專利名稱：改進(jìn)的免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及診斷或預(yù)后測定領(lǐng)域，特別涉及優(yōu)化用于在包含患者體液的樣品中檢測抗體的測定，其中這樣的抗體用作疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
許多診斷、預(yù)后和/或監(jiān)測測定依賴于檢測特定疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo) 志物。這樣的生物標(biāo)志物一般是作為特定疾病特征的或與疾病易感性相關(guān)的蛋白質(zhì)或多肽?？贵w特別是自身抗體也能作為疾病或疾病易感性的生物標(biāo)志物,這一點在近年來開始愈發(fā)明顯。自身抗體是天然存在的抗體，其針對被個體免疫系統(tǒng)識別為外源的抗原，盡管該抗原實際上源自該個體。它們可以作為循環(huán)的游離自身抗體存在于循環(huán)中，或者以由與其靶標(biāo)志物蛋白結(jié)合的自身抗體組成的循環(huán)免疫復(fù)合物的形式存在。在一些情況下，正常細(xì)胞表達(dá)的野生型蛋白質(zhì)與由疾病細(xì)胞產(chǎn)生或在疾病過程中產(chǎn)生的該蛋白質(zhì)的改變形式之間的差異可能導(dǎo)致個體的免疫系統(tǒng)將所述改變的蛋白質(zhì)識別為“非自身”，并因而在該個體中引發(fā)免疫應(yīng)答。這可以是體液(即B細(xì)胞介導(dǎo)的)免疫應(yīng)答，其引起產(chǎn)生對該改變的蛋白質(zhì)具有免疫特異性的自身抗體。W099/58978描述了用于檢測/診斷癌癥的方法，該方法基于評估個體對兩種或更多不同腫瘤標(biāo)志物的免疫應(yīng)答。這些方法通常包括使采自個體的體液樣品接觸具有兩種或更多不同腫瘤標(biāo)志物抗原的板，每種抗原來自一種單獨的腫瘤標(biāo)志物蛋白，并且檢測該腫瘤標(biāo)志物抗原與對該腫瘤標(biāo)志物蛋白具有免疫特異性的循環(huán)自身抗體結(jié)合的復(fù)合物的形成。將存在這樣的循環(huán)自身抗體作為存在癌癥的指示。測量個體在自身抗體產(chǎn)生方面對存在腫瘤標(biāo)志物蛋白的免疫應(yīng)答的測定提供了直接測量或檢測體液中腫瘤標(biāo)志物蛋白的替代方案。這樣的測定實質(zhì)上構(gòu)成了對腫瘤標(biāo)志物蛋白存在情況的間接檢測。由于免疫應(yīng)答的性質(zhì)，很可能極少量的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物蛋白即可引發(fā)自身抗體，因此依賴于檢測對腫瘤標(biāo)志物的免疫應(yīng)答的間接方法將比直接測量體液中腫瘤標(biāo)志物的方法更靈敏。因此，基于檢測自身抗體的測定可能在疾病過程的早期特別具有價值，并且可能在無癥狀患者的篩選方面也是如此，例如進(jìn)行篩選以在無癥狀個體的群體中鑒定具有發(fā)生疾病“風(fēng)險”的個體、在無癥狀個體的群體中鑒定已發(fā)生疾病的個體。另外，基于檢測自身抗體的方法可能在疾病過程的早期特別具有價值，并且也可能被用于在無癥狀群體中鑒定已發(fā)生疾病的個體。此外，它們還可能用于復(fù)發(fā)性疾病的早期檢測。該測定方法在選擇或監(jiān)測疾病的治療方案方面也具有價值?？贵w和自身抗體也可作為其他疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物學(xué)標(biāo)志物，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性甲狀腺炎(例如橋本甲狀腺炎))、自身免疫性胃炎(例如惡性貧血)、自身免疫性腎上腺炎(例如艾迪生病)、自身免疫性甲狀旁腺功能減退、自身免疫性糖尿病(例如I型糖尿病)、重癥肌無力
坐寸O本發(fā)明人認(rèn)識到，當(dāng)基于抗體檢測的測定在診斷或預(yù)后上用于評價群體中個體的疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)程或疾病易感性時，會在設(shè)計適用于整個待篩選群體的標(biāo)準(zhǔn)化測定法方面遇到困難，因為個體之間抗體的絕對量存在顯著的變化。這會使假陰性結(jié)果的發(fā)生率很高，例如在抗體量低的個體中。類似地，對真陽性結(jié)果的評分也存在困難，因為個體間抗體絕對量的變化意味著難以為陽性測定結(jié)果設(shè)定適合于篩選群體中所有個體的閾值。本發(fā)明人現(xiàn)在確定，可以通過包括抗原滴定步驟來顯著改善基于檢測作為疾病生物標(biāo)志物的抗體特別是自身抗體的測定方法的性能、更具體地為臨床效用以及可靠性。通過對懷疑含有抗體的樣本針對一系列不同的抗原量進(jìn)行測試并創(chuàng)建滴定曲線，有可能獨立 于樣品中存在的抗體絕對量而可靠鑒定真陽性篩選結(jié)果。這樣的方法與現(xiàn)有技術(shù)中的方法相反，在這些現(xiàn)有技術(shù)的方法中，滴定抗原僅用于創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線，以鑒定最適用于在實際患者樣品中檢測抗體的抗原濃度。在這些方法中，僅將單點測量用于實際診斷。因此，這些方法不容許個體間檢測的抗體量的變化，導(dǎo)致發(fā)生所說的假陽性和假陰性。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗原滴定法的特異性和靈敏度高于在單個抗原濃度下測定自身抗體的反應(yīng)性以及滴定血清樣品而不是抗原的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個方面提供在哺乳動物受試者中檢測疾病狀態(tài)或疾病易感性的方法，其包括在包含來自該哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測抗體，其中所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物，該方法包括(a)使所述測試樣品與多個不同量的所述抗體特異性的抗原接觸，(b)檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結(jié)合的量，(c)對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結(jié)合量對該抗原量的曲線，以及(d)基于每個所用的不同抗原濃度下該抗體與該抗原之間特異性結(jié)合的量，確定該疾病狀態(tài)或疾病易感性的存在與否。