專利名稱：可溶性病毒特異性t細胞受體組合物的制作方法
可溶性病毒特異性T細胞受體組合物
發(fā)明的
背景技術：
病毒感染，例如人類免疫缺陷病毒(HIV)諸如HIV-I的感 染以及丙型肝炎病毒(HCV)的感染，是一項重大的公共健康問 題。有許多種藥物目前4皮用來治療感染了這類病毒感染的個體， 例如，包括逆轉錄酶(RT)抑制劑以及蛋白酶(PI)抑制劑在內 的抗逆轉錄病毒藥物。盡管這些試劑對于HIV (人類免疫缺陷病 毒)感染的治療是有效的，對藥物抗性品系以及病毒的蓄積藥物 毒性的研究發(fā)展仍然是一個受關注的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明描述了用于i貪斷以及治療病毒感染的方法以及纟且合 物。所述的方法是以對來自于細"包毒性T細力包克隆的T細"包受體 基因序列的識別為基礎的，其中所述的T細月包受體基因序列對 HIV-I (人類免疫缺陷病毒-I)或者HCV (丙型肝炎病毒)具有 特異性。因此，本發(fā)明包括分離的T細胞受體基因以及由該基因 編碼的多肽，其編碼可溶性T細胞受體多肽或者蛋白，其中所述 的受體多肽或者蛋白能夠與HIV-I或者HCV以及由該基因編碼 的多肽之上的細胞毒性T細胞表位發(fā)生特異性的結合。
上述表位包括一種短的、8至11個肽，或者由一種短的8至 11個肽組成，其中所述的肽依靠一種細月包表面與I類主要組織相 容性復合體(MHC )抗原相連4妄，其中所述的I類主要組織相容性復合體是例如HLA (人類白細月包抗原)分子。所述的表位包括 與天然產生的HIV蛋白或者HCV蛋白相一致的多肽序列，或者 包括來自于天然產生的HIV蛋白或者HCV蛋白的多肽序列。
所述的T細月包受體基因既編碼T細月包受體的a鏈，也編碼T 細胞受體的P鏈。所述的T細胞受體oc4連以及T細胞受體的|3鏈 均包括一種恒定區(qū)(C區(qū))， 一種可變區(qū)(V區(qū))以及一種互補 決定區(qū)3(CDR3)區(qū)域，或者由上述三個區(qū)域構成。所述的CDR3 區(qū)域介導抗原肽/主要組織相容性復合體I類復合體間的相互反 應，由一種1至90個核香的隨4幾序列組成，其中所述的隨4幾序 列是由體細月包重組而產生的。這些基因序列#:用來構建重組 HIV-I或者HCV-特異性可溶性T細胞受體分子，所述的T細月包 受體分子被用來進行體外i貪斷以及體內治療。例如，這些可溶性
T細胞受體可以作為著色劑，用來在體外試-驗中對患者來源的組 織樣本或者體液樣本呈現出的HIV-I或者HCV細胞毒性T細胞 表位進行4企測。可以任選的，所述的可溶性T細胞受體多肽可以 與 一種可4企測的標記物相連接，所述的可才全測的標記物是例如熒 光分子。所述的可4企測的標記物與所述的受體多肽相連4妄或者相 共扼，從而促進了診斷。而且，大量的可溶性單鏈I類HLA (人 類白細胞抗原)限制的T細胞受體多肽被固定于固體載體之上， 所述的固體載體是例如木片或者平板。例如，將所述的T細胞受 體以 一種樣i:陣列的形式進4亍構建，用于對過程中的病毒表位進4亍 識別以及檢測。對于治療目的而言，將細胞毒性分子或者細胞因 子連4妻或者結合至所述的T細月包受體(TCR)上。
優(yōu)選的可溶性T細胞受體構建包括下列與T細胞受體a、 (3 鏈對相一致的序列Vb序歹'J CASSQGVTLLN (序歹。4 )以及Va5 序列CAETY (序列6 )。在I類人類白細胞抗原(HLA )分子A2 中這種可溶性T細胞受體具有序列5 (HIV-Ivpr:人類免疫缺陷
7病毒j病毒蛋白)的表位特異性。上述T細胞受體序列的衍生物 同樣被包含在本發(fā)明的范圍之內。衍生的T細胞受體的特征是對 I類人類白細胞抗原限制性表位具有更高的結合親和性，在下文 的表l中所示。例如， 一種矛;于生的可、溶性T細月包受體構建體相對 于參考序列4以及參考序列6而言，可能包4舌1、 2、 3、 4或者 更多個保守的或者非保守的氨基酸取代基，并且與含有上述初始 參考序列的構建體相比，其具有增加了的表位結合親和性的特 征。 一種優(yōu)選的具有丙型肝炎病毒(HCV)表位結合特異性的可 溶性T細胞受體構建體包括下列與T細胞受體a、 P鏈對相一致 的序列Va序歹'J CAVNEYGQNFV (序歹'J 27 )以及Vb序列 CAWSGGLNTEAF (序列29 )。這種可溶性T細胞受體構建體具 有序列28的表位結合特異性，其為一種HCV肽，同樣存在于I 類HLA分子A2中。上述T細胞受體序列以及其他T細胞受體 序列以及它們的結合特異性和HLA限制性在表1中所示。
