGGCCTTTGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCTCCTGGCAGGCCTGTTCCCTCTCCATTCTGGCTGTCTGCAGGTGAGGCACAGACCCGAGGTGACCCTGTGTGACAGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCTTCCAGGCTATGCGGCTTGGGGTTGAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCAACATCACCCTGGGGTACCAGCTGTATGATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGCCACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCAGGGCAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCTTCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAGTGATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGCTGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCTGGTGCCCATGATTAGCTATGCGGCCAGCAGCGAGACGCTCAGCGTGAAGCGGCAGTATCCCTCTTTCCTGCGCACCATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTGCAGAAGTTCGGGTGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTAGGGGTGCAGGCACTGGAGAACCAGGCCACTGGTCAGGGGATCTGCATTGCTTTCAAGGACATCATGCCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGGCCCAGGCCGGGGCCACCGTCGTGGTTGTTTTTTCCAGCCGGCAGTTGGCCAGGGTGTTTTTCGAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCCTGGGCCCTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTGCTGGGCGTGGCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCCTATGCCCGGGCAGACAAGAAGGCCCCTAGGCCTTGCCACAAGGGCTCCTGGTGCAGCAGCAATCAGCTCTGCAGAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTCAAAGCCTTCTCCATGAGTTCTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCCCATGGCCTC
CACCAGCTCCTGGGCTGTGCCTCTGGAGCTTGTTCCAGGGGCCGAGTCTACCCCTGGCAGCTTTTGGAGCAGATCCACAAGGTGCATTTCCTTCTACACAAGGACACTGTGGCGTTTAATGACAACAGAGATCCCCTCAGTAGCTATAACATAATTGCCTGGGACTGGAATGGACCCAAGTGGACCTTCACGGTCCTCGGTTCCTCCACATGGTCTCCAGTTCAGCTAAACATAAATGAGACCAAAATCCAGTGGCACGGAAAGGACAACCAGGTGCCTAAGTCTGTGTGTTCCAGCGACTGTCTTGAAGGGCACCAGCGAGTGGTTACGGGTTTCCATCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGTGGGGCTGGGACCTTCCTCAACAAGAGTGACCTCTACAGATGCCAGCCTTGTGGGAAAGAAGAGTGGGCACCTGAGGGAAGCCAGACCTGCTTCCCGCGCACTGTGGTGTTTTTGGCTTTGCGTGAGCACACCTCTTGGGTGCTGCTGGCAGCTAACACGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGGGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCACCTAGACACCCCTGTGGTGAGGTCAGCAGGGGGCCGCCTGTGCTTTCTTATGCTGGGCTCCCTGGCAGCAGGTAGTGGCAGCCTCTATGGCTTCTTTGGGGAACCCACAAGGCCTGCGTGCTTGCTACGCCAGGCCCTCTTTGCCCTTGGTTTCACCATCTTCCTGTCCTGCCTGACAGTTCGCTCATTCCAACTAATCATCATCTTCAAGTTTTCCACCAAGGTACCTACATTCTACCACGCCTGGGTCCAAAACCACGGTGCTGGCCTGTTTGTGATGATCAGCTCAGCGGCCCAGCTGCTTATCTGTCTAACTTGGCTGGTGGTGTGGACCCCACTGCCTGCTAGGGAATACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATGCTTGAGTGCACAGAGACCAACTCCCTGGGCTTCATACTGGCCTTCCTCTACAATGGCCTCCTCTCCATCAGTGCCTTTGCCTGCAGCTACCTGGGTAAGGACTTGCCAGAGAACTACAACGAGGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCTTCAACTTCGTGTCCTGGATCGCCTTCTTCACCACGGCCAGCGTCTACGACGGCAAGTACCTGCCTGCGGCCAACATGATGGCTGGGCTGAGCAGCCTGAGCAGCGGCTTCGGTGGGTATTTTCTGCCTAAGTGCTACGTGATCCTCTGCCGCCCAGACCTCAACAGCACAGAGCACTTCCAGGCCTCCATTCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCTCCACCTGASEQ ID NO 9核酸序列hT1R3ATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGCCTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTTAGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGAGGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGCACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGGGCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAACTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCTCGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAggtcagCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTC
CCCTCCTTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTGCAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGGGCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGCCTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCCAGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATCACCACCAGACGTTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACAACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGCAGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCCAGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGCTGGCACACGTCTGACAACCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGACGACATCGCCTGCACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTTGGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCCAGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGGCAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCATGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGACGGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGTCAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCCC
CTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACATGAGTGASEQ ID NO10核酸序列hT1R2ATGGGGCCCAGGGCAAAGACCATCTGCTCCCTGTTCTTCCTCCTATGGGTCCTGGCTGAGCCGGCTGAGAACTCGGACTTCTACCTGCCTGGGGATTACCTCCTGGGTGGCCTCTTCTCCCTCCATGCCAACATGAAGGGCATTGTTCACCTTAACTTCCTGCAGGTGCCCATGTGCAAGGAGTATGAAGTGAAGGTGATAGGCTACAACCTCATGCAGGCCATGCGCTTCGCGGTGGAGGAGATCAACAATGACAGCAGCCTGCTGCCTGGTGTGCTGCTGGGCTATGAGATCGTGGATGTGTGCTACATCTCCAACAATGTCCAGCCGGTGCTCTACTTCCTGGCACACGAGGACAACCTCCTTCCCATCCAAGAGGACTACAGTAACTACATTTCCCGTGTGGTGGCTGTCATTGGCCCTGACAACTCCGAGTCTGTCATGACTGTGGCCAACTTCCTCTCCCTATTTCTCCTTCCACAGATCACCTACAGCGCCATCAGCGATGAGCTGCGAGACAAGGTGCGCTTCCCGGCTTTGCTGCGTACCACACCCAGCGCCGACCACCACGTCGAGGCCATGGTGCAGCTGATGCTGCACTTCCGCTGGAACTGGATCATTGTGCTGGTGAGCAGCGACACCTATGGCCGCGACAATGGCAGCTGCTTGGCGAGCGCGTGGCCCGGCGCGACATCTGCATCGCCTTCCAGGAGACGCTGCCCACACTGCAGCCCAACCAGAACATGACGTCAGAGGAGCGCCAGCGCCTGGTGACCATTGTGGACAAGCTGCAGCAGAGCACAGCGCGCGTCGTGGTCGTGTTCTCGCCCGACCTGACCCTGTACCACTTCTTCAATGAGGTGCTGCGCCAGAACTTCACGGGCGCCGTGTGGATCGCCTCCGAGTCCTGGGCCATCGACCCGGTCCTGCACAACCTCACGGAGCTGGGCCACTTGGGCACCTTCCTGGGCATCACCATCCAGAGCGTGCCCATCCCGGGCTTCAGTGAGTTCCGCGAGTGGGGCCCACAGGCTGGGCCGCCACCCCTCAGCAGGACCAGCCAGAGCTATACCTGCAACCAGGAGTGCGACAACTGCCTGAACGCCACCTTGTCCTTCAACACCATTCTCAGGCTCTCTGGGGAGCGTGTCGTCTACAGCGTGTACTCTGCGGTCTATGCTGTGGCCCATGCCCTGCACAGCCTCCTCGGCTGTGACAAAAGCACCTGCACCAAGAGGGTGGTCTACCCCTGGCAGCTGCTTGAGGAGATCTGGAAGGTCAACTTCACTCTCCTGGACCACCAAATCTTCTTCGACCCGCAAGGGGACGTGGCTCTGCACTTGGAGATTGTCCAGTGGCAATGGGACCGGAGCCAGAATCCCTTCCAGAGCGTCGCCTCCTACTACCCCCTGCAGCGACAGCTGAAGAACATCCAAGACATCTCCTGGCACACCGTCAACAACACGATCCCTATGTCCATGTGTTCCAAGAGGTGCCAGTCAGGGCAAAAGAAGAAGCCTGTGGGCATCCACGTCTGCTGCTTCGAGTGCATCGACTGCC
TTCCCGGCACCTTCCTCAACCACACTGAAGATGAATATGAATGCCAGGCCTGCCCGAATAACGAGTGGTCCTACCAGAGTGAGACCTCCTGCTTCAAGCGGCAGCTGGTCTTCCTGGAATGGCATGAGGCACCCACCATCGCTGTGGCCCTGCTGGCCGCCCTGGGCTTCCTCAGCACCCTGGCCATCCTGGTGATATTCTGGAGGCACTTCCAGACACCCATAGTTCGCTCGGCTGGGGGCCCCATGTGCTTCCTGATGCTGACACTGCTGCTGGTGGCATACATGGTGGTCCCGGTGTACGTGGGGCCGCCCAAGGTCTCCACCTGCCTCTGCCGCCAGGCCCTCTTTCCCCTCTGCTTCACAATTTGCATCTCCTGTATCGCCGTGCGTTCTTTCCAGATCGTCTGCGCCTTCAAGATGGCCAGCCGCTTCCCACGCGCCTACAGCTACTGGGTCCGCTACCAGGGGCCCTACGTCTCTATGGCATTTATCACGGTACTCAAAATGGTCATTGTGGTAATTGGCATGCTGGCCACGGGCCTCAGTCCCACCACCCGTACTGACCCCGATGACCCCAAGATCACAATTGTCTCCTGTAACCCCAACTACCGCAACAGCCTGCTGTTCAACACCAGCCTGGACCTGCTGCTCTCAGTGGTGGGTTTCAGCTTCGCCTACATGGGCAAAGAGCTGCCCACCAACTACAACGAGGCCAAGTTCATCACCCTCAGCATGACCTTCTATTTCACCTCATCCGTCTCCCTCTGCACCTTCATGTCTGCCTACAGCGGGGTGCTGGTCACCATCGTGGACCTCTTGGTCACTGTGCTCAACCTCCTGGCCATCAGCCTGGGCTACTTCGGCCCCAAGTGCTACATGATCCTCTTCTACCCGGAGCGCAACACGCCCGCCTACTTCAACAGCATGATCCAGGGCTACACCATGAGGAGGGACTAGSEQ ID NO 11核酸序列rT1R3ATGCCGGGTTTGGCTATCTTGGGCCTCAGTCTGGCTGCTTTCCTGGAGCTTGGGATGGGGTCCTCTTTGTGTCTGTCACAGCAATTCAAGGCACAAGGGGACTATATATTGGGTGGACTATTTCCCCTGGGCACAACTGAGGAGGCCACTCTCAACCAGAGAACACAGCCCAACGGCATCCTATGTACCAGGTTCTCGCCCCTTGGTTTGTTCCTGGCCATGGCTATGAAGATGGCTGTAGAGGAGATCAACAATGGATCTGCCTTGCTCCCTGGGCTGCGACTGGGCTATGACCTGTTTGACACATGCTCAGAGCCAGTGGTCACCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCATGGCCAAGGTGGGAAGTCAAAGCATTGCTGCCTACTGCAACTACACACAGTACCAACCCCGTGTGCTGGCTGTCATTGGTCCCCACTCATCAGAGCTTGCCCTCATTACAGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCACAGGTCAGCTATAGTGCCAGCATGGATCGGCTAAGTGACCGGGAAACATTTCCATCCTTCTTCCGCACAGTGCCCAGTGACCGGGTGCAGCTGCAGGCCGTTGTGACACTGTTGCAGAATTTCAGCTGGAACTGGGTGGCTGCCTTAGGTAGTGATGATGACTATGGCCGGGAAGGTCTGAGCATCTTTTCTGGTCTGGCCAACTCACGAGGTATCTGCATTGCACACGAGGGCCTGGTGCCACAACATGACACTAGTGGCCAACAATTGGGCAAGGTGGTGGATGTGCTACGCCAAGTGAACCAAAGCAAAGTACAGGTGGTGGTGCTGTTTGCATCTGCCCGTGCTGTCTACTCCCTTTTTAGCTACAGCATCCTTCATGACCTCTCACCCAAGGTATGGGTGGCCAGTGAGTCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGACACTTCCCAATATTGCCCGTGTGGGCACT