本發(fā)明的第二個方面提供在包含來自哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測抗體的方法，其中所述抗體針對引入該哺乳動物受試者的外源物質(zhì)，該方法包括(a)使所述測試樣品與多個不同量的所述抗體特異性的抗原接觸，(b)檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結(jié)合的量，以及(c)對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結(jié)合量對該抗原量的曲線。本發(fā)明的第三個方面提供在包含來自哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測抗體的方法，其中該抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物，該方法包括(a)使所述測試樣品與多個不同量的所述抗體特異性的抗原接觸，(b)檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結(jié)合的量，以及(c)對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結(jié)合量對該抗原量的曲線。在本發(fā)明的所有方面中，所述哺乳動物受試者優(yōu)選為人。在本發(fā)明的所有方面中，該方法優(yōu)選在體外在包含從該哺乳動物受試者獲得或制備的體液的測試樣品上進(jìn)行。在所有方面中，本發(fā)明的一個特別特征是，對測試樣品中是否存在相關(guān)抗體的判斷是基于每個不同測試抗原濃度下觀察到的特異性結(jié)合的量(換言之，集合值)，而不是僅僅在單個濃度下的讀數(shù)。因此，可以直接基于這些集合值確定患者樣品中是否存在疾病狀態(tài)或疾病易感性或針對外源物質(zhì)的抗體。優(yōu)選地，基于以特異性結(jié)合量對抗原量作圖時呈現(xiàn)的總體為S形或反S型的曲線作出該判斷。從本文實施例中顯而易見地，本發(fā)明人觀察到本發(fā)明的抗原滴定法與基于單個讀數(shù)的診斷或檢測方法相比具有更高的特異性和靈敏度，并且減少了假陽性和假陰性鑒定的發(fā)生率。


圖I :使用抗原滴定曲線測量血清中的自身抗體。癌癥患者血清17766(C)與測試抗原強(qiáng)烈結(jié)合，具有特征性反S型曲線()，但是不與陰性對照結(jié)合，VOL ( ■)。作為對比，來自正常個體的血清18052 (N)不與測試抗原或陰性對照結(jié)合。圖2 :使用抗原滴定測定衡量的正常個體與原發(fā)性乳腺癌(PBC)患者中p53自身抗體水平的比較。自身抗體水平表示為由于結(jié)合測試抗原(P53)產(chǎn)生的OD65tl減去由于結(jié)合陰性對照產(chǎn)生的0D65(i。正常截止值(——)計算為正常群體的平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。圖3顯示使用抗原滴定測定衡量的正常個體與肺癌患者中p53和NY-ESO自身抗體水平的比較。自身抗體水平表示為由于結(jié)合測試抗原(P53或NY-ES0)產(chǎn)生的OD65tl減去由于結(jié)合陰性對照產(chǎn)生的0D65(i。正常截止值(——)計算為正常群體的平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。圖4顯示用于在來自乳腺癌患者的腹水樣品中檢測針對p53和NY-ESO的自身抗體的滴定曲線。測試了該患者，但發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生抗c-myc的自身抗體。圖5顯示用于在來自乳腺癌患者(原位導(dǎo)管癌)的血清樣品中檢測針對BRCA1、BRCA2和HER2的自身抗體的滴定曲線。圖6顯示用于在來自肺癌患者的血清樣品中檢測針對NY-ESO的自身抗體的滴定曲線。測試了該患者，但發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生抗p53或c-myc的自身抗體。圖7顯示用于在來自肺癌患者的血清樣品中檢測針對NY-ESO和p53的自身抗體的滴定曲線。測試了該患者，但發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生抗c-myc的自身抗體。圖8(a)和圖8(b)展示了在來自“正常”受試者(即無癌癥證據(jù)的個體)的血清樣品中用于針對抗P53、c-myc和NY-ES0-1的自身抗體的兩次獨立滴定測定的結(jié)果。圖9(a)和圖9(b)顯示了使用一系列不同抗原對來自單個侵襲性乳腺癌患者的血清樣品進(jìn)行的兩次獨立滴定測定的結(jié)果。圖10(a)和圖10(b)展示了滴定測定的結(jié)果，其中用生物素化的抗原BRCA2、HER2、c-myc和NY-ES0-1、非生物素化的BRCAl和“空”載體VOL的對照表達(dá)產(chǎn)物測試了來自臨床正常人受試者的血清樣品中自身抗體的存在情況，其中VOL編碼生物素標(biāo)記但沒有額外的抗原。
圖11展示了關(guān)于抗原p53、c-myc和NY_ES0_1、以及“空”載體VOL的對照表達(dá)產(chǎn)物，用本發(fā)明的抗原滴定測定對原發(fā)性乳腺癌患者的自身抗體分析的結(jié)果。圖12展示了使用來自正常個體的血清重復(fù)圖11所示測定的結(jié)果。圖13展示了對患原發(fā)性乳腺癌但還顯示針對生物素的抗體應(yīng)答的患者使用本發(fā)明的抗原滴定測定得到的結(jié)果。圖14展示了在正常樣品上進(jìn)行的根據(jù)本發(fā)明滴定抗原的自身抗體檢測測定與抗 原量保持恒定而滴定血清的自身抗體檢測測定之間實驗性比較的結(jié)果。圖15展示了在來自原發(fā)性乳腺癌患者的樣品上進(jìn)行的根據(jù)本發(fā)明滴定抗原的自身抗體檢測測定與抗原量保持恒定而滴定血清的自身抗體檢測測定之間實驗性比較的結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明一般提供檢測作為疾病狀態(tài)或疾病易感性生物標(biāo)志物的抗體的免疫測定方法，其特征在于針對不同量的該抗體特異性抗原對待測試抗體存在的樣品進(jìn)行測試，并由抗體/抗原結(jié)合對測試抗原量產(chǎn)生滴定曲線。