專利名稱：一種梨花粉及花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是梨花粉及花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法，包括薔薇科木本果樹花粉及 花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法以及用該方法對花粉及花粉管微絲骨架進(jìn)行顯微鏡 觀察等內(nèi)容，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。二、 背景技術(shù)微絲骨架是細(xì)胞骨架的一種，它主要由肌動(dòng)蛋白組裝的螺旋狀多聚體和肌動(dòng)蛋白 結(jié)合蛋白組成。微絲的組裝和解聚與細(xì)胞的許多功能活動(dòng)相關(guān)，如參與細(xì)胞形態(tài)建成、 細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)定位、胞質(zhì)流動(dòng)以及頂端生長等?；ǚ酃茏鳛橛谢ㄖ参锸芫^程中雄性 單位的載體，具有典型的頂端生長特性，因而成為生物技術(shù)領(lǐng)域中研究細(xì)胞極性生長 的理想模式系統(tǒng)，此外，花粉管對細(xì)胞間的相互作用以及信號(hào)傳導(dǎo)研究也具有重要意 義。微絲骨架是花粉管的基本結(jié)構(gòu)之一，在花粉管的頂端生長中起著重要作用，包括 花粉管生長過程中極性位點(diǎn)的建立、分泌小泡的運(yùn)輸、胞質(zhì)流動(dòng)以及頂端細(xì)胞壁的構(gòu) 建，并且與<^2+等信號(hào)分子密切相關(guān)，因而，花粉管是研究植物細(xì)胞微絲骨架的模式 材料。對于花粉管中微絲骨架的分布至今仍然存在爭議。目前，己有很多研究花粉管中 微絲骨架的方法，但這些方法大多需要去壁，且主要用于草本植物花粉管微絲骨架分 布的研究，而幾乎沒有對木本植物花粉及花粉管內(nèi)微絲骨架開展過研究，尤其是對梨 等薔薇科木本果樹花粉和花粉管中微絲骨架進(jìn)行標(biāo)記的有效方法和技術(shù)還未見報(bào)道， 從而導(dǎo)致與梨等薔薇科果樹花粉管生長過程中相關(guān)的生物學(xué)研究相對滯后。三、 發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種較快速、有效的梨花粉及花粉管微絲骨架的 熒光標(biāo)記方法，有效地對微絲骨架在花粉(管)內(nèi)的結(jié)構(gòu)與分布進(jìn)行觀察。該方法可 用于標(biāo)記其他薔薇科木本果樹(蘋果、桃、杏、李等)花粉(管)內(nèi)微絲骨架，也為其他組織器官內(nèi)微絲骨架的熒光標(biāo)記與觀察提供方法。技術(shù)方案本發(fā)明所提供的對梨花粉及花粉管微絲骨架進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，包 括下列步驟1)花粉的采集采集梨樹開花當(dāng)天的花粉，自然干燥后密封，-201低溫保存；
蔗糖，10%; PEG4000 (聚乙二醇4000)， 15%; H3B03， 0.01%; Ca(N03) 2 4H20， 0.03%; MgS04*7H20， 0.02%;跳，0.01%;溶劑，水；用30 mraol/L的MES緩沖液 (2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩沖液)調(diào)pH值至6.5;3) 花粉的培養(yǎng)取步驟l)干燥后的花粉，放入花粉培養(yǎng)基中，在恒溫25i:黑暗條件下分別培養(yǎng) 0.5h或2h，培養(yǎng)0.5h的花粉，用于花粉粒內(nèi)微絲骨架的熒光標(biāo)記；培養(yǎng)2h得到花 粉管，用于花粉管內(nèi)微絲骨架的熒光標(biāo)記與觀察；4) 預(yù)固定培養(yǎng)后的花粉或花粉管，用新鮮的花粉培養(yǎng)基配制的200 Mmol/LMBS (順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)預(yù)固定5-10 miri;5) 固定然后用含有質(zhì)量比2%多聚甲醛和質(zhì)量比4%多聚甲醛、pH為6.8的0. 1 mol/L PBS緩沖液(磷酸緩沖液)室溫條件下固定花粉或花粉管0. 5 h; 0. 1 mol/L PBS 緩沖液(磷酸緩沖液)的配制NaH2P04 2H20 2. 964 g和Na2HP04 12H20 28. 998 g加 蒸餾水定容至1000 ml， pH 6.8;6) 洗滌用O. 1 mol/LPBS緩沖液(磷酸緩沖液)清洗2-3次，去除清洗液；7) 染色液的配制染色液用pH 6. 8的0. 1 mol/L PBS緩沖液(磷酸緩沖液)配制，其中加入終濃度 質(zhì)量比5呢DMS0 (二甲基亞砜)，終濃度5 mmol/L EGTA (乙二醇二乙醚二胺四乙酸)， 終濃度質(zhì)量體積比10%蔗糖，再加入終濃度5 Pg/ml FITC-ph (異硫氰酸熒光素標(biāo)記 的鬼筆環(huán)肽)；8) 染色加入染色液，在室溫黑暗條件下孵育0.5-1 h;9) 洗滌用O. 1 mol/LPBS緩沖液(磷酸緩沖液)清洗2-3次，獲得標(biāo)記好的樣口叫510) 封片標(biāo)記好的樣品滴加在載玻片上，并用體積比50%甘油封片，待觀察。