一種可視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法及其應(yīng)用，所述方法利用酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生具有還原性的產(chǎn)物，其將二價(jià)銅離子還原成一價(jià)銅離子，通過表面功能化的金納米粒子和一價(jià)銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)來可視化地分析酶的含量；結(jié)合酶標(biāo)記抗體技術(shù)，將酶標(biāo)記的抗體用于抗原-抗體相互作用的免疫分析中，利用所述可視化分析酶含量的方法達(dá)到可視化分析抗原-抗體相互作用的目的；將所述方法用于臨床樣本中相關(guān)抗原抗體的可視化檢測(cè)。本發(fā)明僅靠肉眼即可完成對(duì)抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，成本低，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種可視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)分析【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法及 其應(yīng)用，尤其涉及一種可視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫標(biāo)記分析方法是將免疫反應(yīng)的高特異性和生物標(biāo)記的高靈敏性結(jié)合在一起 而發(fā)展出來的生物分析方法。這一分析方法不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高， 而且操作簡(jiǎn)單，易于商品化和自動(dòng)化。
[0003] 免疫標(biāo)記分析方法的應(yīng)用范圍極其廣泛，可以測(cè)定內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì) 胞表面抗原、腫瘤標(biāo)志物等各種具有生物活性的物質(zhì)，對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展起 到了促進(jìn)作用。按照不同標(biāo)記物可以分為放射性免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、化 學(xué)發(fā)光免疫分析、膠體金免疫分析等。
[0004] 其中，酶免疫標(biāo)記操作簡(jiǎn)便，使用成本低廉，目前在臨床醫(yī)學(xué)診斷中應(yīng)用最為廣 泛。雖然被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床診斷，但是現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析方法需要使用酶標(biāo) 儀來進(jìn)行檢測(cè)信號(hào)的讀出，對(duì)儀器的依賴性限制了其在條件落后及不發(fā)達(dá)地區(qū)的開展和應(yīng) 用。
[0005] 因此，發(fā)展一種簡(jiǎn)單有效、便于開展和無需儀器讀出的免疫分析方法有著重大的 需求，這對(duì)改善條件落后和不發(fā)達(dá)地區(qū)的醫(yī)療診斷狀況具有十分重要的意義。
[0006] 納米技術(shù)是當(dāng)前的熱門研究領(lǐng)域，納米材料在生物醫(yī)學(xué)研究中扮演著越來越重要 的角色。由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，不同聚集狀態(tài)的金納米粒子在可見光范圍內(nèi)呈現(xiàn)不同的 顏色，這為發(fā)展肉眼可視化的生化分析檢測(cè)方法提供了良好的平臺(tái)。
[0007] 目前，對(duì)于可視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法已有諸多相關(guān)專利申請(qǐng)公開，例如， CN102269758A公開了一種可視化檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)的方法、試劑盒及其應(yīng)用，其主要是采 用氧化銅納米顆粒標(biāo)記抗體技術(shù)達(dá)到可視化檢測(cè)的目的；CN101639476A公開了一種可視 化結(jié)核抗體檢測(cè)蛋白芯片、制備方法及用途，其利用的主要是蛋白芯片技術(shù)和免疫金銀染 色讀出方法；CN103645185A和CN103713134A都披露了一種可視化檢測(cè)堿性磷酸酶的方法， 均采用堿性磷酸酶可以誘導(dǎo)金屬銀單質(zhì)沉積到納米金表面形成金核銀殼結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn) 可視化檢測(cè)；CN101504416A公開了一種金包覆磁粒原位引發(fā)高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)大腸桿 菌的新方法，該發(fā)明的重點(diǎn)在于表面覆蓋金的磁性納米顆粒的制備以及化學(xué)發(fā)光方法的讀 出；等等。
[0008] 蔣興宇等報(bào)道了通過合成表面功能化的金納米粒子，利用一價(jià)銅催化的點(diǎn)擊化學(xué) 反應(yīng)來檢測(cè)溶液中的二價(jià)銅離子（參考文獻(xiàn)：Yang Zhou, Shixing Wang, Ke Zhang, Xingyu Jiang. Angew. Chem. Int. Ed. 2008,47,7454-7456)。與傳統(tǒng)的儀器分析方法相比，利用金納 米粒子結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行銅離子檢測(cè)的方法具有快速簡(jiǎn)便、選擇性好、靈敏度高、成本 低廉的特點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法及其應(yīng)用，特別是一種可 視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法及其應(yīng)用。
[0010] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011] 一方面，本發(fā)明提供一種可視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法，該方法包括以下步 驟：
[0012] (1)抗原抗體反應(yīng)：將酶標(biāo)記的抗體加入到包被的待檢測(cè)樣品中，充分反應(yīng)后洗 漆去除未反應(yīng)的酶標(biāo)記抗體；
[0013] (2)酶催化底物反應(yīng)：向步驟（1)反應(yīng)體系中加入酶的底物，使酶和底物充分反 應(yīng)；
[0014] (3)可視化檢測(cè)：向步驟（2)反應(yīng)體系中加入二價(jià)銅離子和表面功能化的金納米 粒子，充分反應(yīng)后根據(jù)反應(yīng)體系顏色的變化判斷樣品中是否發(fā)生反應(yīng)。