GTTCTTGGGTTTCTGCAGCGCGGTGCCCTACTGCCTGAATTTTCCCATTATGTGGAGACTCGCCTTGCCCTAGCTGCTGACCCAACATTCTGTGCCTCCCTGAAAGCTGAGTTGGATCTGGAGGAGCGCGTGATGGGGCCACGCTGTTCACAATGTGACTACATCATGCTACAGAACCTGTCATCTGGGCTGATGCAGAACCTATCAGCTGGGCAGTTGCACCACCAAATATTTGCAACCTATGCAGCTGTGTACAGTGTGGCTCAGGCCCTTCACAACACCCTGCAGTGCAATGTCTCACATTGCCACACATCAGAGCCTGTTCAACCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAATATGAGTTTCCGTGCTCGAGACTTGACACTGCAGTTTGATGCCAAAGGGAGTGTAGACATGGAATATGACCTGAAGATGTGGGTGTGGCAGAGCCCTACACCTGTACTACATACTGTAGGCACCTTCAACGGCACCCTTCAGCTGCAGCACTCGAAAATGTATTGGCCAGGCAACCAGGTGCCAGTCTCCCAGTGCTCCCGGCAGTGCAAAGATGGCCAGGTGCGCAGAGTAAAGGGCTTTCATTCCTGCTGCTATGACTGTGTGGACTGCAAGGCAGGGAGCTACCGGAAGCATCCAGATGACTTCACCTGTACTCCATGTGGCAAGGATCAGTGGTCCCCAGAAAAAAGCACAACCTGCTTACCTCGCAGGCCCAAGTTTCTGGCTTGGGGGGAGCCAGCTGTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACACTGGCTGCCCTGGGGCTCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTGGGTCACTGTTCTGCTTTGGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGACCACGCTCTGCCAGCTGCCTTGCCCAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAAGCAGCCGAGATCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGTTGGGCAAACTGGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTACTGCTGGCCACTCTTGTGGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAGAGGTGGTGACAGATTGGCAGGTGCTGCCCACGGAGGTACTGGAACACTGCCGCATGCGTTCCTGGGTCAGCCTGGGCTTGGTGCACATCACCAATGCAGTGTTAGCTTTCCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACAGAGCCAGCCTGGTCGCTATAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTCGCCATGCTAGCTTATTTCATCATCTGGGTCTCTTTTGTGCCCCTCCTGGCTAATGTGCAGGTGGCCTACCAGCCAGCTGTGCAGATGGGTGCTATCTTATTCTGTGCCCTGGGCATCCTGGCCACCTTCCACCTGCCCAAATGCTATGTACTTCTGTGGCTGCCAGAGCTCAACACCCAGGAGTTCTTCCTGGGAAGGAGCCCCAAGGAAGCATCAGATGGGAATAGTGGTAGTAGTGAGGCAACTCGGGGACACAGTGAATGA同樣，下列概念性翻譯對應(yīng)于魚類T1R的兩個直向進化同源基因?qū)Φ腃末端，來源于未發(fā)表的基因組序列，提供于此。Fugu T1RA來源于登錄號’scaffold164’；Fugu T1RB來源于登錄號LPC61711；Tetradon T1RA來源于登錄號AL226735；Tetradon T1RB來源于登錄號AL222381。概念性翻譯中的多義(ambiguity)(’X’)來自于數(shù)據(jù)庫序列的多義。
SEQ ID NO 12T1RA FuguPSPFRDIVSYPDKIILGCFMNLKTSSVSFVLLLLLCLLCFIFSYMGKDLPKNYNEAKAITFCLLLLILTWIIFTTASLLYQGKYIHSLNALAVLSSIYSFLLWYFLPKCYIIIFQPQKNTQKYFQGLIQDYTKTISQSEQ ID NO 13T1RA TetradonFAVNYNTPVVRSAGGPMCFLILGCLSLCSISVFFYFERPTEAFCILRFMPFLLFYAVCLACFAVRSFQIVIIFKIAAKFPRVHSWWMKYHGQWLVISMTFVLQAVVIVIGFSSNPPLPYXXFVSYPDKIILGCDVNLNMASTSFFLLLLLCILCFTFSYMGKDLPKNYNEAKAITFCLLLLILTWIIFATAFMLYHGKYIHTLNALAVLSSAYCFLLWYFLPKCYIIIFQPHKNTQKYFQLSSEQ ID NO 14T1RB FuguKKQGPEVDIFIVSVTILCISVLGVAVGPPEPSQDLDFYMDSIVLECSNTLSPGSFIELCYVCVLSVLCFFFSYMGKDLPANYNEAKCVTFSLMVYMISWISFFTVYLISRGPFTVAAYVCATLVSVLAFFGGYFLPKIYIIVLKPQMNTTAHFQNCIQMYTMSKQSEQ ID NO 15T1RB TetradonAPKSSQRXLRRTRLXLEWDHPMSVALLFFLVCCLLMTSSSAVILLLNINTPVAKSAGGXTCXLKLAALTAAAMSSXCHFGQPSPLASKLKQPQFTFSFTVCLACNRCALATGHLHFXIRVALPPAYNXWAKNHGPXATIFIASAAILCVLCLRVAVGPPQPSQBLBFXTNSIXLXXSNTLSPGSFVELCNVSLLSAVCFVFSXMGKBLPANYNEAKCVTFSLMVNXISWISFFTVY另外，小鼠和大鼠T1R及其公共結(jié)構(gòu)域等位基因變體相關(guān)的登錄號和參考引用如下所示rT1R1(登錄號AAD18069)(Hoon等人，Cell 96(4)541-51(1999))；rT1R2(登錄號AAD18070)(Hoon等人，Cell 96(4)541-59(1999))；mT1R1(登錄號AAK39437)；mT1R2(登錄號AAK 39438)；mT1R3(登錄號AAK 55537)(Max等人，Nat.Genet.28(I)58-63(2001))；rT1R1(登錄號AAK7092)(Li等人，Mamm.Genome(12(I)13-16(2001))；mT1R1(登錄號NP114073)；mT1R1(登錄號AAK07091)(Li等人，Mamm.Genome(121)13-16(2001))；rT1R2(登錄號AAD18070)(Hoon等人，Cell 9664)541-551(1999))；mT1R2(登錄號NP114079)；mT1R3(登錄號AAK39436)；mT1R3(登錄號BAB47181)；(Kitagawa等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.283(1)236-42(2001))；mT1R3(登錄號NP114078)；mT1R3(登錄號AAK55536)(Max等人，Nat.Genet.28(1)58-63(2001))；以及mT1R3(登錄號AAK01937)。
實施例2人和大鼠T1R的序列比對選自上述所鑒定的T1R克隆序列與大鼠對應(yīng)T1R進行比對。如圖1所示，人T1R1、人T1R2和人T1R3以及大鼠T1R3與前述T1R(登錄號為AAD18069的rT1R1以及登錄號為AAD18070的rT1R2)、大鼠mGluR1代謝型谷氨酸受體(登錄號P23385)；以及人鈣感受性受體(登錄號P41180)進行比對。為了清晰比較，將mGluR1和鈣感受性受體C末端截短。藍色方框為7個可能的跨膜片段。紅色方框為在mGluR1晶體結(jié)構(gòu)中接觸谷氨酸側(cè)鏈carbutylate的殘基，綠色方框為接觸谷氨酸α-氨基酸部分的殘基。紫色圓圈為參與基于亞基間二硫鍵形成的mGluR1和鈣感受性受體半胱氨酸殘基。這些半胱氨酸在T1R1和T1R2中并不保守，但位于比對的下降區(qū)，其中包含潛在的類似T1R3半胱氨酸殘基，也畫于圓圈內(nèi)。