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已經(jīng)公知諸如ELISA、放射免疫測定等免疫測定的一般特征(參閱 Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc. , SanDiego, CA, 1996)。用于檢測具有特定免疫特異性的抗體的免疫測定通常需要使用在測試中顯示對抗體具有特定免疫反應(yīng)性的試劑(抗原)。取決于測定的形式，這種抗原可以固定在固體支持物上。使待測試抗體存在的樣品與該抗原接觸，如果該羊皮中存在具有所需免疫特異性的抗體，則這些抗體將與該抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，以形成可以隨后檢測或定量測量的抗體-抗原復(fù)合物。本發(fā)明的方法的特征在于針對多種不同的抗原量(本文中也稱為滴定系列)對待測試該抗體存在的標(biāo)準(zhǔn)化樣品進(jìn)行測試。針對至少兩種、優(yōu)選至少三個、四個、五個、六個或七個不同的抗原量測試樣品。典型的測定可以包括一個不含任何抗原的陰性對照。在本上下文中，術(shù)語“抗原”指包含至少一個能與想要檢測的靶抗體特異性相互作用的抗原決定簇或表位的物質(zhì)，或者任何與該抗體可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)特異性相互作用的俘獲劑。該抗原一般是天然存在的或合成的生物大分子，例如蛋白或肽、多糖或核酸，并且可以包括抗體或其片段，例如抗獨特型抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在本發(fā)明的方法中，可用于結(jié)合目標(biāo)抗體的抗原決定簇或表位的量在建立滴定系列時是非常重要的。在許多測定形式中，可用于結(jié)合的抗原決定簇或表位的量與存在的抗原分子的量直接相關(guān)。然而，在其他實施方案如某些固相測定系統(tǒng)中，暴露的抗原決定簇或表位的量可以不與抗原量直接相關(guān)，而是可能取決于其他因素，如對固體表面的附著等。在這些實施方案中，本文中提到滴定系列中的“不同抗原量”可以指不同量的抗原決定簇或表位。對使用的每個不同抗原(抗原決定簇或表位)量確定抗體和抗原之間特異性結(jié)合的相對或絕對量，并用于對每個測試抗原量繪制或計算特異性結(jié)合的(相對或絕對)量對抗原量的曲線。例如，在附圖中展示了檢測多種不同抗體的典型結(jié)果?；谠诿總€抗原量下觀察到的特異性結(jié)合量確定測試樣品中與用于測定的抗原具有反應(yīng)性的抗體的存在，一般表示為總體為S形或反S型的曲線。抗體與抗原之間特異性結(jié)合的絕對量一般并不重要，除非需要進(jìn)行定量測量。對于簡單的關(guān)于抗體存在與否的“是/否”確定，只要產(chǎn)生形狀正確的曲線就夠了。如果可檢測的結(jié)合在不同的測試抗原量中沒有變化，那么可將其評為不存在可檢測量的抗體。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，該方法是非定量的。因此使用獨立于信號強(qiáng)度的無量綱的比例關(guān)系可以給出關(guān)于抗體是否存在的“是/否”確定。需要時，可以從抗原滴定測定的結(jié)果中得出對于存在于特定樣品中的抗體量的測定量。本發(fā)明的方法可有利地用于臨床診斷、預(yù)后、預(yù)測和/或監(jiān)測測定，其中存在的靶抗體的絕對量可以在患者和患者之間有巨大的變化。本發(fā)明人觀察到，如果這樣的測定是基于使用測試抗體的單個量/濃度來檢測抗體結(jié)合，則含有處于群體中抗體量正常生理范圍的極低端和極高端的抗體量的患者樣品可能就會由于測定方法的局限性而被錯過；抗體量低的樣品可能評為假陰性結(jié)果，而抗體水平極高的樣品可能超出選定的測定方法的準(zhǔn)確檢測范圍。
本發(fā)明的滴定測定方法還特別適于檢測作為疾病狀態(tài)或易感性生物標(biāo)志物的抗體/自身抗體，其中抗體/自身抗體對靶抗原的特異性和親和力在患者和患者之間有相當(dāng)可觀的變化。自身抗體應(yīng)答因其本性可在患者和患者之間存在非常顯著的差異，存在的自身抗體絕對量和自身抗體的特異性/親和力都會存在差異。本發(fā)明的方法可以考慮這樣的患者與患者之間的差異，因此使得可以開發(fā)用于任何給定抗體/自身抗體的標(biāo)準(zhǔn)測定形式。自身抗體與其靶抗原之間的相互作用一般是低親和力的，但如上所述，結(jié)合的強(qiáng)度在患者和患者之間可能不同。本發(fā)明的方法特別適于檢測低親和力結(jié)合，因為從滴定曲線的形狀可以推斷出陽性結(jié)果。本發(fā)明的方法還提供在進(jìn)行用于診斷、預(yù)后和/或監(jiān)測(疾病狀態(tài)或治療)目的的自身抗體/抗體檢測時針對每日變化的安全措施。當(dāng)進(jìn)行在包含患者體液的樣品中檢測抗體的免疫測定時，經(jīng)?？梢杂^察到可觀的信號強(qiáng)度每日變化。例如，這樣的變化可能是由于測試前樣品的獲得和儲存方式差異而產(chǎn)生。這樣的因素使得難于確定地對臨床測定結(jié)果進(jìn)行評價，例如基于簡單的抗體/抗原結(jié)合閾值來評價。本發(fā)明使這樣的每日變化的影響盡可能小，因為從獨立于信號強(qiáng)度的滴定曲線形狀得到的陽性結(jié)果是十分明顯的。本發(fā)明方法其他優(yōu)點在于它允許稀釋患者樣品而仍然產(chǎn)生一致的結(jié)果，以及它能利用一個個體中不同來源的體液(例如血液或血清與腹水或胸腔積液相比)產(chǎn)生相同的定性篩選結(jié)果(陽性/陰性)，盡管在不同流體中抗體的絕對濃度可能不同。本發(fā)明的方法可以用能使懷疑含有抗體的樣品與多種不同量的抗原接觸的任何適當(dāng)形式進(jìn)行。方便地，該樣品與不同抗原量的接觸可以在分開但平行的反應(yīng)室如微孔板的孔中進(jìn)行。通過在微孔板的孔中制備來自抗原原液的連續(xù)稀釋將不同的抗原量包被在微孔板的孔上。該抗原原液的濃度可以已知或未知。然后可將測試樣品的等分試樣加入該板的孔中，使測試樣品的體積和稀釋度在每個孔中保持一致。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，加入微孔板孔中的抗原絕對量可以取決于諸如靶抗體的性質(zhì)、測試樣品的性質(zhì)、測試樣品的稀釋度等因素而變化。