專利名稱：一種基于抗體抗原法檢測肝纖維化的微型傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于硅微機械及電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種硅微機械加工的基于抗體抗原法檢測肝纖維化的微型傳感器。
背景技術(shù)：
肝纖維化是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程，它是一個慢性漸進性的過程。慢性肝病絕大多數(shù)都有肝纖維化，其中25％-40％最終發(fā)展為肝硬化乃至肝癌。因此，肝纖維化不僅是慢性肝病最重要的病理特征，也是慢性肝炎、肝硬化等進一步發(fā)展、惡化的重要原因。所以及早發(fā)現(xiàn)肝纖維化對肝病患者具有重要意義。
目前采用的診斷方法主要包括影像學(xué)診斷、病理診斷和血清學(xué)診斷三種，其中血清學(xué)診斷因取材方便，價格低廉，并可早期診斷成為目前應(yīng)用最為廣泛的方法?？贵w抗原法是血清診斷法中最重要的方法之一。
抗原和抗體的結(jié)合具有高度的特異性和靈敏性，基于這種原理的傳統(tǒng)方法制作的傳感器一般要求有較大的樣品量(血清)，且一次性使用成本過高，循環(huán)使用可能交叉污染使檢測結(jié)果不可靠。因而如何減小傳感器的體積并降低其成本成為工業(yè)量產(chǎn)的亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種體積小、成本低、檢測可靠性高的基于抗體抗原法檢測肝纖維化的微型傳感器。
本發(fā)明設(shè)計的基于抗體抗源法檢測肝纖維化的微型傳感器，由工作電極、參比電極、對電極和基板組成，其結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示。其中，工作電極3為圓形或近似圓形，共4-8個，分兩排對稱設(shè)置于基板兩側(cè)，參比電極1呈U字形，設(shè)置于兩排工作電極3之中間，對電極2呈長條形，設(shè)置于U字形參比電極1的中間；基板由硅襯底5和二氧化硅層6復(fù)合而成，各電極與二氧化硅層6之間有鈦粘附層7。采用二氧化硅層，可有效地使各電極絕緣，用鈦做粘附層，不僅可增加金、銀電極與二氧化硅層的粘附強度，還可使其暴露在電極邊緣的部分氧化成二氧化鈦，而二氧化鈦絕緣且化學(xué)惰性，不會對測量造成干擾。
本發(fā)明中，工作電極3的直徑為0.6-1.2mm，相互間距為100-300微米；參比電極1的U字形邊也可以做成與工作電極3的圓形相吻合的圓弧形狀，參比電極1與每個工作電極3的間距為100-300微米；長條形的對電極2也可以做成與參比電極1的內(nèi)側(cè)弧形相近似的曲線弧形，與參比電極1的兩條邊的距離為100-300微米。
本發(fā)明中，工作電極3可采用黃金電極，上面覆蓋一層用于檢測的不同抗體聚合形成的半絕緣膜9。工作電極1通過引線與觸點(引腳)4連接。參比電極1可采用銀電極，其上還覆蓋一層氯化銀8，使銀在空氣中不會被氧化或硫化。對電極2采用鉑金電極或黃金電極。
本發(fā)明設(shè)計的微型傳感器，在用伏安法測量時，能使參比電極和工作電極以及參比電極與對電極之間的電流密度分布比較均勻，從而減小測量誤差。該傳感器尺寸很小，卻包含有4-6個工作電極，若在每個電極上聚合不同的抗體就可同時測量出血清的多個指標，而只需約50微升血清。
本發(fā)明可采用IC工藝中的常規(guī)成膜工藝(如蒸發(fā)、濺射等)制備各種電極膜，所制成的電極膜均勻、致密。使用光刻工藝使電極成形，因而電極形狀高度一致，減小了測量誤差。它不僅可以定性，且可以定量檢測血清中抗原的濃度，從而可以更好地估計病人的病況。由于制作工藝完全與IC工藝兼容，可方便地進行大批量生產(chǎn)，成本大大降低，從而可以一次性使用，避免了交叉污染，使準確率大大提高。
使用本發(fā)明設(shè)計的微型傳感器檢測肝纖維化的三個指標，其響應(yīng)曲線見圖3-圖6所示。其中用循環(huán)伏安法共聚鄰苯二胺(10mM)與透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)，聚合前和聚合后的伏安曲線分別為兩個閉合曲線，見圖3所示。本傳感器對不同濃度的透明質(zhì)酸(HA)的響應(yīng)，隨著濃度上升(從20ng/ml-60ng/ml)，曲線規(guī)則下降(見圖4所示)，表明抗體抗原反應(yīng)致電阻增加。傳感器對不同濃度IV型膠原蛋白(IV-C)的響應(yīng)，隨著濃度上升(0.99ng/ml-9.65ng/ml)，曲線規(guī)則下降(見圖5所示)，表明抗體抗原反應(yīng)致電阻增加。傳感器對不同深度和層粘連蛋白(LN)的響應(yīng)，隨著濃度上升(9.9ng/ml-107.1ng/ml)，曲線呈規(guī)則下降(見圖6所示)，表明抗體抗原反應(yīng)致電阻增加。