實施例3RT-PCR證明hT1R2和hT1R3在味覺組織中表達如圖2所示，hT1R2和hT1R3在味覺組織中表達利用RT-PCR檢測人輪廓乳頭切片中兩個基因的表達。
實施例4
在異源細胞中異源表達T1R的方法穩(wěn)定表達Gα15的HEK-293衍生細胞(Chandrashekar等人，Cell100(6)703-11(2000))，在添加10％FBS、MEM非必需氨基酸(GibcoBRL)以及3μg/ml滅菌素(blasticidin)的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium(DMEM，Gibco BRL)中生長并維持。在鈣成像實驗中，首先將細胞接種于24孔組織培養(yǎng)板中(約0.1×106/孔)，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Mirus Transit-293(PanVera)。為最小化谷氨酸誘導(dǎo)以及葡萄糖誘導(dǎo)的脫敏化作用，轉(zhuǎn)染后約24小時利用低葡萄糖DMEM/GlutaMAX(Gibco BRL)替換加入的DMEM。24小時以后，將細胞加入含3μM鈣染料Fluo-4(Molecular Probes)的Dulbecco’s PBS緩沖液(DPBS，GibcoBRL)中，室溫1.5小時。更換250μl DPBS后，加入含有味覺刺激物的200μl DPBS，室溫下進行刺激。利用AxiovertS100 TV顯微鏡(Zeiss)，通過Imaging Workbench 4.0軟件(Axon)監(jiān)測鈣的動員。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的響應(yīng)非常短暫-鈣增加很少能保持多于15秒-而且是異步的。響應(yīng)細胞的數(shù)量因而隨時間相對恒定，因此，通過在固定時間點、一般于加入刺激物后30秒，手工計數(shù)響應(yīng)細胞數(shù)目，可以對細胞響應(yīng)進行定量。
實施例5人T1R2/T1R3具有甜味覺受體功能利用人T1R2、T1R3以及T1R2/T1R3瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞，分析細胞內(nèi)鈣響應(yīng)蔗糖濃度的提高而提高(圖3(a))。同樣，測定幾種甜味覺刺激物的T1R2/T1R3劑量響應(yīng)(圖3(b))。不同甜味劑的響應(yīng)細胞最大百分比不同，為10-30％。為清楚起見，將劑量響應(yīng)按響應(yīng)細胞最大百分比進行標準化。圖3數(shù)值代表4次獨立響應(yīng)的平均值±s.e.。X-軸圓圈標示了通過味覺測試確定的身心檢測閾值。Gurmarin(10g/l過濾的匙羹藤(Gymnema Sylvestre)水提取物的50倍稀釋液)可抑制T1R2/T1R3對250mM蔗糖的響應(yīng)，但不抑制內(nèi)源性β2-腎上腺素能受體對20μM異丙基腎上腺素的響應(yīng)(圖3(b))。圖3(c)包含T1R2/T1R3共表達細胞系對不同甜味劑(蔗糖、天冬甜精、D-色氨酸和糖精)的標準化響應(yīng)。
實施例6大鼠T1R2/T1R3也具有甜味覺受體功能利用hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3以及rT1R2/hT1R3瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞。然后分析這些轉(zhuǎn)染細胞響應(yīng)350mM蔗糖、25mM色氨酸、15mM天冬甜精、以及0.05％應(yīng)樂果甜蛋白(monellin)而提高的細胞內(nèi)鈣。圖4包含蔗糖和天冬甜精的結(jié)果，表明rT1R2/rT1R3也具有甜味劑受體的功能。這些結(jié)果還提示T1R2可能控制T1R2/T1R3配體特異性。
實施例7使用基于熒光的自動化分析測定T1R2/T1R3響應(yīng)利用hT1R2和hT1R3瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞。這些細胞加入鈣染料Fluo-4，使用熒光平板閱讀儀測量其對甜味劑的響應(yīng)。圖5包含表達hT1R2/hT1R3的細胞以及只表達hT1R3的細胞(J19-22)對環(huán)己氨磺酸鹽(cyclamate，12.5mM)的響應(yīng)。所得熒光結(jié)果表明，只有表達hT1R2/hT1R3的細胞對這些味覺刺激物發(fā)生響應(yīng)。圖6包含標準化的劑量-響應(yīng)曲線，結(jié)果表明，根據(jù)與多種味覺刺激物的劑量特異性相互作用，hT1R2和hT1R3共同發(fā)揮人味覺受體的功能。圖6特別包含對蔗糖、色氨酸以及可以商品化獲得的其它多種甜味劑的劑量-響應(yīng)。這些結(jié)果表明，由于分析中所得排序和閾值密切反映人甜味覺的數(shù)值，因此T1R2/T1R3是人甜味劑受體。
實施例8mGluR1的配體結(jié)合殘基在T1R1中保守如圖6所示，mGluR1的關(guān)鍵配體結(jié)合殘基在T1R1中保守。按照與圖1相同的色彩方案加亮的幾個關(guān)鍵殘基顯示谷氨酸與mGluR1的相互作用。
實施例9人T1R1/T1R3具有鮮味覺受體功能利用人T1R1、T1R3以及T1R1/T1R3瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞，分析細胞內(nèi)鈣響應(yīng)谷氨酸濃度的提高而提高(圖8(a))，0.5mM谷氨酸)，0.2mM IMP，以及0.5mM谷氨酸加上0.2mM IMP(圖8(b))。在有無0.2mM IMP存在下測定人T1R1/T1R3對谷氨酸的劑量響應(yīng)(圖8(c))。對谷氨酸響應(yīng)的細胞最大百分比約為5％，而谷氨酸加上IMP約為10％。為清楚起見，將劑量響應(yīng)按響應(yīng)細胞最大百分比進行標準化。數(shù)值代表4次獨立響應(yīng)的平均值±s.e.。X-軸圓圈標示了通過味覺測試確定的味覺檢測閾值。
實施例10PDZIP作為輸出序列將6殘基PDZIP序列(SVSTW(SEQ ID NO1))與hT1R2的C末端融合，該嵌合受體(即hT1R2-PDZIP)轉(zhuǎn)染HEK-293宿主細胞。然后使用免疫熒光和FACS掃描數(shù)據(jù)監(jiān)測hT1R2的表面表達。如圖9A和9B所示，包含PDZIP序列可以相對hT1R2而言提高hT1R2-PDZIP的表面表達。更具體而言，圖9A顯示myc-標簽的hT1R2的免疫熒光染色，表明PDZIP可顯著提高hT1R2蛋白質(zhì)在質(zhì)膜上的數(shù)量。圖9B顯示FACS分析數(shù)據(jù)，表明了相同結(jié)果-虛線表示表達myc-標簽的hT1R2的細胞，實線表示表達myc-標簽的hT1R2-PDZIP的細胞。特別而言，圖10A顯示處于HBS緩沖液中的未轉(zhuǎn)染的Gα15穩(wěn)定的宿主細胞，圖10B顯示處于甜味劑混合物no.5(糖精、環(huán)己氨基磺酸鈉、乙酰舒泛K(Acesulfam K)和天冬甜精-各20mM，處于HBS緩沖液中)中的轉(zhuǎn)染hT1R2-PDZIP的Gα15穩(wěn)定的宿主細胞，圖10C顯示處于甜味劑混合物no.5中的轉(zhuǎn)染T1R3-PDZIP的Gα15穩(wěn)定的宿主細胞，圖10D顯示處于甜味劑混合物no.5中的共轉(zhuǎn)染hT1R2-PDZIP/hT1R3-PDZIP的Gα15穩(wěn)定的宿主細胞。另外，圖10E-10H顯示hT1R2/hT1R3共轉(zhuǎn)染的Gα15穩(wěn)定的宿主細胞對蔗糖的劑量依賴性響應(yīng)-E0mM，在HBS緩沖液中；F30mM；G60mM；H250mM。圖10I-10L顯示hT1R2/hT1R3共轉(zhuǎn)染的Gα15穩(wěn)定的宿主細胞對各種甜味劑的響應(yīng)-I天冬甜精(1.5mM)；J乙酰舒泛K(1mM)；K紐甜(Neotame，20mM)；L環(huán)己氨基磺酸鈉(20mM)。圖10的鈣成像表明，hT1R2和hT1R3均為甜味刺激物引發(fā)的活性所必需。