"基本上是純的"指的是已經從天然伴隨其存在的組分中分 離出來的核酸、多肽或者其他分子。典型的，當多肽具有的至少 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、或者甚至99%重量的部分是不含 蛋白質以及與其天然相結合的天然產生的有才幾分子時，則所述的 多肽在基本上是純的。例如，可以通過下述方法來獲得一種本質 上純的多肽乂人天然來源中進行分離，在細l包中進行重組核酸的 表達，其中所述的細胞在正常情況下不對所述蛋白進行表達，或 者通過化學合成的方法。 一種蛋白分離片段指的是具有所述參考 蛋白的序列的一部分的肽，其中所述的序列比全部序列短，并且 不含有天然產生的側翼區(qū)。 一種分離的多肽缺少一個或者多個氨 基酸，其中所述的氨基酸是所述天然產生的分子中的參考片段的 側翼。當一個具體的多肽分子或者核酸分子祐:i人為與一種^皮定義了長度的參考多肽分子或者參考核酸分子具有特定的同 一性百分數時，則所述的同 一 性百分數是相對于所述的參考多肽分子或者參考核酸分子而言的。因此，當一種肽與具有100個氨基酸長度的參考多肽具有50%的同一性時，則所述的肽可以是一種具有50個氨基酸的多肽，所述的50個氨基酸與所述參考多肽的50個氨基酸長度的部分是完全相同的。它也可能是一種具有100個氨基酸長度的多肽，其中有50%的氨基酸在其完整的長度內與所述參考多肽是相同的。同樣的規(guī)則也適用于核酸分子。
對于多肽而言，所述參考多肽序列的長度將通常為至少5個氨基酸的長度。例如，所述的肽具有5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、12個氨基酸的長度。在某些情況中，所述的肽更大一些，例如，15、 20、 25個氨基酸或者更長的長度。例如， 一個特定序列例如表位序列的肽的側翼是其他氨基酸，其中所述的氨基酸與天然產生的蛋白中的序列的側翼上的氨基酸不同。對于核酸而言，所述參考核酸序列的長度將通常為至少15、20或者25個核酸的長度。然而，具有更大的構建體，例如那些具有至少50個核苷、優(yōu)選具有至少60個核普、更優(yōu)選具有至少75個核苷、以及最優(yōu)選具有100個核苷或者300個核普的構建體。
本發(fā)明還包4舌才艮據T細胞受體序列或者表位序列而產生的布f生肽。在與參考序列具有小于100%同一性的多肽序列的情況中，在不相同的位置處優(yōu)選但不是必須的存在針對所述參考序列的保守性取代基。保守性取代基通常包括具有下述基團的取代基甘氨酸以及丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，以及亮氨酸；天冬氨酸以及谷氨酸；天冬酰胺以及谷酰胺；絲氨酸以及蘇氨酸；賴氨酸以及4青氨酸；以及苯丙氨酸以及酪氨酸。在相對于所述參考序列而言具有氨基酸耳又代基的肽中，所述T細胞受體對其HLA限制性表位的結合親和性增加了 ?；蛘撸袝谏蛄械臉嫿w具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性，例如，在生理可接受性溶液中具有更長的半衰期，其中所述的生理可^妄受性溶液是例如培養(yǎng)基或者體液，并且其中所述的體液是例如血液，血漿或者血清。例如，相對于所述參考
肽序列而言，這類4汙生肽的結合親和性和/或穩(wěn)、定性為至少5%、10%、 25%、 50%、 75%、 90%、 100%、 2倍、5倍、10倍、20倍或者更高。可以任選的，衍生的肽序列包括其他的氨基酸，其中所述的氨基酸在所述參考序列的側翼上，位于所述序列的氨基末端和/或羧基末端。如上所述，這類含有非天然產生的側翼序列的構建體的特4正是具有增加了的表位結合親和性和/或增加了的內。
一種分離的或者純化的核酸分子是從5，編碼序列以及3，編碼序列或者非編碼序列中分離出來的，在有才幾體天然產生的基因組中，它們之間是直4妻才目々卩的(immediately contiguous )。分離的4亥酸分子包4舌那些不是天然產生的核酸分子，例如，由重組DNA技術生成的核酸分子。這里所識別的核酸包括那些與參考序列具有至少85%、 90%、 95%、 98%、 99%的同一't"生的序列，以及參考沖亥f復序列的退4匕變體(degenerate variants )。
通過下文對于優(yōu)選實施方式的描述以及4又利要求，本領域才支術人員可以明顯看出本發(fā)明的其他特征以及優(yōu)點。這里所引用的參考文獻的全部內容在此引入作為參考。
具體實施例方式