[0015] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，在步驟（1)之前還包括對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行封閉的步驟，該處 理的目的在于是標(biāo)記的抗體能夠與待檢測(cè)樣品進(jìn)行充分而穩(wěn)定的反應(yīng)。
[0016] 優(yōu)選地，所述封閉試劑為動(dòng)物血清，例如可以是胎牛血清、山羊血清或馬血清中的 任意一種，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述封閉試劑為胎牛血清。
[0017] 優(yōu)選地，所述封閉時(shí)間為30-120分鐘，封閉溫度為25_40°C ;進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 封閉時(shí)間為60分鐘；封閉溫度為37°C。
[0018] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，在步驟（1)中，所述酶為辣根過氧化物酶（HRP)或堿性磷酸酶 (ALP)，優(yōu)選為堿性磷酸酶（ALP)。
[0019] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)記的抗體為一抗或二抗。
[0020] 優(yōu)選地，所述抗原-抗體反應(yīng)的孵育時(shí)間為30-120分鐘，孵育溫度為25-40°C ;進(jìn) 一步優(yōu)選地，所述孵育時(shí)間為60分鐘，孵育溫度為37°C。
[0021] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，在步驟（2)中，所述酶的底物為磷酸化抗壞血酸、磷酸化檸檬 酸、磷酸化抗壞血酸鈉或磷酸化檸檬酸鈉中的任意一種；優(yōu)選為磷酸化抗壞血酸鈉。
[0022] 優(yōu)選地，所述酶的底物濃度為l_500mM，優(yōu)選為20mM。
[0023] 優(yōu)選地，所述酶與底物反應(yīng)的時(shí)間為5-180分鐘，優(yōu)選為60分鐘。
[0024] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，在步驟（3)中，所述二價(jià)銅離子為硫酸銅、硝酸銅或氯化銅中 的任意一種，優(yōu)選為硫酸銅。
[0025] 優(yōu)選地，所述二價(jià)銅離子的濃度為0. Ol-lOmM，優(yōu)選為0. 5mM。
[0026] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，在步驟（3)中，所述加入的表面功能化的金納米粒子為表面 炔基功能化的金納米粒子和表面疊氮基功能化的金納米粒子的組合。
[0027] 優(yōu)選地，所述表面炔基功能化的金納米粒子的炔基為包含化學(xué)式I的化合物：
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種可視化檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 抗原抗體反應(yīng)：將酶標(biāo)記的抗體加入到包被的待檢測(cè)樣品中，充分反應(yīng)后洗滌去 除未反應(yīng)的酶標(biāo)記抗體； (2) 酶催化底物反應(yīng)：向步驟（1)反應(yīng)體系中加入酶的底物，使酶和底物充分反應(yīng)； (3) 可視化檢測(cè)：向步驟（2)反應(yīng)體系中加入二價(jià)銅離子和表面功能化的金納米粒子， 充分反應(yīng)后根據(jù)反應(yīng)體系顏色的變化判斷樣品中是否發(fā)生反應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（1)之前還包括對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行 封閉的步驟； 優(yōu)選地，所述封閉試劑為動(dòng)物血清；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述封閉試劑為胎牛血清； 優(yōu)選地，所述封閉時(shí)間為30-120分鐘，封閉溫度為25-40°C ;進(jìn)一步優(yōu)選地，所述封閉 時(shí)間為60分鐘；封閉溫度為37°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟（1)中，所述酶為辣根過氧化 物酶（HRP)或堿性磷酸酶（ALP)，優(yōu)選為堿性磷酸酶（ALP); 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)記的抗體為一抗或二抗； 優(yōu)選地，所述抗原-抗體反應(yīng)的孵育時(shí)間為30-120分鐘，孵育溫度為25-40°C ;進(jìn)一步 優(yōu)選地，所述孵育時(shí)間為60分鐘，孵育溫度為37°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟（2)中，所述酶的底物為 磷酸化抗壞血酸、磷酸化檸檬酸、磷酸化抗壞血酸鈉或磷酸化檸檬酸鈉中的任意一種；優(yōu)選 為磷酸化抗壞血酸鈉； 優(yōu)選地，所述酶的底物濃度為l_500mM，優(yōu)選為20mM ; 優(yōu)選地，所述酶與底物反應(yīng)的時(shí)間為5-180分鐘，優(yōu)選為60分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟（3)中，所述二價(jià)銅離子 為硫酸銅、硝酸銅或氯化銅中的任意一種，優(yōu)選為硫酸銅； 優(yōu)選地，所述二價(jià)銅離子的濃度為0. Ol-lOmM，優(yōu)選為0. 5mM。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟（3)中，所述加入的表面 功能化的金納米粒子為表面炔基功能化的金納米粒子和表面疊氮基功能化的金納米粒子 的組合； 優(yōu)選地，所述表面炔基功能化的金納米粒子的炔基為包含化學(xué)式I的化合物：
優(yōu)選地，所述表面疊氮基功能化的金納米粒子的疊氮基為包含化學(xué)式II的化合物：
優(yōu)選地，所述表面疊氮基功能化的金納米粒子和表面炔基功能化的金納米粒子的摩爾 比為1 :(〇. 5-2)，優(yōu)選為1 :1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟（3)中，所述反應(yīng)體系的 顏色變化在5-30分鐘內(nèi)出現(xiàn)，優(yōu)選為10-15分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述待檢測(cè)樣品包括臨床檢測(cè) 樣品；優(yōu)選地，所述待檢測(cè)樣品為人抗肺炎支原體IgG。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法在生物醫(yī)學(xué)和/或醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述方法用于人抗肺炎支原體IgG的 可視化檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK104089950SQ201410338965
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】蔣興宇, 鮮于運(yùn)雷, 王卓 申請(qǐng)人:國家納米科學(xué)中心