實施例11產(chǎn)生穩(wěn)定共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的細胞系將分別包含hT1R1或hT1R2表達構(gòu)建體(T1R1為質(zhì)粒SAV2485，T1R2為SAV2486)以及hT1R3(T1R3為質(zhì)粒SXV550)的線性化的PEAK10衍生(Edge Biosystems)載體以及pCDNA 3.1/ZEO衍生(Invitrogen)載體轉(zhuǎn)染到表達Gα15的細胞系中，得到穩(wěn)定共表達人T1R2/T1R3或人T1R1/T1R3的人細胞系。具體而言，通過將線性化的SAV2486和SXV550共轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達Gα15的Aurora Bioscience’s HEK-293細胞系中，產(chǎn)生T1R2/T1R3穩(wěn)定細胞系。通過將線性化的SAV2485和SXV550共轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達Gα15的相同HEK-293細胞系中，產(chǎn)生T1R1/T1R3穩(wěn)定細胞系。轉(zhuǎn)染S AV2485/SXV550和SAV2486/SXV550以后，選擇、擴增嘌呤霉素(puromycin)抗性以及zeocin抗性克隆，并通過鈣成像檢測其對甜味或鮮味覺刺激物的響應(yīng)。在添加GlutaMAX、10％透析FBS以及0.003mg/ml滅菌素(blasticidin)的低葡萄糖DMEM中，利用0.0005mg/ml嘌呤霉素(CALBIOCHEM)和0.1mg/ml zeocin(Invitrogen)于37℃選擇細胞。擴增抗性克隆，通過熒光顯微術(shù)評價其對甜味覺刺激物的響應(yīng)。為了利用VIPR-II儀器(Aurora Biosciences)進行自動化熒光成像分析，首先將穩(wěn)定表達T1R2/T1R3的細胞接種于96孔板(約100,000細胞/孔)。24小時后，將細胞加入含0.005mM鈣染料Fluo-3-AM(Molecular Probes)的PBS緩沖液中，室溫1小時。更換70μl PBS后，加入含有味覺刺激物的70μl PBS，室溫下進行刺激。在加入化合物之前測量，校正背景熒光，以對0.001mM鈣離子載體離子霉素(ionomycin，CALBIOCHEM)的響應(yīng)進行標準化，加入化合物后熒光(480nm激發(fā)，535nm發(fā)射)平均響應(yīng)20-30秒。
這些細胞系接觸甜味或鮮味刺激物，然后觀察到活性克隆一般80％的細胞可響應(yīng)味覺刺激。意想不到的是，各細胞的響應(yīng)強度顯著高于瞬時轉(zhuǎn)染的細胞。
在此觀察基礎(chǔ)上，本發(fā)明人如上所述利用Aurora Bioscience’sVIPR儀器通過自動化熒光成像測試了穩(wěn)定細胞系的T1R活性。兩種T1R1/T1R3以及一種T1R2/T1R3細胞系的響應(yīng)分別如圖11和12所示。
值得注意的是，聯(lián)合提高響應(yīng)細胞數(shù)和響應(yīng)強度導(dǎo)致相對于瞬時轉(zhuǎn)染的細胞，其活性提高10倍。(通過比較，在優(yōu)化條件下，T1R2/T1R3瞬時轉(zhuǎn)染的細胞的離子霉素響應(yīng)百分比約為5％。)此外，穩(wěn)定表達人T1R2/T1R3和T1R1/T1R3所獲得的劑量響應(yīng)與人味覺檢測閾值相關(guān)。這些穩(wěn)定細胞系的強大T1R活性提示，其非常適用于高通量篩選化學(xué)文庫，以鑒定可調(diào)節(jié)甜味或鮮味覺受體、從而調(diào)節(jié)、增強、阻斷或模擬甜味或鮮味覺的化合物，例如小分子。
實施例12產(chǎn)生選擇性響應(yīng)鮮味覺刺激物的誘導(dǎo)型共表達T1R1/T1R3的細胞系穩(wěn)定表達鮮味覺受體的T1R1/T1R3 HEK 293細胞系比瞬時轉(zhuǎn)染的細胞顯示更強的活性。但缺點在于，其在細胞增殖過程中快速喪失活性。
這些發(fā)現(xiàn)也支持本發(fā)明人的假設(shè)，即(i)T1R1/T1R3是鮮味覺受體，(ii)高表達T1R1/T1R3的細胞系、優(yōu)選穩(wěn)定和/或誘導(dǎo)型表達T1R1/T1R3的細胞系可用于分析中，優(yōu)選用于高通量篩選化學(xué)文庫，以鑒定新型鮮味覺調(diào)節(jié)劑?？赡苁褂迷鰪婖r味覺的調(diào)節(jié)劑了。
為克服穩(wěn)定表達T1R1/T1R3的細胞系的不穩(wěn)定性，已使用GeneSwitch系統(tǒng)(Invitrogen)將HEK-Gα15細胞改造為誘導(dǎo)型表達T1R1/T1R3。pGene衍生的人T1R1和T1R3的zeocin抗性表達載體(T1R1為質(zhì)粒SXV603，T1R3為質(zhì)粒SXV611)以及攜帶GeneSwitch蛋白質(zhì)的嘌呤霉素抗性的pSwitch衍生載體(質(zhì)粒SXV628)經(jīng)線性化，共轉(zhuǎn)染到HEK-Gα15細胞系。Zeocin抗性以及嘌呤霉素抗性的克隆經(jīng)選擇、擴增，利用不同數(shù)量的米非司酮(mifepristone)誘導(dǎo)，通過鈣成像測試其對鮮味覺刺激物的響應(yīng)。
誘導(dǎo)型表達T1R1/T1R3產(chǎn)生高活性。例如，約80％的誘導(dǎo)細胞可響應(yīng)L-谷氨酸，而瞬時轉(zhuǎn)染細胞只有約10％；更具體而言，表達人T1R1和人T1R3的pGene衍生的Zeocin抗性表達載體以及攜帶GeneSwitch蛋白質(zhì)的嘌呤霉素抗性pSwitch衍生載體經(jīng)線性化，共轉(zhuǎn)染到Gα15細胞中。在添加GlutaMAX、10％透析FBS以及3μg/ml滅菌素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium中，利用0.5μg/ml嘌呤霉素(CAL BIOCHEM)和100μg/ml Zeocin(Invitrogen)于37℃選擇細胞?？剐钥寺〗?jīng)擴增、并用10-10M米非司酮誘導(dǎo)后，按照Li等人，PNAS 99(7)4692-4696(2002).的方法，利用熒光顯微術(shù)測定其對鮮味覺刺激物的響應(yīng)。
為了利用FLIPR儀器(Molecular Device)進行自動化熒光成像，將來自一個克隆(稱為克隆1-17)的細胞在10-10M米非司酮存在下接種于96孔板中(約80,000細胞/孔)，溫育48小時。然后將細胞加入含3μM鈣染料Fluo-4-AM(Molecular Probes)的PBS緩沖液中，室溫1.5小時。
更換50μl PBS后，加入含有不同刺激物的50μl PBS，室溫下進行刺激。與先前需要通過逐一計數(shù)響應(yīng)細胞來定量T1R1/T1R3受體活性的瞬時T1R1/T1R3鮮味受體表達系統(tǒng)(Li等人，PNAS 99(7)4692-4696(2002))(由于其受體活性較低)相比，此誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)得到的克隆1-17的活性大大提高，使得可以通過測定成像細胞視野總的最大熒光增強(480nm激發(fā)、535nm發(fā)射)來定量受體活性。在加入化合物之前測量，校正背景熒光，以對0.002mM離子霉素(CALBIOCHEM)的響應(yīng)進行標準化，將4次獨立測定的最大熒光進行平均。
圖13包含了這些結(jié)果。圖13特別包含在有無0.2mMIMP存在下測定的對L-谷氨酸的劑量響應(yīng)曲線。在圖中，每個數(shù)值代表4次獨立測定的平均總最大熒光(校正背景熒光)。這些劑量-響應(yīng)曲線對應(yīng)于T1R1/T1R3瞬時轉(zhuǎn)染的細胞所測曲線。
還利用不同L-氨基酸進行篩選，來評價鮮味覺T1R1/T1R3受體的選擇性。所得結(jié)果表明，T1R1/T1R3可被鮮味的L-氨基酸(L-谷氨酸和L-天冬氨酸)選擇性活化。
圖14和15包含在不同L-氨基酸存在下測試1-17克隆的所獲響應(yīng)的實驗結(jié)果。圖14顯示1-17細胞系在有無1mM IMP存在下接觸濃度為10mM的不同L-氨基酸的實驗結(jié)果。
圖15包含在0.2mM IMP存在下測定的活性氨基酸的劑量-響應(yīng)曲線。每個數(shù)值代表4次獨立測定的平均值。
這些實驗所獲結(jié)果證實，該鮮味覺受體對鮮味覺刺激物具有特異性和選擇性。鮮味覺刺激物L-谷氨酸和L-天冬氨酸在不同濃度下顯著活化T1R1/T1R3受體(參見圖14和15)，而可活化人T1R1/T1R3受體的其它L-氨基酸只在很高濃度下微弱活化該受體。
因此，這些結(jié)果證實T1R1/T1R3受體對鮮味覺刺激物的選擇性，以及該誘導(dǎo)型穩(wěn)定表達系統(tǒng)適用于使用自動化熒光成像儀的高通量篩選分析，以鑒定可活化鮮味覺受體的化合物，例如L-谷氨酸或L-天冬氨酸，或可增強L-谷氨酸活化鮮味覺受體的活性的化合物，例如5’-IMP或5’-GMP，或可阻斷通過鮮味覺刺激物例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸的鮮味覺受體活化的化合物。
用這些分析方法鑒定的化合物可能用作食品和飲料組合物的香料，以模擬或阻斷鮮味覺刺激物。