HIV-I或者HCV特異性細胞精確的識別I類MHC (主要組織相容性復合體)限制的細胞毒性T細胞表位，并通過有限稀釋克隆的方法對其進4亍分離。 -使用MHC (主要組織相容性復合體)I類四聚體對克隆細胞進行染色，其中所述的MHCI類四聚體與各自的表位肽發(fā)生了折疊，并且使用 一種FACS ARIA (流式細胞分選4義)4義器對四聚體結合細月包進行分選。分離儲存細胞的mRNA,利用巢式PCR (聚合酶鏈式反應)對所述T細胞受體基因的逆轉錄體以及cDNA進行擴增。使PCR產物與克隆載體發(fā)生結合，用來轉化E.coli (大腸桿菌)。在細菌擴增之后，利用標準操作對插入的載體進行純化和測序。下述T細胞受體的序列4皮i。、別出來。
表1: T細胞受體序列
T細胞受體(a (a), P (b)鏈對)表位特異性限制的I類 HLA(人類白 細胞抗原)的 類型
Vb27-CASSLGQGLANYGYT-Jl .2 序列1 Va3-CAVRDLTGNQFY-J49 序列3FL8 (FLKEKGGL) 序列2 HIV-I (nef)B8
Vb 14-C AS SQGVTLLN-J2.1 序列4 Va5-CAETY-J36 序列6AL9(A腿LQQL) 序列5 HIV-I ( vpr)A2
Vbl9-CASSIDGASNQPQH-J1.5 序列7 Val 3.2-CAENSDAGGTSYGKLT-J52 序列9SL9(SLYNTVATL) 序歹'J 8 HIV-I ( gag)A2
Vb 15-CATSRGAGSNTGELF-J2.2 序列10 Val 2.2-CAVRGSGTYKYI-J40 序列11FL8 (FLKEKGGL) 序列2 HIV-I (nef)B8
Val 9-CALSGNHSGGATNKLI-J32 序列12 Vb4.3-CASSPWTGGGQPQH-Jl .5 序列14TW10(TSTLQEQIGW) 序列13 HIV-I ( gag)B57
Va5-CAASGGY()KVTFGTGTKLQVIP 序列15 Vb 19-CASTGTYGYT-J1.2 序列16KF11(KAFSPEVIPMF) 序列17 HIV-I ( gag)B57
Val2.3-CAMSAQQAGTALI-J15 序列18 Vbl 1.2-CASSLVIMSEQY-J2.7 序列20SL9(SEGATPQDL) 序列19 HIV-I ( gag)B60
11Val 3.1-CAATSGYALN-J41 序列21 Vb9-CASSVQGEFREKLF-Jl .4 序列23E18(EIYKRWI1) 序列22 HIV-I ( gag)B8
Va27-CAGRDYKLS-J20 序列24 Vb20.1 -CS ARGDNPNTE AF陽J1.1 序列26KL9(KEKGGLEGL) 序列25 HIV-I (nef)B60
Va8.1-CAVNEYGQNFV-J26 序列27 Vb30-CAWSGGLNTEAF-Jl 1 序列29AL9(ALYDWTKL) 序列28 (HCV)A2
Vb27-CASSVRTGELF-J2.2 序列30 Va29-CAASFTQNGLT-J45 序列32QKl O(QVPLRPMTYK) 岸列31 HIV-I ( nef)A3以及All
Vb9-CASSERDSQYQETQY-J2.5 序列33 Va29-CAASFTQNGLT-J45 序列34QKl O(QVPLRPMTYK) 岸歹'j 31 HIV-I ( nef)A3以及All
VM4-CASSPVLYEQY-J2.7 序列35 Va39-CAVVAQGGSEKLV-J57 序列36QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I (nef)A3以及All
Vb9-CASSARAFPEGNQPQH-Jl .5 序列37 Va3 9-CAVVAQGGSEKLV-J57 序列38QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I (nef)A3以及All
Vb 10.2-C AS SETNRVMEAF陽J1.1 序列39 Va8.6-CAVSDPGFKTI-J9 序列40QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I ( nef)A3
Vb24-CATSAGRQRDTGELF-J2.2 序列41 Va8.6-CAVSDPGFKTI-J9 序列42QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I (nef)A3