通常選擇抗原量和樣品稀釋度以便產(chǎn)生信號強(qiáng)度范圍，所述強(qiáng)度范圍落入選擇用于在該方法中檢測抗體/抗原結(jié)合的可接受的讀出檢測范圍內(nèi)。測試懷疑含有抗腫瘤標(biāo)志物自身抗體的人血清樣品的典型量和稀釋度在隨后的實施例中給出。方便地，測試的抗原量可以在0. 01 u g/ml到IOiI g/ml的范圍內(nèi)變化。如上所述，甚至當(dāng)原液中抗原的絕對濃度未知時，也有可能從單個抗原原液開始構(gòu)造滴定曲線。倘若使用同樣的單個原液溶液并以同樣的方式進(jìn)行連續(xù)稀釋，就可能在不同的起始測試樣品上對這一抗原分別進(jìn)行的滴定測定結(jié)果進(jìn)行比較。在其他實施方案中，可將不同的抗原(抗原決定簇或表位)量固定在固體支持物上離散的位置或反應(yīng)位點上。然后可以使整個支持物與測試樣品接觸，并在每個離散的位置或反應(yīng)位點上分別檢測或測量抗體與抗原的結(jié)合。合適的固體支持物也包括微陣列，例如陣列上的離散位點或點上含有不同抗原量的陣列。微陣列可以通過將不同量的特定抗原固定在陣列上離散的、可分辨的反應(yīng)位點處來制備。在其他的實施方案中，固定的抗原分子實際量可以保持基本恒定，但陣列上位點或點的大小是可變的，以便改變可利用的結(jié)合表位的量，由此提供可利用的結(jié)合表位量不同的位點或點的滴定系列。在這樣的實施方案中，在制備滴定系列時，重要的是抗原上結(jié)合表位的二維表面濃度，而非抗原的絕對量。制備和探詢蛋白質(zhì)/肽微陣列的技術(shù)是本領(lǐng)域普遍已知的。 從以上討論中將會理解，在本發(fā)明所有的實施方案中，抗原量的變化可以通過改變測試樣品所用的抗原或表位的密度、通過維持抗原或表位密度但增加固定抗原的表面面積或者通過二者同時來實現(xiàn)。微陣列可以用于在單個樣品上平行進(jìn)行不同特異性的抗體的多重測定。這可以通過使用包括多組不同抗原的陣列來實現(xiàn)，每組包括多種不同量或濃度的抗原。術(shù)語“不同抗原”包括來自不同蛋白質(zhì)或多肽(例如來自由不同基因編碼的無關(guān)蛋白質(zhì))的抗原以及來自單個蛋白質(zhì)或多肽中不同肽表位的抗原。給定的微陣列可以僅包含來自不同蛋白質(zhì)或多肽的不同抗原組，或者僅包含來自單個蛋白質(zhì)或多肽中不同肽表位的抗原組，或者兩者以任何比例混合。應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明任何實施方案中不同量或不同濃度的每組單獨的抗原一般僅包括一種抗原而不是其混合物。涉及用本發(fā)明方法測試抗體存在的材料時，本文使用的術(shù)語“體液”包括血漿、血清、全血、尿、汗、淋巴、糞便、腦脊髓液、腹水、胸腔積液、精液、痰、乳頭抽吸液、手術(shù)后血清腫或傷口排出液。如上所述，本發(fā)明的方法優(yōu)選在包含取自測試受試者的體液的測試樣品上體外進(jìn)行。所用體液的類型可以根據(jù)待測抗體的身份和應(yīng)用測定的臨床狀況而變化。通常該測定優(yōu)選在血清和血漿樣品上進(jìn)行。測試樣品還可包括體液以外的組分，例如稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑等。術(shù)語“抗原”在本文中以廣義使用，指顯示出對待檢測抗體有特異性免疫反應(yīng)性的任何物質(zhì)。合適的抗原可以包括但不限于天然存在的蛋白質(zhì)、重組或合成蛋白質(zhì)或多肽、合成肽、肽模擬物等，還包括多糖和核酸。特別地，本文使用“抗原”時，其旨在包括能與待檢測抗體的可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)特異性免疫相互作用的任何俘獲劑，無論是人來源、哺乳動物來源還是其它來源。例如，抗獨特型抗體可以認(rèn)為是用于這種目的的抗原，如噬菌體展示產(chǎn)生的抗原。某些抗原可以包含或來自于從自然來源分離的蛋白質(zhì)或多肽，包括但不限于從患者組織或體液分離的蛋白質(zhì)或多肽。在這樣的實施方案中，抗原可以基本上包括所有天然存在的蛋白質(zhì)，即基本上處于從自然來源分離時的形態(tài)的蛋白質(zhì)，或者可以包括天然存在蛋白質(zhì)的片段。為了在本發(fā)明方法中像抗原那樣有效，任何這樣的“片段”都必須保留對測試所用抗體的免疫反應(yīng)性。例如，可以通過該分離的蛋白質(zhì)的化學(xué)或酶促切割來制備合適的片段。取決于準(zhǔn)備使用的測定的精確性質(zhì)，該抗原可包含與一種或多種其它分子連接的天然存在蛋白質(zhì)或其片段，所述分子傳遞該蛋白質(zhì)中非天然存在的一些理想特征。例如，蛋白質(zhì)或片段可以與顯示標(biāo)記(revealing label)綴合，例如熒光標(biāo)記、有色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、放射性示蹤劑或重金屬如膠體金。在其它的實施方案中，蛋白質(zhì)或片段可以表達(dá)為融合蛋白。例如，融合蛋白可以在N-或C-端包含標(biāo)記肽，以幫助純化重組表達(dá)的抗原。取決于要使用的測定形式，抗原可以固定在固體支持物上，例如微孔板的孔、微陣列珠或芯片或磁珠上?？梢酝ㄟ^非共價吸附或共價附著來實現(xiàn)固定。任何適當(dāng)?shù)母街椒ǘ伎梢允褂?，只要其不對抗原與靶抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的能力產(chǎn)生不利影響。 本發(fā)明并不局限于固相測定，還可以包括部分或全部在液相中進(jìn)行的測定，例如溶液相珠測定。在一個實施方案中，抗原可以用方便固定的配體如生物素進(jìn)行標(biāo)記。然后將抗原稀釋到合適的滴定范圍，接著與溶液中患者樣品里的自身抗體反應(yīng)。接著可將得到的復(fù)合物通過配體-受體相互作用(例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白)固定在固體支持物上，剩余的測定根據(jù)以下描述實施。為方便產(chǎn)生用于本發(fā)明測定方法的生物素化抗原，編碼全長抗原、其截短形式或其抗原片段的cDNA可以表達(dá)為用蛋白質(zhì)或多肽標(biāo)簽標(biāo)記的融合蛋白，其中生物素輔因子可以通過酶反應(yīng)附著在該標(biāo)簽上?？蓮亩鄠€來源購得用于生產(chǎn)重組生物素化抗原的載體。如所附實施例所示，使用生物素化抗原滴定曲線方法的其他好處是該測定方法能夠區(qū)分生物素組分與抗生物素抗體的結(jié)合以及真正的抗原與其同族抗體的結(jié)合。