上述步驟4)用MBS (順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)預(yù)固定的時(shí)間最好為7 min，步驟8)孵育時(shí)間最好為lh。 有益效果1) 首次對薔薇科木本果樹梨花粉及花粉管微絲骨架進(jìn)行熒光標(biāo)記，本發(fā)明將在 薔薇科木本果樹花粉研究開發(fā)利用過程中發(fā)揮重要作用，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值高。2) 本發(fā)明操作簡單、快速，省略了迄今在其他標(biāo)記方法中對細(xì)胞壁進(jìn)行酶解的 步驟；3) 用MBS (順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)預(yù)固定后再用多聚甲醛固定能夠
較好地保存花粉和花粉管內(nèi)的微絲骨架結(jié)構(gòu)；4) 用DMSO (二甲基亞砜)作為滲透劑，增加了細(xì)胞膜的通透性，減少了對細(xì) 胞的損傷，較好地保存花粉和花粉管內(nèi)微絲骨架結(jié)構(gòu)。5) 本發(fā)明選用FITC-ph (異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)作為熒光標(biāo)記染料， 克服了梨花粉外壁自發(fā)熒光的干擾，標(biāo)記效果好，可在激光共聚焦顯微鏡下清晰地觀 測到微絲骨架呈束狀沿花粉管長軸分布。6) 該方法可用于標(biāo)記其他薔薇科木本果樹(蘋果、桃、杏、李等)花粉(管) 內(nèi)微絲骨架，也為其他組織器官內(nèi)微絲骨架的熒光標(biāo)記與觀察提供方法。四

圖1梨花粉(管)微絲骨架熒光標(biāo)記的流程圖。圖2用含有FITC-ph (異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)的染色液按照圖1流程圖標(biāo)記后在激光 共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為488 nm)下觀測到的花粉和花粉管微絲骨架的結(jié)構(gòu)與分布情況?；?粉粒內(nèi)微絲呈絲狀，在花粉萌發(fā)孔處聚集(圖2a)，在花粉管內(nèi)，微絲呈現(xiàn)束狀沿花粉管長軸分 布，花粉管頂端區(qū)域(離尖端大約10 ym)沒有發(fā)現(xiàn)有微絲存在(圖2 b)。 圖3對照。圖3-a為先用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)處理，然后用FITC-ph染色液(異硫氰酸熒光 素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色液)標(biāo)記后在激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為488 nm)下所觀測的圖像， 結(jié)果沒有觀察到花粉和花粉管內(nèi)微絲骨架；圖3-b為用FITC (異硫氰酸熒光素)代替FITC-ph (異 硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)標(biāo)記后在激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為488nm)下所觀測的 圖像，花粉和花粉管內(nèi)均有強(qiáng)熒光，但未觀察到微絲骨架結(jié)構(gòu)。說明FITC-ph (異硫氰酸熒光素 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)能特異性地標(biāo)記花粉或花粉管內(nèi)微絲骨架。圖4用TRITC-ph (四甲基羅丹明B異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)替代FITC-ph (異硫氰酸熒 光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)的染色液按照圖1流程圖標(biāo)記后在激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為568 nm)下觀測到的花粉和花粉管微絲骨架的結(jié)構(gòu)與分布情況，花粉粒中由于外壁的自發(fā)熒光(三角 形所示)，無法確定亮區(qū)內(nèi)部微絲骨架的結(jié)構(gòu)形態(tài)與分布，但在未萌發(fā)的花粉萌發(fā)孔處看見點(diǎn)狀結(jié) 構(gòu)(圖4-b，箭頭所示)，在花粉管內(nèi)可以看見微絲成束狀沿花粉管長軸分布，在花粉萌發(fā)孔處也 能看到微絲的分布(圖4-c，箭頭所示)。圖4-a為不含TRITC-ph染色液(四甲基羅丹明B異硫 氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色液)按照圖1流程圖標(biāo)記后在激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為 568 nin)下所觀測到的花粉外壁的自發(fā)熒光。 注圖2， 3， 4中的靶標(biāo)均表示10 Mm五、 具體實(shí)施實(shí)例1) 植物樣品的釆集釆集梨樹開花當(dāng)天的花粉，自然干燥后密封，-2(TC低溫保存。