Vb25.1-CASSNGYEQY-J2.7 序列43 Va38.2-CAYRSDNDMR-J43 序列44KV10(KLVALGINAV) 序列45 (HCV)A2
Vb24.1 -CATSSQDGQVYEQY-J2.7 序列46 Va24-C AS YKAAGNKLT-J17 序列47GT9(GPRLGVRAT) 序列48 (HCV)B7
Vb7.9-CASSSPKDPSNQPQH-Jl .5 序列82 Va5-CAEDPTSSSGYALN-J4 序列84KKIO(KRWIILGLNK) 序列83 (HIV-I gag)B27
12表2:編碼T細"包受體的核香酸序列HCV-A2-KV10 ( KLVALGINAV )Vb25.1-CASSNGYEQY-J2.7 (序列43)
NNN麗NNNGNNNNNNNTCGCCCTT麗CAGTGGTTCAACGC
ATAGNNNNTTTCCTNN (序列49)Va38.2-CAYRSDNDMR-J43 (序列44)NN麗NTTTCNNNN (序列50 ) HCV畫B7-GT9 ( GPRLGVRAT )(序歹'j 48 ) Vb24.1國CATSSQDGQVYEQY畫J2.7 (序列46)
CTGAGC TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTNNNTTNNNNG麗 (序列51 )Va24-CASYKAAGNKLT畫J17 (序列47)
NNNNN麗N麗麗NCNNCNAATTCGCCCTTANGCAGTGGTAT
NNT麗TNN麗麗(序列52 ) HCV A2國AL9
Va8.1隱CAVNEYGQNFV國J26 (序列27)
N麗麗NNNNNG麗NNCN麗TCNCCCTTATACNCATCAGAAT
15GCNNNACTAGTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTCTGAGCTTGG NGTAATCATGG TCNNNN麗TGTTTTCCNGN (序歹'J 53)
HCV A2畫AL9
Vb30畫CAWSGGLNTEAF-J1.1 (序歹寸29)TTCACTGGC麗麗C麗TTTTAN (序歹'J 54) B8-EI8
Val3.1-CAATSGYALN-J41 (序列21 )
NN麗NNNNNNN麗CGCCCTTATACACATCAGAATCCTTACT
ATTACAATTCACTGGCN TNCCNTTTTTAN (序歹'J 55) B8-EI8
Vb9-CASSVQGEFREKXF-J1.4 (序歹'J 23)
NN麗NNNNNNNNNNNNCGCCCTTGGTGTGGGANANCTCTGTGGCAGGATCTCTAGCTTGGGGCTGGTGTCTCTGTAGTAAG
GTAT TACAATTCACTGGCCNNN麗TTTTTACANN麗(序列 56)
B60-KL9
Va27-CAGRDYKLS-J20 (序歹ll 24)CACTGGCN麗NNNNTTTTANN (序列57) B60匿KL9
Vb20.1-CSARGDNPNTEAF-Jl.l (序列26)
NN麗N麗GGN麗CNNANTCGCCCTTANGCAGTGGTATCAA CGGGAGAGAAGGTGGTGTGAGGCCATCACGGAAGATGCTG
ACCAAGGGCGAAT[Gamma]CGTTTAAACCTGCAGGACTAGT CATANNNN麗TTTCCTNN (序歹'J 58) A2-AL9 a鏈 Va5畫CAETY-J36 (序歹'J 6)NNNNN麗TTTN麗麗(序列59 )
A2畫AL9 M連Vbl4-CASSQGVTLLN國J2.1 (序歹'J 4 )
NNNN麗NNNNNNNNNCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCTGCTAGT GAGTCGTATTACAATTCACTGGCN (序列60 ) B8隱FL8 a鏈Val2.2-CAVRGSGTYKYI陽J40 (序列11)
N麗NNNNNNTTNNNNNNN (序歹'J 61 )
B8-FL8 |3鏈Vbl5-CATSRGAGSNTGELF誦J2.2 (序列10 )AATTCTGAGCTTGGCGTANTCATGGNNNNNNNNNTNTTTNC NNGN (序歹'J 62 )
A2-SL9: Val3.2畫CAENSDAGGTSYGKLT國J52 (序歹'J 9)
CGTATCATGTNNNNNN (序列63 )