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，顯著數(shù)量的人群體天然產(chǎn)生抗生物素抗體，其可能在基于使用生物素化抗原的測定中導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。如上所述，用于檢測本發(fā)明抗體的“免疫測定”可以基于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，只是使用多種抗原量創(chuàng)建滴定曲線。在非常優(yōu)選的實施方案中，免疫測定可以是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。ELISA是本領(lǐng)域普遍公知的。在典型的“間接"ELISA中，將在測試中對抗體具有特異性的抗原固定在固體表面(例如標(biāo)準(zhǔn)微孔測定板的孔，或者微珠或微陣列的表面)，并且使用于測試抗體存在的包含體液的樣品與固定的抗原接觸。存在于樣品中的具有所需親和力的任何抗體將與固定的抗原結(jié)合。接著可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒z測結(jié)合的抗體/抗原復(fù)合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用標(biāo)記的第二抗人免疫球蛋白抗體檢測抗體/抗原復(fù)合物，所述抗體其可特異性識別一種或多種人免疫球蛋白類別共有的表位。第二抗體一般為抗IgG或抗IgM。第二抗體通常用檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，一般為酶標(biāo)記如過氧化物酶或堿性磷酸酶，其允許通過加入該酶的底物而進(jìn)行定量檢測，該酶產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物，例如有色的、化學(xué)發(fā)光的或熒光的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的其它類型檢測標(biāo)記可以等效地使用。本發(fā)明涉及作為疾病狀態(tài)或疾病易感性生物標(biāo)志物的抗體的檢測方法。本發(fā)明的這一特定方面優(yōu)選地排除設(shè)計用于測試由于除了接種癌癥標(biāo)志物以外的疫苗攻擊或免疫操作而產(chǎn)生的抗體的測定方法。所以，本發(fā)明此方面的測定優(yōu)選地不包括被設(shè)計用于測試接種/免疫后抗病毒或抗菌抗體存在情況的測定方法。在本發(fā)明的某些實施方案中，抗體可以是自身抗體。如上所述，術(shù)語“自身抗體”指針對個體的免疫系統(tǒng)識別為外源的抗原的天然存在抗體，即使該抗原實際上源自該個體。自身抗體包括針對由患病細(xì)胞產(chǎn)生的或在疾病過程中產(chǎn)生的天然存在蛋白質(zhì)改變形式的抗體。蛋白質(zhì)的改變形式源自該個體，但可被該個體的免疫系統(tǒng)視為“非自身”，并由此在此個體中以對該改變蛋白質(zhì)具有免疫特異性的自身抗體的形式引發(fā)免疫應(yīng)答。這樣的蛋白質(zhì)改變形式可以包括，例如任選地伴有二級、三級或四級結(jié)構(gòu)變化的氨基酸序列改變的突變體、截短形式、剪接變體、改變的糖型(glycoform)等。在其它實施方案中，自身抗體可以針對在疾病狀態(tài)中由于基因擴(kuò)增或異常轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)而過表達(dá)的蛋白質(zhì)。免疫系統(tǒng)細(xì)胞在正常情況下不會遇到的顯著量的過表達(dá)蛋白質(zhì)可觸發(fā)導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。在其他實施方案中，該自身抗體可以針對在疾病狀態(tài)中開始表達(dá)的蛋白質(zhì)的胎兒形式。如果僅在免疫系統(tǒng)起作用前的發(fā)育早期正常表達(dá)的胎兒蛋白質(zhì)開始在疾病狀態(tài)中表達(dá)，則該胎兒形式可能被免疫系統(tǒng)識別為“外源”，由此觸發(fā)導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，該抗體可以是對腫瘤標(biāo)志物蛋白具有特異性的自身抗體，更 具體地是“癌癥相關(guān)的”抗腫瘤自身抗體。術(shù)語“癌癥相關(guān)”的抗腫瘤自身抗體指針對腫瘤標(biāo)志物蛋白形式上存在的表位的自身抗體，所述腫瘤標(biāo)志物蛋白在癌疾病狀態(tài)下優(yōu)先表達(dá)。這樣的自身抗體的存在是癌癥疾病狀態(tài)的特征，或是無癥狀患者中易患癌癥體質(zhì)的特征。在優(yōu)選的應(yīng)用中，本發(fā)明的方法將用于檢測人類受試者或患者中癌癥相關(guān)抗腫瘤自身抗體的存在，最優(yōu)選采取體外免疫測定的形式，在包含取自該受試者/患者的體液樣品的測試樣品上進(jìn)行。在測試前，該體液樣品可以在合適的緩沖液中稀釋或經(jīng)處理以便長期保存。體外免疫測定是非侵襲性的，并且可以根據(jù)需要重復(fù)以便在疾病發(fā)作前篩選“具有風(fēng)險”的個體時或者在整個疾病過程中(以下將結(jié)合該方法優(yōu)選的應(yīng)用進(jìn)一步討論)建立患者自身抗體產(chǎn)生譜。在具體但非限制性的實施方案中，本發(fā)明的方法可以(同時)包括針對兩種或更多類型自身抗體的免疫測定，每種自身抗體對相同或相關(guān)腫瘤標(biāo)志物蛋白(例如由單個基因編碼的不同的同種型或變體)上的不同表位具有特異性，或者對不同腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)(指由不同基因編碼的蛋白質(zhì))上的表位具有特異性。這些方法一般包括使用具有兩組或更多組抗原的板，每組抗原通常源自不同的腫瘤標(biāo)志物蛋白(在此上下文中不同意味著蛋白質(zhì)是不同基因的產(chǎn)物)，盡管上文已經(jīng)指出一組抗原也可能包括在同一腫瘤標(biāo)志物蛋白上的不同表位。一組抗原指在本發(fā)明的方法中在不同量/濃度下測試的單個抗原。這些方法(在下文中可稱為“板測定”)利用一個具有兩組或更多組抗原的板來監(jiān)測個體對腫瘤或其它致癌性/腫瘤性變化的總體免疫應(yīng)答。