實施例13拉克替醇抑制人T1R2/T1R3和T1R1/T1R3的受體活性以及甜味和鮮味覺一種芳烷基羧酸，拉克替醇，被認為是選擇性的甜味劑抑制劑(參見Lindley(1986)美國專利4,567,053；以及Schiffman等人ChemSenses 24439-447(1999))。測定了瞬時轉(zhuǎn)染T1R2/T1R3的HEK-Gα15細胞在各種濃度拉克替醇存在下對150mM蔗糖的響應(yīng)。拉克替醇抑制人T1R2/T1R3活性，其IC50為24μM。
T1R1/T1R3鮮味覺和T1R2/T1R3甜味覺受體可能具有共同的亞基。因此推論，可抑制T1R2/T1R3甜味劑受體的拉克替醇，可能對T1R1/T1R3鮮味覺受體具有類似效應(yīng)。本發(fā)明人測試了拉克替醇對人T1R1/T1R3響應(yīng)10mM L-谷氨酸的作用。與T1R2/T1R3甜味受體類似，拉克替醇抑制T1R1/T1R3的IC50為165μM。拉克替醇抑制可能反映了對T1R受體的拮抗作用，而非例如非特異性抑制Gα15介導(dǎo)的信號發(fā)生，因為毒蕈堿型乙酰膽堿受體不受拉克替醇抑制。
本發(fā)明人然后評價了拉克替醇對人鮮味覺的作用。按照Schiffman等人(Chem.Senses 24439-447(1989))方法，測定在1和2mM拉克替醇存在下的在有或無0.2mM IMP的鮮味覺刺激物L-谷氨酸、甜味劑刺激物蔗糖和D-色氨酸、以及咸味覺刺激物氯化鈉味覺閾值。毫摩爾濃度的拉克替醇可顯著提高甜味覺和鮮味覺刺激物的檢測閾值，對咸味覺刺激物則不然。圖16包含了這些結(jié)果。
總之，(i)這些發(fā)現(xiàn)進一步支持本發(fā)明人的假設(shè)，即T1R1/T1R3是唯一的鮮味覺受體，以及(ii)T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受體可能共有結(jié)構(gòu)上相關(guān)的拉克替醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
盡管以上詳盡敘述已經(jīng)描述了本發(fā)明的幾個實施方案，應(yīng)當理解以上描述只是說明、而非限制此公開發(fā)明。本發(fā)明僅受以下權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.由至少一種T1R1多肽(或所述T1R1多肽的變體、片段、或嵌合體)和/或至少一種T1R3多肽(或所述T1R3多肽的變體、片段、或嵌合體)組成的受體，其中所述受體可特異性結(jié)合鮮味覺刺激物和/或由其活化。
2.權(quán)利要求1的受體，其包含天然hT1R1多肽的片段、變體或嵌合體。
3.權(quán)利要求1的受體，其包含天然hT1R3多肽的片段、變體或嵌合體。
4.權(quán)利要求1的受體，其中所述T1R1和T1R3來源于相同物種。
5.權(quán)利要求1的受體，其中所述T1R1和T1R3來源于不同物種。
6.權(quán)利要求1的受體，其中所述T1R1和/或T1R3來源于哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物或鳥類。
7.權(quán)利要求1的受體，其中所述T1R1和/或T1R3來自hT1R1、hT1R3、rT1R1、rT1R3、mT1R1、mT1R3；或其片段、變體或嵌合體。
8.包含權(quán)利要求1的受體的組合物。
9.包含權(quán)利要求2的受體的組合物。
10.包含權(quán)利要求3的受體的組合物。
11.包含權(quán)利要求4的受體的組合物。
12.包含權(quán)利要求5的受體的組合物。
13.包含權(quán)利要求6的受體的組合物。
14.包含權(quán)利要求7的受體的組合物。
15.表達由至少一種T1R1多肽(或所述T1R1多肽的變體、片段、或嵌合體)和/或至少一種T1R3多肽(或所述T1R3多肽的變體、片段、或嵌合體)組成的受體的細胞，其中所述受體可特異性結(jié)合鮮味覺刺激物和/或由其活化。
16.權(quán)利要求15的細胞，其選自HEK293、COS和CHO細胞以及非洲爪蟾卵母細胞。
17.權(quán)利要求15的細胞，其中所述T1R1和T1R3來自于相同物種。
18.權(quán)利要求15的細胞，其中所述T1R1和T1R3來源于不同物種。
19.權(quán)利要求15的細胞，其中所述T1R1和/或T1R3來源于哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物或鳥類。
20.權(quán)利要求15的細胞，其中所述T1R1和T1R3選自hT1R1、hT1R3、mT1R1、mT1R3、rT1R1和rT1R3；或其片段、變體或嵌合體。
21.由至少一種T1R2多肽(或所述T1R2多肽的變體、片段、或嵌合體)和/或至少一種T1R3多肽(或所述T1R3多肽的變體、片段、或嵌合體)組成的受體，其中所述受體可特異性結(jié)合甜味覺刺激物和/或由其活化。
22.權(quán)利要求21的受體，其包含天然hT1R2多肽的片段、變體或嵌合體。
23.權(quán)利要求21的受體，其包含天然hT1R3多肽的片段、變體或嵌合體。
24.權(quán)利要求21的受體，其中所述T1R2和T1R3來源于相同物種。
25.權(quán)利要求21的受體，其中所述T1R2和T1R3來源于不同物種。
26.權(quán)利要求21的受體，其中所述T1R2和/或T1R3來源于哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物或鳥類。
27.權(quán)利要求21的受體，其中所述T1R2和/或T1R3來自于hT1R2、hT1R3、rT1R2、rT1R3、mT1R2、mT1R3；或其片段、變體或嵌合體。
28.包含權(quán)利要求21的受體的組合物。
29.包含權(quán)利要求22的受體的組合物。
30.包含權(quán)利要求23的受體的組合物。
31.包含權(quán)利要求24的受體的組合物。
32.包含權(quán)利要求25的受體的組合物。
33.包含權(quán)利要求26的受體的組合物。
34.包含權(quán)利要求27的受體的組合物。
35.表達由至少一種T1R2多肽(或所述T1R2多肽的變體、片段、或嵌合體)和/或至少一種T1R3多肽(或所述T1R3多肽的變體、片段、或嵌合體)組成的受體的細胞，其中所述受體可特異性結(jié)合甜味覺刺激物和/或由其活化。
36.權(quán)利要求35的細胞，其選自HEK293、COS和CHO細胞以及非洲爪蟾卵母細胞。
37.權(quán)利要求35的細胞，其中所述T1R2和T1R3來自于相同物種。
38.權(quán)利要求35的細胞，其中所述T1R2和T1R3來源于不同物種。
39.權(quán)利要求35的細胞，其中所述T1R2和/或T1R3來源于哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物或鳥類。
40.權(quán)利要求35的細胞，其中所述T1R2和T1R3選自hT1R2、hT1R3、mT1R2、mT1R3、rT1R2和rT1R3；或其片段、變體或嵌合體。
41.結(jié)合于固相的權(quán)利要求1-7或21-27的受體。
42.處于溶液中的權(quán)利要求1-7或21-27的受體。
43.處于脂雙層或囊泡中的權(quán)利要求1-7或21-27的受體。
44.鑒定可調(diào)節(jié)味覺感受的化合物的方法，其通過鑒定可結(jié)合、活化、抑制、增強和/或調(diào)節(jié)權(quán)利要求1-7和/或21-27的一種或多種受體的化合物而鑒定。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體結(jié)合于固相物。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體處于溶液中。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體處于脂雙層或囊泡中。
48.權(quán)利要求44的方法，其中使用受體結(jié)合分析方法鑒定所述化合物。
49.權(quán)利要求44的方法，其中使用基于受體活性的分析方法鑒定所述化合物。
50.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體表達于細胞中。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述細胞是HEK-293、COS或CHO細胞。
52.權(quán)利要求50的方法，其中通過其對受體內(nèi)化的作用而鑒定所述化合物。
53.權(quán)利要求50的方法，其中通過其對受體磷酸化的作用而鑒定所述化合物。
54.權(quán)利要求50的方法，其中通過其對抑制蛋白易位的作用而鑒定所述化合物。
55.權(quán)利要求44的方法，其使用針對第二信使的分析方法。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述第二信使是cAMP或IP3。
57.權(quán)利要求50的方法，其使用電壓敏感性或鈣敏感性染料。