A2-SL9: Vbl9畫CASSIDGASNQPQH畫J1.5 (序歹'J 7)
22麗N麗NNNGNNNNCNANTTCGCCCTTCCCTTTGCACTATGA
AATTCTGAGCTTGGCGTAATCATGTCATA NNNNNTTNNNNN (序列64 )
B8-FL8: Vb27-CASSLGQGLANYGYT畫J1.2 (序歹'J 1)
GANACNNCTGNNN (序歹'J 65)B8畫FL8: Va3-CAVRDLTGNQFY-J49 (序歹'J 3)GACCCCCC麗NN麗CGCCCGCCGNGAGCTTA麗TGGAGCC
TCACAGGGGATAACCTGGTTAAAGGCAGCTATGGCTTTGAA
GTCACAAANNNNN (序列66 )B57-TW10
Val9國CALSGNHSGGATNKLI國J32 (序歹寸12)AATTCTGANCTNGNCGNNATCNNNNNNNAfNNNNNNNNAAAAIN麗NNNN (序歹ij 67)
B57-TW10
Vb4.3-CASSPWTGGGQPQH畫J1.5 (序歹'J 14)
TAGNNNNGT TTCCNGA (序列68 )B56-KF11
Va5誦CAASGGYQKVTFGTGTKLQVIP (序歹'J 15)麗NNNNNN麗麗NNTCNCCCTT麗NCNGNGGT麗C麗CGC NNAGNANNCGGGGGAAGANATACTTGNNNNTATNGCTCTCT TGGCTGGAGATTGCAGGTCCCAGTGGGGAGAACAATGAAG
GTAATCNTGGNNNNNNCNNNNNNTTTNCCNGNNNNN (序列 69)
B57-KF11
Vbl9-CASTGTYGYT-JL2 (序歹'J 16)
NN麗麗N麗CNC麗ANTCGCCCTTAAGCAGTGGTATCAACCTGAGCTTGGCGTANTCATGGTCNNN麗NTNNNTTNCCNGN N (序列70)
B60-SL9
Val2.3-CAMSAQQAGTALI-J15 (序列18)AATTCTGAGCTTGGCGNNATC麗N麗NAAN麗TNTTTTNNN NNNNNN (序歹'J 71 )
B60-SL9 Vbll.2
Vbll.2-CASSLVIMSEQY-J2.7 (序歹'J 20)
麗NNN麗NGNNNCN麗TCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCT
麗NNN麗TTTNCCNNNN (序列72 ) A3/A11 QK10
Vb27畫CASSVRTGELF-J2.2 (序歹'J 30)
NN麗麗NNNNNANTCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCTGCTGAGAGGTCTGGTTGGGGCTCGGCGACTCCAGGATCAGGGG
TTTANNN (序歹'J 73)
Vb9-CASSERDSQYQETQY畫J2.5 (序列33)
NNNNNNNNNN麗NTCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCTGCT
TGGCCGNNCGTTTTANAN (序列74 ) Va29-CAASFTQNGLT-J45 (序歹'J 34)
29CAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCAC TGNNN麗CNN麗TTT麗(序列75 )
A3/A11 QK10
Vbl4-CASSPVLYEQY-J2.7 (序歹'j 35)
TTT麗NN (序列76 )
Vb9畫CASSARAFPEGNQPQH-J1.5 (序歹'J 37)TCCATTATAATAGTGAATGAGGAACTGGAGGCCCTGGTCCA
CAATTCACTGGCCGTCGTTTTANAN (序列77) Va39-CAVVAQGGSEKLV-J57 (序列38)
NNNNNTNNNNNNNATTCGCCCTTGGTGTGGGANANCTCTGC
CAATTCACTGGCCGTCGTTTTANAN (序歹'J 78) A3 QK10
Vbl0.2-CASSETNRVMEAF-Jl.l (序列39)ATCGGGGACTTCTCCTTTATCTGTAATATCAGCAGCTGCTGA
GTCGTTTTACN (序歹'J 79 ) Vb24-CATSAGRQRDTGELF國J2.2 (序歹'J 41 ) NNNN麗NNNNNNTCGCCCTTGGTGTGGGANNNCTCTGCTT