由此，這些方法檢測給定個體中免疫應(yīng)答的“譜”，指示哪種腫瘤標(biāo)志物引發(fā)導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。使用具有兩組或更多組抗原的板來監(jiān)測針對兩種或更多不同腫瘤標(biāo)志物的自身抗體的產(chǎn)生通常比檢測針對單個標(biāo)志物的自身抗體更靈敏，并且給出低得多的假陰性結(jié)果頻率(參閱W099/58978和W02004/044590，其內(nèi)容以其整體以參考方式并入本文)。因此，在非限制性的實施方案中，本發(fā)明提供在包含來自哺乳動物的體液的測試樣品中檢測兩種或更多抗體的方法，其中至少一種所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物,該方法包括(a)使該測試樣品接觸兩組或更多組抗原，其中每一組所述抗原對測試樣品中的一種待檢測抗體具有特異性，并且其中每一組抗原包括該抗原的多個不同的量，(b)檢測該抗體和該抗原之間特異性結(jié)合的量，以及(c)對步驟(a)中所用的每一組抗原，繪制或計算特異性結(jié)合量對抗原量的曲線。在一個實施方案中，所述兩種或更多種抗體的每一種是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物，然而，將疾病標(biāo)志物抗原的滴定測定與同一測試樣品中其它類型抗體(是或不是疾病標(biāo)志物均可)的滴定測定組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。無論如何，對相關(guān)抗體在測試樣品中是否存在的判斷是基于測試中每種不同抗原在每個不同抗原濃度下觀察到的特異性結(jié)合的量，換言之，是基于每個抗原的集合值而不 是每種抗原的單個濃度下的讀數(shù)。因此，基于存在兩種或更多種類型抗體來確定患者樣品中是否存在疾病狀態(tài)或疾病易感性或者外源物質(zhì)的抗體可以是基于每種抗原的這些集合值。優(yōu)選地，基于測試中存在的任何或所有抗原呈現(xiàn)為總體呈S形或反S型的曲線作出判斷。為消除疑問，基于使用單個抗原類型以檢測抗體的測定在本文中可稱為“單標(biāo)志物測定”，而基于使用具有兩種或更多種抗原的板的測定稱為“板測定”。本發(fā)明的方法作為單標(biāo)志物測定或板測定的一部分適用于檢測基本上任何腫瘤標(biāo)志物蛋白的自身抗體，對于該腫瘤標(biāo)志物蛋白可以制備合適的抗原。具體地，該方法適用于檢測/測量以下蛋白質(zhì)的自身抗體表皮生長因子受體蛋白EGFR(Downward等(1984)Nature. 307 :521-527 ；Robertson 等(2001)Archives of Pathology and LaboratoryMedicine 126 ; 177-81)、糖蛋白 MUCl (Batra, S. 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/Jn o例如，當(dāng)該免疫測定方法用于癌癥診斷時，將與“正?！睂φ諅€體相比自身抗體水平的提高作為個體患有癌癥的指示?！罢！睂φ諅€體優(yōu)選為基于臨床、影像和/或生化標(biāo)準(zhǔn)未診斷為癌癥的年齡匹配的對照。當(dāng)該免疫測定方法用于預(yù)測癌癥患者對抗癌治療(例如疫苗接種、抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療、化學(xué)治療)的應(yīng)答時，可將與“正常”對照個體相比自身抗體水平的提高作為個體是否可能應(yīng)答于該抗癌治療的指示。“正?！睂φ諅€體優(yōu)選為基于臨床、影像和/或生化標(biāo)準(zhǔn)未診斷為癌癥的年齡匹配的對照。對于每一種上文列出的治療，自身抗體與對照相比的水平與成功治療可能性之間的關(guān)系可以通過觀察這些治療在患者中的結(jié)果而建立，所述患者的自身抗體狀態(tài)在整個治療過程中被監(jiān)測?；趯ψ陨砜贵w狀態(tài)的評估，可以使用先前建立的關(guān)系預(yù)測每種治療在給定患者中成功的可能性。
當(dāng)免疫測定方法用于監(jiān)測癌癥或其它腫瘤疾病在患者中的發(fā)展時，將與“正常對照”相比自身抗體水平的提高作為患者中癌癥存在的指示?！罢φ铡笨梢允菍φ諅€體中存在的自身抗體的水平，優(yōu)選基于臨床、影像和/或生化標(biāo)準(zhǔn)未診斷為癌癥的年齡匹配的對照個體中的水平?；蛘撸摗罢φ铡笨梢允菍y試中特定患者建立的“基線”水平。例如，“基線”水平可以是在作出第一次癌癥診斷或復(fù)發(fā)癌癥診斷時存在的自身抗體水平?；€水平以上的任何提高可以作為患者中癌癥數(shù)量增加的指示，反之，基線以下的任何降低可以作為患者中癌癥數(shù)量減少的指示。例如，“基線”值也可以是新治療開始前的水平。自身抗體水平的變化可以作為治療有效性的指示。指示對治療陽性應(yīng)答的“變化”方向(即提高與降低)將取決于該治療確切的性質(zhì)。對于任何給定的治療，可以容易地確定指示陽性結(jié)果的自身抗體水平“變化”方向，例如通過監(jiān)測與應(yīng)答于該治療的群體臨床或生化指示相比較的自身抗體水平。當(dāng)該免疫測定方法用于篩選無癥狀人受試者群體時，這可以是鑒定發(fā)生癌癥的風(fēng)險提高的受試者，與“正常”對照個體相比自身抗體水平提高的個體鑒定為具有發(fā)生癌癥的“風(fēng)險”?！罢！睂φ諅€體優(yōu)選為未被鑒定為具有任何發(fā)生癌癥的趨勢的或任何顯著提高的 發(fā)生癌癥風(fēng)險的年齡匹配對照。一個例外可能是年齡本身就是主要的風(fēng)險因素。當(dāng)該免疫測定方法用于篩選無癥狀人受試者群體時，這可以是在已發(fā)生癌癥的受試者中診斷癌癥，與“正?！睂φ諅€體相比自身抗體水平提高的個體被評為具有癌癥或一些腫瘤性變化形式?！罢！睂φ諅€體優(yōu)選為未被鑒定為具有任何發(fā)生癌癥的趨勢的或任何顯著提高的發(fā)生癌癥風(fēng)險的年齡匹配對照。一個例外可能是年齡本身就是主要的風(fēng)險因素?；蛘?，“正常對照”可以是對測試中特定患者建立的“基線”水平。例如，“基線”水平可以是在患者第一次接受測試并發(fā)現(xiàn)水平不超過“正常對照”群體水平時存在的自身抗體水平。其后在此基線測量值上的任何提高均可作為該個體存在癌癥的指示。這樣，個體可以通過這樣的基線測試稱為用于將來自身抗體測量的其自身對照。