58.權(quán)利要求50的方法，其中所述細胞表達至一種G蛋白。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述G蛋白是混棲G蛋白。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述混棲G蛋白是Gα15或Gα16。
61.權(quán)利要求44的方法，其中使用病毒性載體表達所述受體。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述病毒性載體表達于哺乳動物細胞中。
63.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體通過體外翻譯產(chǎn)生。
64.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體以膜結(jié)合形式分離。
65.權(quán)利要求44的方法，其中通過其對所述受體活化G蛋白的作用而鑒定所述化合物。
66.權(quán)利要求44的方法，其中通過其對受體構(gòu)象的作用而鑒定所述化合物。
67.權(quán)利要求66的方法，其中通過對蛋白水解的敏感性變化而檢測所述構(gòu)象變化。
68.權(quán)利要求66的方法，其中通過NMR光譜學(xué)檢測所述構(gòu)象變化。
69.權(quán)利要求66的方法，其中通過熒光光譜學(xué)檢測所述構(gòu)象變化。
70.權(quán)利要求44的方法，其中通過其對所述受體與放射性或熒光標記的配體結(jié)合的作用而鑒定所述化合物。
71.權(quán)利要求70的方法，其中利用熒光偏振或FRET分析來測定所述標記化合物的移位。
72.權(quán)利要求44的方法，其是高通量篩選分析方法。
73.權(quán)利要求44的方法，其中受體活性與報告基因相關(guān)聯(lián)。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述報告基因是螢光素酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或β-內(nèi)酰胺酶。
75.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體是組成型活性變體。
76.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體的表達位于組成型啟動子控制之下。
77.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體的表達位于調(diào)節(jié)型啟動子控制之下。
78.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體與可促進表面表達的肽融合。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述肽是PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用肽。
80.權(quán)利要求44的方法，其中根據(jù)所述受體的X射線晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測所述化合物對該受體的作用。
81.權(quán)利要求44的方法，其中通過其對表達天然或轉(zhuǎn)基因T1R受體的非人動物的作用而鑒定所述化合物。
82.權(quán)利要求81的方法，其中通過其對行為的作用而鑒定所述化合物。
83.權(quán)利要求81的方法，其中通過其對味覺受體細胞的作用而鑒定所述化合物。
84.權(quán)利要求81的方法，其中所述非人動物是小鼠、大鼠、蠕蟲、魚或昆蟲。
85.權(quán)利要求44的方法，其中通過其對表達所述受體的酵母細胞的作用而鑒定所述化合物。
86.權(quán)利要求44的方法，其中從化合物組合文庫中鑒定所述化合物。
87.權(quán)利要求44的方法，其中從肽文庫中鑒定所述化合物。
88.權(quán)利要求44的方法，其中從小分子隨機文庫中鑒定所述化合物。
89.利用權(quán)利要求44鑒定的化合物改變動物味覺的方法。
90.權(quán)利要求89的方法，其中所述味覺是鮮味覺。
91.權(quán)利要求89的方法，其中所述味覺是甜味覺。
92.權(quán)利要求89的方法，其中所述動物是人、狗、貓、魚、牛、羊或豬。
93.權(quán)利要求89的方法，其中所述化合物配制于食物、飲料或口服藥物組合物中。
94.定量各個化合物、或食物、或飲料組合物的味道的方法，其使用權(quán)利要求1-7和/或21-27的一種或多種受體。
95.穩(wěn)定表達由至少一種T1R1多肽或所述T1R1多肽的變體、片段、或嵌合體和/或至少一種T1R3多肽或所述T1R3多肽的變體、片段、或嵌合體組成的受體的細胞，其中所述受體可特異性結(jié)合鮮味覺刺激物和/或由其活化。
96.權(quán)利要求95的細胞，其選自HEK293、COS和CHO細胞以及非洲爪蟾卵母細胞。
97.權(quán)利要求95的細胞，其中所述T1R1和T1R3來自于相同物種。
98.權(quán)利要求95的細胞，其中所述T1R1和T1R3來源于不同物種。
99.權(quán)利要求95的細胞，其中所述T1R1和/或T1R3來源于哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物或鳥類。
100.權(quán)利要求95的細胞，其中所述T1R1和T1R3選自hT1R1、hT1R3、mT1R1、mT1R3、rT1R1和rT1R3；或其片段、變體或嵌合體。
101.權(quán)利要求95的細胞，是穩(wěn)定表達Gα15的HEK-293細胞。
102.包含權(quán)利要求95的細胞的組合物。
103.包含權(quán)利要求96的細胞的組合物。
104.包含權(quán)利要求97的細胞的組合物。
105.包含權(quán)利要求98的細胞的組合物。
106.包含權(quán)利要求99的細胞的組合物。
107.包含權(quán)利要求100的細胞的組合物。
108.包含權(quán)利要求101的細胞的組合物。
109.穩(wěn)定表達由至少一種T1R2多肽或所述T1R2多肽的變體、片段、或嵌合體和/或至少一種T1R3多肽或所述T1R3多肽的變體、片段、或嵌合體組成的受體的細胞，其中所述受體可特異性結(jié)合甜味覺刺激物和/或由其活化。
110.權(quán)利要求109的細胞，其選自HEK293、COS和CHO細胞以及非洲爪蟾卵母細胞。
111.權(quán)利要求109的細胞，其中所述T1R2和T1R3來自于相同物種。
112.權(quán)利要求109的細胞，其中所述T1R2和T1R3來源于不同物種。
113.權(quán)利要求109的細胞，其中所述T1R2和/或T1R3來源于哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物或鳥類。
114.權(quán)利要求109的細胞，其中所述T1R2和T1R3選自hT1R2、hT1R3、mT1R2、mT1R3、rT1R2和rT1R3；或其片段、變體或嵌合體。
115.權(quán)利要求109的細胞，其穩(wěn)定表達hT1R2、hT1R3和Gα15。
116.鑒定可調(diào)節(jié)味覺感受的化合物的方法，其通過鑒定可結(jié)合、活化、抑制和/或調(diào)節(jié)受體的化合物而鑒定，其中由穩(wěn)定表達至少一種T1 R的細胞表達該受體。
117.權(quán)利要求116的方法，其中所述細胞結(jié)合于固相。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述細胞處于溶液中。
119.權(quán)利要求117的方法，其中使用受體結(jié)合分析方法鑒定所述化合物。
120.權(quán)利要求116的方法，其中所述細胞是權(quán)利要求95-101或109-115中任一項的細胞。
121.權(quán)利要求116的方法，其中使用基于受體活性的分析方法鑒定所述化合物。
122.權(quán)利要求116的方法，其中所述T1R受體表達于細胞中。
123.權(quán)利要求116的方法，其中所述細胞是HEK-293、COS或CHO細胞。
124.權(quán)利要求116的方法，其中通過其對所述細胞內(nèi)化受體的作用而鑒定所述化合物。
125.權(quán)利要求116的方法，其中通過其對受體磷酸化的作用而鑒定所述化合物。
126.權(quán)利要求116的方法，其中通過其對抑制蛋白易位的作用而鑒定所述化合物。
127.權(quán)利要求116的方法，其使用針對第二信使的分析方法。
128.權(quán)利要求127的方法，其中所述第二信使是cAMP或IP3。
129.權(quán)利要求116的方法，其使用電壓敏感性或鈣敏感性染料。
130.權(quán)利要求116的方法，其中所述細胞表達至少一種G蛋白。
131.權(quán)利要求130的方法，其中所述G蛋白是混棲G蛋白。
132.權(quán)利要求131的方法，其中所述混棲G蛋白是Gα15或Gα16。