TGGCCGTCGTTTTANNN (序歹'J 80) Va8.6-CAVSDPGFKTI畫J9 (序歹'J 40)AGGGACTTGGCTGTCAAGCTGGGTCACAGGCTGGGCTCTG
CTGGCNN (序列81 ) B27-KK10
Va5-CAEDPTSSSGYALN-J4 (序列84)
N (序歹'J 85 )Vb7.9-CASSSPKDPSNQPQH畫J1.5 (序歹'J 82)
N麗NNNNNNNNNGCN麗TCGCCCTTNAGCAGTGGTATCAA
NNNNNNNN (序歹'J 86 )
病原體特異性可溶性T細胞受體構建體
對于體內免疫治療途徑而言，能夠特異性的識別在感染 HIV-I的細胞的表面上結合有MHC (主要組織相容性復合體)I 類分子的HIV-I細胞毒性T細胞表位的分子化合物是一種有力的 工具，它可以直接命中感染細胞。而且，這些化合物#1用來在自 然感染的過程中對淋巴細胞或者專職抗原呈遞細胞上呈現出的 HIV-I抗原進行-珍斷性的體外評估。能夠特異性的與同源MHC 復合體發(fā)生結合的可溶性單鏈a/(3 T細胞受體構建體代表的是 能夠對HIV-I感染細月包進4亍直4妻體外命中或者體內命中的最有希 望的分子?？扇苄訲細"包受體的氨基酸序列對特異性病原體的識別是以天然產生的T細胞受體的序列為基礎的。在本發(fā)明公開之 前，對于具有HIV-I表位或者HCV表位特異性的天然產生的T 細月包受體的T細月包受體序列而言，〗又有非常有限的^f言息可以利 用。本發(fā)明描述的數據闡明了 HIV-I或者HCV特異性T細胞受 體基因的序列，所述的序列可以用于進4亍可;容性T細l包受體的構 建，用于i貪斷和治療的用途。
目前，可以利用重組HIV-I特異性抗體進4亍HIV-I感染細胞 的直接命中。所述的抗體途徑的一個缺點在于，HIV-I抗體僅僅 能才妾觸到HIV-I病毒的包膜，而官能上最重要的HIV蛋白隱藏在 包膜之內，并且只能在由MHC I類分子或者II類分子進4亍月包內 加工和呈遞之后與免疫系統(tǒng)相接觸。 一旦被MHC分子所呈遞， 這些HIV基因產物會凈皮T細胞受體所識別，而不是一皮抗體所識 別。因此，HIV-I抗體僅僅能夠用于進行非常有限的HIV-I感染 細胞的命中。本發(fā)明描述的組合物提供了 一種解決上述問題的方 法。
對于HIV I或者HCV具有特異性的可;容性T細月包受體與現 有方法相比具有顯著的〗尤點
已經識別出天然產生的HIV-I特異性CD8+ T細月包克隆的T 細胞受體cc鏈以及P《連的完整序列。迄今為止(todate)已經識 別出這些HIV-I或者HCV特異性CD8+ T細l包的T細i包受體序列。
所述的T細月包受體序列能夠有歲支的用于重組單鏈T細月包受體 的生產當中，其中所述的重組單鏈T細胞受體能夠特異性的識別 HIV-I感染細胞。這些重組T細胞受體在實踐中被用來(i)在免 疫治療方法中進行HIV-I感染細胞的體內命中；(ii)對'淋巴細胞 或者專職抗原呈遞細月包中表達的HIV-I抗原進4于體外評估。對HIV-I抗原表達的定量分析對于HIV-I免疫發(fā)病機理的研究而言 是重要的，其對于免疫治療方法的體外監(jiān)測而言也是有效的。
當前，對于HIV-I感染患者的治療是以抗逆壽爭錄病毒類藥物 的使用為基礎的。這些藥物是非常有效的，但是具有蓄積毒性， 同時伴隨著高度的服藥負擔(pill burden)且能夠產生病毒抗性。 因此，對于這些患者而言，其他的治療選擇仍然是一種持續(xù)的需 要。利用可溶性T細胞受體的免疫治療方法代表的是對于HIV-I 或者HCV感染患者人群的一種可供選擇的治療選擇。除此之外， 所述的T細胞受體可以被用來進行HIV-I抗原表達的體外評估。
-沴斷方法
可溶性T細胞受體被用來對呈遞于專職抗原呈遞細胞之上的 細胞毒性T細胞表位的I類HLA介導的呈遞進行分析。例如， 從宿主處獲得一種體液樣本，例如，血液，或者身體組織，例如 淋巴結。將來自于所述樣本中的白細胞與本發(fā)明所述的單鏈T細 月包受體進^f亍-接觸。為了增加靈壽丈性，將四個單《連T細月包受體構建 體連接在一起，例如與一種中心鏈親和素進行連4妄，從而形成一 種四聚物復合體。將所述的構建體與 一種可4t測的標^己物進行連 接，例如使用熒光基團對其進行標記?？蓹z測的標記物包括熒光 染料，例如藻紅蛋白(PE)，異石危氰酸熒光素(FITC)，以及別 藻藍蛋白(APC)。 4企測是通過流式細月包術和/或組織染色(免疫 組織化學)來進行的。在另外一種實施例中，將大量的T細I包受 體構建體固定于一種;f效陣列之上，例如木片或者平才反之上，并且