當(dāng)該免疫測定方法用于監(jiān)測癌癥患者對抗癌治療(例如疫苗接種、抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療、化學(xué)治療)的應(yīng)答時，將治療后自身抗體水平的改變作為該患者對該治療有陽性應(yīng)答的指示?？蓪⒅委熼_始前自身抗體的基線水平用于比較目的，以確定治療是否引起自身抗體水平的“提高或降低”。自身抗體水平的變化可作為治療有效性的指示。指示對治療有陽性應(yīng)答的“改變”方向(即提高與降低)將取決于該治療的確切性質(zhì)。對于任何給定的治療，可以容易地確定指示陽性結(jié)果的自身抗體水平“變化”方向，例如通過監(jiān)測應(yīng)答于該治療的其他臨床或生化指示相比的自身抗體水平。本發(fā)明的方法可以用于預(yù)測和/或監(jiān)測個體對基本上任何已知抗癌治療的應(yīng)答。這包括如人抗體治療，其中將單克隆或多克隆抗體輸注到患者中，非限制性的具體實例為使用抗生長因子抗體 Herceptin 進(jìn)行治療(Baselga, J. , D. Tripathy 等，J Clin Oncol.,14(3)，737-744，1996)。天然自身抗體應(yīng)答的存在可增強(qiáng)或抑制人工輸注治療性抗體進(jìn)行治療的有效性。使用本發(fā)明的方法，有可能將任何患者或患者組中療程前后的自身抗體的天然水平與對任何抗癌治療(包括抗體治療)相關(guān)聯(lián)。其后這一認(rèn)識可以繼而用于預(yù)測其它患者(或者在重復(fù)治療情況下的同一患者)將如何應(yīng)答于同樣的治療。當(dāng)該免疫測定用于檢測復(fù)發(fā)性疾病時，將與“正常對照”相比患者中自身抗體水平的提高作為疾病已經(jīng)復(fù)發(fā)的指示?！罢φ铡笨梢允菍φ諅€體中存在的自身抗體水平，優(yōu)選基于臨床、影像和/或生化標(biāo)準(zhǔn)未診斷為癌癥的年齡匹配的對照。或者，“正常對照”可以是對測試中特定患者建立的“基線”水平。例如，該“基線”水平可以是基于臨床、影響和/或生化標(biāo)準(zhǔn)處于疾病緩和期時存在的自身抗體水平。本發(fā)明的測定方法可用于檢測許多不同類型的癌癥，其實例為乳腺、膀胱、結(jié)腸直腸、前列腺、肺、胰腺和卵巢的癌癥。該測定方法可以作為現(xiàn)有篩選和監(jiān)控方法的補(bǔ)充。例如，在原發(fā)性乳腺癌的情況下，自身抗體的免疫測定可以提醒臨床醫(yī)生比計劃更早地對乳房X線照片上從放射照相角度看來并不可疑的小損傷進(jìn)行活檢，或者進(jìn)行乳房成像，或者進(jìn)行重復(fù)成像。在臨床上，預(yù)計本發(fā)明的測定方法比目前其成功取決于操作者的成像技術(shù)(如乳房X線照相術(shù)和超聲)更客觀和具有更好的重現(xiàn)性?！鞍鍦y定”可以根據(jù)特定的臨床應(yīng)用定制。至少測定p53和c_erbB2的自身抗體的抗原板對許多癌癥類型特別有用，并且可以任選地補(bǔ)充其它已知與待檢測的特定癌癥或該特定癌癥的一個階段相關(guān)的標(biāo)志物。例如，對于乳腺癌，該板可以包括MUCl和/或c-myc和/或BRCAl和/或BRCA2和/或PSA ;而對于膀胱癌，該板可以任選地包括MUCl和/或 c-myc ;對于結(jié)腸直腸癌為ras和/或APC ;對于前列腺癌為PSA和/或BRCAl和/或BRCA2 ；或者對于卵巢癌為BRCAl和/或BRCA2和/或CA125。在其它優(yōu)選的實施方案中，p53或c-erbB2并非是必須的。在乳腺癌的情況下，合適的板可選自p53 和 MUCl，任選地具有 c_erbB2 和 / 或 c-myc 和 / 或 BRCAl 和 / 或 BRCA2 和 /或 PSA 和 / 或 NY-ES0-1 和 / 或 BRCl ;p53 和 c-myc，任選地具有 c_erbB2 和 / 或 MUCl 和 / 或 BRCAl 和 / 或 BRCA2 和 /或 PSA 和 / 或 NY-ES0-1 和 / 或 BRCl ;p53和BRCAl，任選地具有c_erB2和/或MUCl和/或ciyc和/或BRCA2和/或PSA 和 / 或 NY-ES0-1 和 / 或 BRCl ;p53 和 BRCA2，任選地具有 c_erbB2 和 / 或 MUCl 和 / 或 c-myc 和 / 或 BRCAl 和 /或 PSA 和 / 或 NY-ES0-1 和 / 或 BRCl ;c-erbB2 和 MUCl，任選地具有 p53 和 / 或 c-myc，和 / 或 BRCAl 和 / 或 BRCA2 和 /或 PSA 和 / 或 NY-ES0-1 和 / 或 BRCl ;c-erbB2 和 c-myc,任選地具有 p53 和 / 或 MUCl 和 / 或 BRCAl 和 / 或 BRCA2 和 /或 PSA 和 / 或 NY-ES0-1 和 / 或 BRCl ;c-erbB2 和 BRCAl，任選地具有 p53 和 / 或 MUCl 和 / 或 c-myc 和 / 或 BRCA2 和 /或 PSA 和 / 或 NY-ES0-1 和 / 或 BRCl ;c-erbB2 和 BRCA2,任選地具有 p53 和 / 或 MUCl 和 / 或 c-myc 和 / 或 BRCAl 和 /或 PSA ；p53、c-myc、NY-ES0-1 和 BRCA2。在結(jié)腸直腸癌的情況下，合適的板可選自例如p53 和 ras，任選地具有 c_erbB2 和 / 或 APC ；p53 和 APC，任選地具有 c-erbB2 和 / 或 Ras ；Ras和APC，任選地具有p53和/或c_erbB2，這樣的板也可包括CEA或CA19-9。
在前列腺癌的情況下，合適的板可選自例如p53 和 PSA，任選地具有 BRCAl 和 / 或 BRCA2 和 / 或 c_erbB2 ；c-erbB2 和 PSA，任選地具有 p53 和 / 或 BRCAl 和 / 或 BRCA2 ；PSMA, PSCA和激肽釋放酶。在卵巢癌的情況下，合適的板可選自例如p53 和 CA125，任選地具有 c_erbB2 和 / 或 BRCAl 和 / 或 BRCA2 ；c-erbB2 和 CA125，任選地具有 p53 和 / 或 BRCAl 和 / 或 BRCA2 ；HER2、膜聯(lián)蛋白、CAGE 和 4-5。