133.權(quán)利要求116的方法，其中使用病毒性啟動子穩(wěn)定表達所述受體。
134.權(quán)利要求116的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
135.權(quán)利要求116的方法，其中通過其對所述受體活化G蛋白的作用而鑒定所述化合物。
136.權(quán)利要求116的方法，其中通過其對受體構(gòu)象的作用而鑒定所述化合物。
137.權(quán)利要求136的方法，其中通過對蛋白水解的敏感性變化而檢測所述構(gòu)象變化。
138.權(quán)利要求136的方法，其中通過NMR光譜學(xué)檢測所述構(gòu)象變化。
139.權(quán)利要求136的方法，其中通過熒光光譜學(xué)檢測所述構(gòu)象變化。
140.權(quán)利要求136的方法，其中通過其對所述穩(wěn)定表達的受體與放射性或熒光標記的配體結(jié)合的作用而鑒定所述化合物。
141.權(quán)利要求140的方法，其中利用熒光偏振或FRET分析來測定所述標記化合物的移位。
142.權(quán)利要求116的方法，其是高通量篩選分析方法。
143.權(quán)利要求116的方法，其中受體活性與報告基因相關(guān)聯(lián)。
144.權(quán)利要求143的方法，其中所述報告基因是螢光素酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或β-內(nèi)酰胺酶。
145.權(quán)利要求140的方法，其中所述受體是組成型活性變體。
146.權(quán)利要求140的方法，其中所述受體的表達位于組成型啟動子控制之下。
147.權(quán)利要求140的方法，其中所述受體的表達位于調(diào)節(jié)型啟動子控制之下。
148.權(quán)利要求140的方法，其中所述受體與可促進表面表達的肽融合。
149.權(quán)利要求140的方法，其中所述肽是PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用肽。
150.權(quán)利要求140的方法，其中根據(jù)所述受體的X射線晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測所述化合物對該受體的作用。
151.權(quán)利要求116的方法，其中通過其對表達所述受體的酵母細胞的作用而鑒定所述化合物。
152.權(quán)利要求116的方法，其中從化合物組合文庫中鑒定所述化合物。
153.權(quán)利要求116的方法，其中從肽文庫中鑒定所述化合物。
154.權(quán)利要求116的方法，其中從小分子隨機文庫中鑒定所述化合物。
155.利用權(quán)利要求116鑒定的化合物改變動物味覺的方法。
156.權(quán)利要求155的方法，其中所述味覺是鮮味覺。
157.權(quán)利要求155的方法，其中所述味覺是甜味覺。
158.權(quán)利要求155的方法，其中所述動物是人、狗、貓、魚、牛、羊或豬。
159.權(quán)利要求155的方法，其中所述化合物配制于食物、飲料或口服藥物組合物中。
160.定量各個化合物、或食物、或飲料組合物的味道的方法，其使用穩(wěn)定表達編碼權(quán)利要求1-7和/或15-21之一的至少一種T1R的異源核酸序列的細胞。
161.誘導(dǎo)型表達人T1R1/T1R3鮮味覺受體或T1R2/T1R3甜味覺受體的細胞系。
162.權(quán)利要求161的細胞系，其中該細胞系是CHO、COS、HEK或BHK細胞系。
163.權(quán)利要求162的細胞系，其是HEK-293細胞系。
164.權(quán)利要求161的細胞系，其表達G蛋白。
165.權(quán)利要求164的細胞系，其中所述G蛋白是Gα15或Gα16。
166.權(quán)利要求161的細胞系，其穩(wěn)定表達所述T1R1/T1R3受體。
167.權(quán)利要求161的細胞系，其中由GeneSwitch蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達。
168.使用權(quán)利要求161的細胞系鑒定可激動或拮抗T1R1/T1R3受體或T1R2/T1R3受體的化合物的方法。
169.權(quán)利要求168的方法，是結(jié)合分析方法。
170.權(quán)利要求168的方法，是高通量篩選分析方法。
171.權(quán)利要求168的方法，是熒光分析方法。
172.權(quán)利要求168的方法，其篩選可與L-谷氨酸或L-天冬氨酸競爭結(jié)合T1R1/T1R3鮮味覺受體的化合物。
173.權(quán)利要求168的方法，其是使用自動化熒光成像儀的高通量篩選分析方法。
174.權(quán)利要求168的方法，用于在化合物文庫中篩選可增強或調(diào)節(jié)L-谷氨酸活化T1R1/T1R3鮮味覺受體活性的化合物。
175.權(quán)利要求168的方法，用于在化合物文庫中篩選可激動或拮抗T1R2/T1R3甜味覺受體的化合物。
176.權(quán)利要求168的方法，其篩選可與IMP、GMP或其類似物競爭結(jié)合T1R1/T1R3鮮味覺受體的化合物。
177.權(quán)利要求168的方法，用于在化合物文庫中篩選可模擬IMP、GMP或其類似物增強T1R1/T1R3激動劑活性的活性的化合物。
178.權(quán)利要求168的方法，用于在化合物文庫中篩選可增強或調(diào)節(jié)甜味劑活化T1R2/T1R3甜味覺受體活性的化合物。
179.抑制T1R1/T1R3鮮味覺受體的方法，其包含所述受體與同時抑制T1R1/T1R3甜味覺受體和T1R2/T1R3味覺受體的甜味覺抑制劑相接觸。
180.權(quán)利要求179的方法，其中所述抑制劑是拉克替醇。
181.鑒定可調(diào)節(jié)T1R1/T1R3鮮味覺受體的化合物的方法，通過篩選可與拉克替醇競爭結(jié)合和/或抑制T1R1/T1R3鮮味覺受體的化合物而鑒定。
182.權(quán)利要求179的方法，是基于細胞的分析方法。
183.權(quán)利要求182的方法，其中所述分析方法使用共表達T1R1和T1R3的細胞系。
184.權(quán)利要求183的方法，其中所述細胞系是HEK-Gα15細胞系。
185.權(quán)利要求183的方法，其中所述細胞系穩(wěn)定表達所述受體。
186.權(quán)利要求183的方法，其中所述細胞系瞬時表達所述受體。
187.權(quán)利要求186的方法，其中所述G蛋白是Gα15或Gα16。
188.權(quán)利要求181的方法，是基于細胞的分析方法。
189.權(quán)利要求188的方法，其中所述分析方法使用共表達T1R1和T1R3的細胞系。
190.權(quán)利要求189的方法，其中所述細胞系是HEK-Gα15所述細胞系。
191.權(quán)利要求189的方法，其中所述細胞系穩(wěn)定表達所述受體。
192.權(quán)利要求191的方法，其中所述細胞系瞬時表達所述受體。
193.權(quán)利要求192的方法，其中所述G蛋白是Gα15或Gα16。
全文摘要
本發(fā)明涉及T1R受體裝配形成功能性味覺受體的發(fā)現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)共表達T1R1和T1R3可產(chǎn)生響應(yīng)鮮味刺激物(包括谷氨酸一鈉)的味覺受體。還發(fā)現(xiàn)共表達T1R2和T1R3受體可產(chǎn)生響應(yīng)甜味刺激物(包括天然存在的以及人造的甜味劑)的味覺受體。本發(fā)明還涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的異寡聚味覺受體在分析中的用途，用于鑒定分別響應(yīng)鮮味刺激物和甜味刺激物的化合物。本發(fā)明另外涉及構(gòu)建在組成型或誘導(dǎo)型條件下穩(wěn)定或瞬時共表達T1R1和T1R3、或T1R2和T1R3組合的細胞系。本發(fā)明還提供了這些細胞系在基于細胞的分析、特別是利用熒光成像檢測受體活性的高通量篩選分析中的用途，用于鑒定鮮味和甜味調(diào)節(jié)劑化合物。最后，本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即某些化合物，例如拉克替醇(lactisole)，抑制人T1R2/T1R3和T1R1/T1R3受體活性，從而抑制甜味和鮮味覺，提示這些受體可能是唯一的甜味和鮮味受體。
文檔編號G01N33/50GK1520516SQ02812830
公開日2004年8月11日 申請日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月26日
發(fā)明者M·T·佐勒, 李曉東, L·斯塔謝夫斯基, S·奧康奈爾, S·佐祖利亞, J·E·阿德勒, 徐紅, F·埃切韋里, M T 佐勒, 形だ, 環(huán)蛩夠, 的味, 胬 , 阿德勒 申請人:塞諾米克斯公司