允許來自于患者的樣本與所述的陣列發(fā)生接觸，對所述的陣列進 行洗滌，并且對結合的細胞進4亍4全測。通過這種方式，測定出患 者的抗原呈遞細月包所表達或者呈遞出的肽。因此，可溶性T細胞^ 受體同樣可以作為一種有效的研究工具，用來對HIV-I或者HCV CTL (細胞毒性T淋巴細胞)表位呈遞進行體外評估以及量化分
36析。它們是有用的工具，用來對表達特異性HIV-I或者HCVCTL 表位的患者進行識別，并且因此成為本發(fā)明描述的免疫治療干涉 法的最有前途的候選物。
治療方5去
為治療感染HCV或者HIV的患者，給他們施用可溶性單鏈 T細月包受體的一種或者多種的混合物。所述的T細胞受體共輒于 另外一種組合物，例如細胞因子，例如白細胞介素-2， Y干擾素， a干擾素或者細胞毒素試劑，例如穿孔素，粒酶或者特異性藥物。 對于HCV的治療而言，將所述的可溶性單鏈HCV特異性T細胞 受體任選的共軛或者連接至干擾素之上，例如a干擾素。這種構 建體的一種優(yōu)點是延長了半衰期，并且增加了這些試劑對于感染 細胞所進行的直接的抗原特異性傳遞。這種治療策略降低了總體 的藥物劑量，給藥頻率，以及與治療相關的副作用。
才艮據目標群體的遺傳特性(例如，特定的HLA類型的發(fā)生 率)對T細胞受體構建體進行選擇。例如，使用可溶性T細胞受 體的集合(pool), "i只另'J全告卩的(a repertoire of)細月包毒小生T細月包 表位，其中所述的細胞毒性T細胞表位受到一種特殊的群體中最 頻繁產生的HLA I類分子的限制。或者，測定一種特定患者的 HLA類型，根據所述患者的HLA類型選擇一種或者多種HLA 特異性T細胞受體進4亍施用。
腸胃外施用，例如靜脈內，皮下，肌肉內，以及腹腔內給藥 途徑，可以用來傳遞可溶性T細胞受體構建體。例如，將可溶性 T細胞受體以每個動物32微克的劑量靜脈注射給小鼠。使用本 領域熟知的方法進4于患者劑量的確定。
37施用本發(fā)明所述的組合物來抑制病毒病原體。對于 一種特定 的情形而言，確定合適的劑量以及纟合藥方案在本領域的才支術范圍
之內。治療性化合物的有效劑量優(yōu)選在大約0.1毫克/千克至大約 150毫克/千克的范圍之內。本領域4支術人員知曉，有效劑量的改 變取決于給藥途徑，賦形劑的使用，以及與其他治療方案的共同 施用，其中所述的其他治療方案包括其他試劑或者治療劑的4吏 用。通過使用標準方法對遭受病毒病原體感染的(或者存在感染 危險的)哺乳動物患者例如人類患者進4亍識別，來實施治療方案。 使用本領域已知的方法將所述的藥物化合物施用給這樣的個體。 優(yōu)選的，所述的化合物通過口服，直腸內，鼻腔內，局部或者腸 胃外的形式施用，其中所述的腸胃外的形式是例如皮下，腹腔內， 革肖內，月幾肉內，以及靜月永內的形式。
其他實施方式
盡管已經對本發(fā)明進行了詳細的描述，前述的描述意在進行 闡述而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是又后附的權利要 求進行定義的。其他的特征，優(yōu)點以及修改在隨后的權利要求的 范圍之內。
權利要求
1. 一種組合物，包括編碼可溶性I類HLA限定的T細胞受體(TCR)多肽的分離的核酸，其中所述的多肽特異性的與HIV或者HCV表位發(fā)生結合。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 括序列4的分離的T細胞受體多肽。
3. 才艮據4又利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 4舌序歹'J 6的分離的T細月包受體多肽。
4. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 括序歹'J 4以及序列6的分離的T細胞受體多肽。
5. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 括序列27的分離的T細月包受體多肽。
6. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 4舌序歹'J 29的分離的T細月包受體多肽。
7. 才艮據4又利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 二括序列27以及序列29的分離的T細月包受體多肽。
8. —種組合物，包4舌一種分離的T細月包受體多肽，其中所述的 多肽與HIV或者HCV表位發(fā)生了特異性的結合。
9. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述的分離的T細胞受 體多肽包4舌序列4。
10. 根據權利要求8所述的組合物， 體多肽包括序列6。
11. 才艮據纟又利要求8所述的組合物， 體多肽包括序列4以及序列6。
12. 根據權利要求8所述的組合物， 體多肽包4舌序列27。
13. 根據權利要求8所述的組合物， 體多肽包括序列29。其中所述的分離的T細萬包受 其中所述的分離的T細月包受 其中所述的分離的T細月包受 其中所述的分離的T細月包受
14. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述的分離的T細胞受 體多肽包4舌序列27以及序列29。
15. 根據權利要求1或者8所述的組合物，其中所述的T細胞受 體多肽與HIV-I表位發(fā)生了結合。
16. 根據權利要求1或者8所述的組合物，其中所述的T細胞受 體多肽與HCV表位發(fā)生了結合。
17. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述的核酸包括一種oc鏈 T細胞受體序列以及一種(3鏈受體序列。
18. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述的T細胞受體多肽 進一 步包括一種可4企測的標記物。
19. 根據權利要求18所述的T細胞受體多肽，其中所述的可檢 測標記物是熒光染泮牛。
20. 根據權利要求8所述的T細胞受體多肽，其中所述的T細胞 受體多肽進一步包括一種細月包毒性組合物。
21. 根據權利要求8所述的T細胞受體多肽，其中所述的T細胞 受體多肽進一步包4舌一種細月包因子。
22. —種組合物，包括大量權利要求8所述的可溶性單鏈I類 HLA限制性T細胞受體多肽，其中所述的多肽是固定于一種 固體支持物之上的，其中所述的大量的T細胞受體多肽中的 每一種都結合了不同的病毒表位。
23. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述的T細胞受體多肽 包括一種oc鏈序列以及一種(3鏈序列，所述的oc鏈序列以及 (3鏈序列均具有至少8個殘基的長度。
24. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述的oc鏈序列以及P 鏈序列均具有8至20個殘基的長度。
25. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述的多肽包括一種如 表l中所示的a《連序列以及l(fā)3鏈序列對。
26. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述的多肽包括一種來 自于表1中所列出的cc鏈序列。
27. 才艮據權利要求8所述的組合物，其中所述的多肽包4舌一種來 自于表1中所列出的P鏈序列。
28. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述的核酸包括一種來 自于表2中所列出的a鏈編碼序列。
29. 根據權利要求2所述的組合物，其中所述的核酸包括一種來 自于表2中所列出的(3鏈編碼序列。
30. —種診斷病毒感染的方法，包括使一種分離的病毒特異性可 溶性T細胞受體構建體與來自于受試宿主的體液或者組織樣 本發(fā)生4妄觸，以及4全測結合的T細月包受體構建物，其中所述 的結合意p未著病毒感染。
31. —種抑制病毒感染的方法，包括:纟合宿主施用一種分離的單鏈 可溶性病毒特異性T細胞受體，所述受體包4舌一種細"包毒性 試劑。
32. 根據權利要求31所述的方法，其中所述的受體與HIV或者 HCV表位發(fā)生了特異性的結合。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于診斷病毒感染的組合物以及方法，以及抑制這類感染的方法。上述方法是以對來自于細胞毒性T細胞克隆的T細胞受體基因序列的識別為基礎的，其中所述的T細胞受體基因序列對HIV-I或者HCV具有特異性。已經識別并且構建成與I類HLA限制的HIV病原體以及HCV病原體相結合的可溶性T細胞受體組合物。
文檔編號C07K4/00GK101490078SQ200780016349
公開日2009年7月22日 申請日期2007年4月5日 優(yōu)先權日2006年4月5日
發(fā)明者B·D·沃克, G·勞爾, M·利施特費爾德, M·阿特費爾德, X·G·于 申請人:通用醫(yī)院有限公司