2) 花粉培養(yǎng)基的制備蔗糖，10%; PEG 4000 (聚乙二醇4000)， 15%; H3B03， 0.01%; Ca(N03)2 4H20， 0.03%; MgS04 7H20， 0.02%;跳，0.01%;溶劑，水； 用30誦ol/L的MES緩沖液(2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩沖液)調(diào)pH值至6. 5;3) 花粉的培養(yǎng)取步驟l)干燥后保存的花粉，先在常溫下解凍2h，在上述花 粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)花粉，溫度為25。C，黑暗條件，分別培養(yǎng)0.5h和2h。培養(yǎng)0.5h的 花粉，用于花粉粒內(nèi)微絲骨架的熒光標(biāo)記；培養(yǎng)2h得到花粉管，用于花粉管內(nèi)微絲 骨架的熒光標(biāo)記與觀察；4) 預(yù)固定培養(yǎng)后的花粉或花粉管，用新鮮的花粉培養(yǎng)基配制的200 Mmol/LMBS (順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)預(yù)固定7 min;5) 固定然后用含有質(zhì)量比2°/。多聚甲醛和質(zhì)量比4%多聚甲醛、pH為6. 8的0. 1 mol/L PBS緩沖液(磷酸緩沖液)室溫條件下固定花粉或花粉管0. 5 h; 0. 1 mol/L PBS 緩沖液(磷酸緩沖液)的配制Na跳 2H20 2 . 964 g和Na2HP04 12H20 28. 998 g加 蒸餾水定容至1000 ml， pH 6.8;6) 洗滌用O. 1 mol/L PBS緩沖液(磷酸緩沖液)清洗3次，去除清洗液；7) 染色液的配制染色液用pH 6. 8的0. 1 mol/L PBS緩沖液(磷酸緩沖液)配 制，其中加入終濃度質(zhì)量比5% DMSO (二甲基亞砜)，終濃度5隱ol/LEGTA (乙二醇 二乙醚二胺四乙酸)，終濃度質(zhì)量體積比10%蔗糖，再加入終濃度5 Pg/ml FITC-ph (異 硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)；8) 染色去除清洗液后加入染色液，在黑暗條件下25'C孵育1 h;9) 洗滌標(biāo)記后的樣品用0. 1 mol/L PBS緩沖液(磷酸緩沖液)清洗3次，獲 得標(biāo)記好的樣品；10) 封片及觀察標(biāo)記好的樣品滴加在載玻片上，并用體積比50%甘油封片，最 后在激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad MRC 1024 ES， Ar/Kr激光，激光波長為488 nm) 下進(jìn)行觀測，沿Z軸進(jìn)行連續(xù)光學(xué)切片，并將所有光學(xué)切片進(jìn)行三維重構(gòu),結(jié)果如圖2， 能清晰地觀測到微絲骨架在花粉和花粉管中的分布狀況。圖2a花粉粒內(nèi)微絲呈絲狀， 在花粉萌發(fā)孔處聚集。圖2b在花粉管內(nèi)，微絲呈現(xiàn)束狀沿花粉管長軸分布，花粉管 頂端區(qū)域(離尖端大約IO urn)沒有發(fā)現(xiàn)有微絲存在。圖3對照。圖3-a為先用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)處理，然后用FITC-ph (異硫 氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)染色液標(biāo)記后在激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為488
nm)下所觀測的圖像，結(jié)果沒有觀察到花粉和花粉管內(nèi)微絲骨架；圖3-b為用FITC (異硫氰酸熒光素)代替FITC-ph (異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)標(biāo)記后在激光 共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為488 nm)下所觀測的圖像，花粉和花粉管內(nèi)均有強(qiáng)熒 光，但未觀察到微絲骨架結(jié)構(gòu)。說明FITC-ph (異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)能 特異性地標(biāo)記花粉或花粉管內(nèi)微絲骨架。圖4用TRITC-ph (四甲基羅丹明B異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)替代 FITC-ph (異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)的染色液按照圖1流程圖標(biāo)記后在激光 共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為568 nm)下觀測到的花粉和花粉管微絲骨架的結(jié)構(gòu)與分 布情況，花粉粒中由于外壁的自發(fā)熒光(三角形所示)，無法確定亮區(qū)內(nèi)部微絲骨架 的結(jié)構(gòu)形態(tài)與分布，但在未萌發(fā)的花粉萌發(fā)孔處看見點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)(圖4-b，箭頭所示)， 在花粉管內(nèi)可以看見微絲成束狀沿花粉管長軸分布，在花粉萌發(fā)孔處也能看到微絲的 分布(圖4-c，箭頭所示)。圖4-a為不含TRITC-ph染色液按照圖l流程圖標(biāo)記后在 激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長為568 nm)下所觀測到的花粉外壁的自發(fā)熒光。