圖1為用于肝纖維化檢測的傳感器正面示意圖。
圖2為用于肝纖維化檢測的傳感器剖面示意圖。
圖3至圖6為用該傳感器檢測肝纖維化的三個指標的響應(yīng)曲線。
圖3為循環(huán)伏安法共聚鄰苯二胺(10mM)與透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)，兩條閉合曲線分別為聚合前和聚合后的伏安曲線。
圖4為傳感器對不同濃度透明質(zhì)酸(HA)的響應(yīng)曲線。
圖5為傳感器對不同濃度IV型膠原蛋白(IV-C)的響應(yīng)曲線。
圖6為傳感器對不同濃度和層粘連蛋白(LN)的響應(yīng)曲線。
圖中標號1為參比電極，2為對電極，3為工作電極，4為壓焊點(引腳)，5為硅襯底，6為二氧化硅層，7為鈦粘附層，8為氯化銀層，9為用循環(huán)伏安法共聚臨苯二胺與肝纖維化標志物抗體的半絕緣膜。
具體實施例方式
下面通過實施例進一步描述本發(fā)明。
采用蒸發(fā)后lift-off方法制作本微型傳感器(對電極亦使用黃金電極)。也可采用濺射等代替蒸發(fā)，腐蝕法代替lift-off來制備。
a.用一號、二號液依次清洗硅片并用去離子水沖洗，烘干。
b.熱生長300nm的SiO2。
c.光刻出需要的工作電極和對電極圖形，如圖1和圖2所示。工作電極3為6個，兩邊對稱排列，直徑為1mm，間距為200微米，工作電極3與參比電極1的間距為200微米，參比電極1與對電極2的間距亦為200微米。
d.蒸發(fā)鈦層，厚度約20nm，隨后蒸發(fā)黃金，厚度300nm。
e.lift-off得所需要的工作電極和對電極圖形。
f.光刻出需要的參比電極圖形。
g.蒸發(fā)鈦層，厚度約20nm，隨后蒸發(fā)銀，厚度400nm。
h.lift-off得所需要的工作電極和對電極圖形。
i.封裝。
j.在NaCl溶液中，陽極氧化法在參比電極1上生長一層約200nm氯化銀層8。
k.循環(huán)伏安法共聚鄰苯二胺(10mM)與透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)以及其它種需要的抗體(不同抗體聚合在不同工作電極)。
完成后即可用于血清指標(關(guān)于肝纖維化)的測量。
權(quán)利要求
1.一種基于抗體抗原法檢測肝纖維化的微型傳感器，其特征在于由工作電極、參比電極、對電極和基板組成，其中，工作電極3為圓形或近似圓形，共4-8個，分兩排對稱設(shè)置于基板兩側(cè)，參比電極(1)呈U字形，設(shè)置于兩排工作電極(3)之中間，對電極(2)呈長條形，設(shè)置于U字形參比電極(1)的中間；基板由硅襯底(5)和二氧化硅層(6)復(fù)合而成，各電極與二氧化硅層(6)之間有鈦粘附層(7)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微型傳感器，其特征在于工作電極3的直徑為0.6-1.2mm，相互間距為100-300微米；參比電極(1)的U字形邊做成與工作電極3的圓形相吻合的圓弧形狀，參比電極(1)與每個工作電極(3)的間距為100-300微米；長條形的對電極(2)做成與參比電極(1)的內(nèi)側(cè)弧形相近似的曲線弧形，與參比電極(1)的兩條邊的距離為100-300微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微型傳感器，其特征在于工作電極(3)采用黃金電極，上面覆蓋一層半絕緣膜(9)；參比電極(1)采用銀電極，其上覆蓋一層氯化銀(8)，對電極(2)采用鉑金電極或黃金電極。
全文摘要
本發(fā)明屬硅微機械和電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于抗體抗原法檢測肝纖維化的微型傳感器。它由工作電極、參比電極、對電極和基板構(gòu)成。其中，工作電極呈圓形或類似圓形，對稱排列，參比電極呈U字形，置于工作電極中間，對電極呈長條形，置于參比電極中間?；逵晒枰r層與二氧化硅層復(fù)合組成。工作電極有4－8個，電極與二氧化硅層間用鈦粘附層粘結(jié)。各電極可采用IC工藝中的常規(guī)成膜工藝制備。本發(fā)明的微型傳感器體積小，成本低，檢測可靠性高。它可以定量檢測血清中的抗原濃度，并可同時檢測血清的多個指標，而血清的使用量很少。
文檔編號G01N27/48GK1687768SQ200510025268
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者黃洪湖, 周嘉, 史綿紅, 黃宜平, 孔繼烈 申請人:復(fù)旦大學(xué)