權(quán)利要求
1、一種梨花粉及花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法，包括1)花粉的采集采集開花當(dāng)天的花粉，采集梨樹開花當(dāng)天的花粉，自然干燥后密封，-20℃低溫保存；2)花粉培養(yǎng)基按照質(zhì)量比制備蔗糖，10％；聚乙二醇PEG4000，15％；H3BO3，0.01％；Ca(NO3)2·4H2O，0.03％；MgSO4·7H2O，0.02％；KNO3，0.01％；溶劑，水；用30mmol/L的2-(N-嗎啉基)乙磺酸MES緩沖液調(diào)pH值至6.5；3)花粉的培養(yǎng)取步驟1)干燥后的花粉，放入花粉培養(yǎng)基中，在恒溫25℃黑暗條件下分別培養(yǎng)0.5h或2h，培養(yǎng)0.5h的花粉，用于花粉粒內(nèi)微絲骨架的熒光標(biāo)記；培養(yǎng)2h得到花粉管，用于花粉管內(nèi)微絲骨架的熒光標(biāo)記與觀察；4)預(yù)固定培養(yǎng)后的花粉或花粉管，用新鮮的花粉培養(yǎng)基配制的200μmol/L順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯MBS預(yù)固定5-10min；5)固定然后用含有質(zhì)量比2％多聚甲醛和質(zhì)量比4％多聚甲醛、pH為6.8的0.1mol/L磷酸緩沖液PBS室溫條件下固定花粉或花粉管0.5h；0.1mol/L PBS緩沖液的配制NaH2PO4·2H2O2.964g和Na2HPO4·12H2O28.998g加蒸餾水定容至1000ml，pH6.8；6)洗滌用0. 1mol/L PBS緩沖液清洗2-3次，去除清洗液；7)染色液的配制染色液用pH6. 8的0.1mol/L PBS緩沖液配制，其中加入終濃度質(zhì)量比5％的二甲基亞砜DMSO，終濃度5mmol/L的乙二醇二乙醚二胺四乙酸EGTA，終濃度質(zhì)量體積比10％的蔗糖，再加入終濃度5μg/ml的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽FITC-ph；8)染色加入染色液，在室溫黑暗條件下孵育0.5-1h；9)洗滌用0. 1mol/L PBS緩沖液清洗2-3次，獲得標(biāo)記好的樣品；10)封片標(biāo)記好的樣品滴加在載玻片上，并用體積比50％甘油封片觀察。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梨花粉及花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法，其特征在 于步驟4)用順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯MBS預(yù)固定的時(shí)間為7min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟8)孵育時(shí)間為lh。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種梨花粉和花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括采集成熟花粉，在培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)花粉0.5h和2h，用新鮮的花粉培養(yǎng)基配制的200μmol/L MBS(順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)預(yù)固定5-10min后分別用2％多聚甲醛和4％多聚甲醛各固定0.5h，洗滌花粉(管)，用終濃度為5μg/ml[含5％DMSO(二甲基亞砜)]的FITC-ph染色液(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色液)，在25℃避光下染色0.5-1h，微絲骨架被熒光標(biāo)記。本發(fā)明具有操作簡單、快速、標(biāo)記效果好、對微絲骨架結(jié)構(gòu)破壞小等特點(diǎn)，可用于薔薇科植物花粉(管)的開發(fā)利用，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值高。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101398381SQ20081023498
公開日2009年4月1日 申請日期2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者劉珠琴, 俊 吳, 吳華清, 張紹鈴, 肖家欣 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)