在肺癌的情況下，合適的板可選自p53和NY-ES0-1，任選地具有其他標(biāo)志物；HER2、膜聯(lián)蛋白、CAGE 和 4-5。當(dāng)本發(fā)明的方法用于進(jìn)行基于來自不同蛋白質(zhì)的兩種或更多腫瘤標(biāo)志物抗原的“板測定”時，板上的至少一種抗原必須在本發(fā)明基于多個不同量形成滴定曲線的測定中進(jìn)行測試。優(yōu)選地，每種形成該板的抗原均根據(jù)本發(fā)明測定進(jìn)行測試，并對板上每種單獨的抗原繪制/計算滴定曲線。本發(fā)明還設(shè)想，用于測定至少一種抗腫瘤標(biāo)志物抗體的滴定測定可以與設(shè)計用于檢測同一患者樣品中至少一種腫瘤標(biāo)志物蛋白(其可以與或不與滴定測定方法中所用抗原有關(guān))的測定方法組合。這樣，對抗腫瘤標(biāo)志物自身抗體的測定與對腫瘤標(biāo)志物蛋白的測定可以在單個患者樣品上平行進(jìn)行。在另一實施方案中，本發(fā)明的免疫測定法可用于選擇用于特定患者的抗癌疫苗。在這一實施方案中，用具有兩種或更多抗原的板測試取自該患者的體液樣品，每種抗原對應(yīng)于不同的腫瘤標(biāo)志物蛋白，以確定該患者對每種不同的腫瘤標(biāo)志物蛋白免疫應(yīng)答的相對強(qiáng)度。對一種或多種給定腫瘤標(biāo)志物蛋白的“免疫應(yīng)答強(qiáng)度”由該免疫測定檢測到的此腫瘤標(biāo)志物蛋白特異性癌癥相關(guān)自身抗體的存在和/或量來指示；其中定量自身抗體，癌癥相關(guān)自身抗體的水平越聞，免疫應(yīng)答就越強(qiáng)。接著選擇鑒定為在患者中引起最強(qiáng)免疫應(yīng)答或強(qiáng)應(yīng)答(即自身抗體水平最高)的一種或多種腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)形成用于該患者的抗癌疫苗的基礎(chǔ)。本發(fā)明方法的效用不僅限于檢測抗腫瘤自身抗體，盡管該測定對此目的特別有用。癌癥僅是檢測自身抗體可用作疾病狀態(tài)/疾病易感性生物標(biāo)志物的疾病的一個實例。本發(fā)明已經(jīng)顯示了其顯著優(yōu)點在于使用滴定法在患者樣品中檢測自身抗體。因此，有理由得出這樣的結(jié)論，可以通過使用滴定法檢測作為除癌癥以外其它疾病的生物標(biāo)志物的自身抗體來得到類似的優(yōu)點。因此，該方法可用于檢測作為疾病狀態(tài)或疾病易感性生物標(biāo)志物的任何自身抗體，其中所述該疾病已經(jīng)(或能夠)顯示出與自身抗體的產(chǎn)生相關(guān)。本發(fā)明方法的其它應(yīng)用包括但不限于檢測作為自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性甲狀腺炎(例如橋本甲狀腺炎)、自身免疫性胃炎(例如惡性貧血)、自身免疫性腎上腺炎(例如艾迪生病)、自身免疫性甲狀旁腺功能減退、自身免疫性糖尿病(例如I型糖尿病)或重癥肌無力的生物標(biāo)志物的自身抗體，在患者樣品中篩選導(dǎo)致器官功能不全或衰竭的腎病或肝病以及篩選移植后的患者樣品以檢測針對患病組織(其在移植后留在原位)或移植組織的抗體的存在情況。
本發(fā)明的另一個方面涉及在包含來自哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測抗體的方法，其中所述抗體針對引入所述哺乳動物受試者的外源物質(zhì)，該方法包括(a)使該測試樣品接觸不同量的該抗體特異性抗原，(b)檢測該抗體和該抗原之間特異性結(jié)合的量，以及(c)對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結(jié)合量對該抗原量的曲線。優(yōu)選地，在本發(fā)明的這個實施方案中，該方法還包括步驟(d)基于在每個所用的不同抗原濃度下該抗體和該抗原之間特異性結(jié)合的量(換言之，觀察到的每個特定抗原的集合值)檢測該抗體的存在情況。優(yōu)選地，通過總體為S形或反S型的曲線指示該測試樣品中存在與測定中所用抗原具有反應(yīng)性的抗體。在本發(fā)明的這一方面中，所述滴定方法可以用于評估哺乳動物受試者(優(yōu)選人受試者)對引入該受試者的任何外源物質(zhì)的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，該外源物質(zhì)可以是治療劑例如藥物或前藥、人類抗體治療或疫苗。本發(fā)明的方法可用于評估對患者施用治療劑是否觸發(fā)了引起抗體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，所述抗體對該治療劑上的表位或與該治療劑一起施用的遞送載體、賦形劑、運載體(carrier)等的組分具有特異性。治療劑的確切性質(zhì)并不對本發(fā)明產(chǎn)生限制。在非限制性的實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于評估對任選地與賦形劑、運載體或遞送載體組合的合成小分子、天然存在的 物質(zhì)、天然存在的或合成產(chǎn)生的生物制劑或上述兩種或多種的任意組合的免疫應(yīng)答。在一個有用的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于評估對治療劑或疫苗的非靶標(biāo)部分的免疫應(yīng)答?！胺前袠?biāo)”部分指施用的治療劑或疫苗的組分部分，在治療劑的情況下，該部分對治療活性無直接貢獻(xiàn)，或者在疫苗的情況下，該部分并不旨在引發(fā)宿主中的抗體產(chǎn)生。例如，存在的非靶標(biāo)部分可有利于治療劑或疫苗的純化，或者可以設(shè)計用于協(xié)助治療劑/疫苗的遞送、攝入或靶向。這樣的“非靶標(biāo)”部分包括但不限于通常附加在重組表達(dá)多肽上的接頭或標(biāo)記，如生物素標(biāo)記、組氨酸標(biāo)簽等。在本發(fā)明此方面的另一個實施方案中，該外源物質(zhì)可以是傳染原，如真菌、細(xì)菌、病毒或寄生蟲。參考以下非限制性實驗實施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明。實施例I-用于在自身抗體測定中滴定抗原的一般方案(生物素化的)腫瘤標(biāo)志物抗原的樣品可以通過重組表達(dá)來制備，遵循W099/58978所述的類似方法。簡言之,將編碼目的標(biāo)志物抗原的cDNA克隆進(jìn)pET21載體(Invitrogen),該載體已經(jīng)修飾以編碼生物素標(biāo)簽和6x組氨酸標(biāo)簽，用于輔助表達(dá)蛋白的純化。得到的克隆在合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞中培養(yǎng)(在包含體內(nèi))，裂解細(xì)菌并變性，通過鎳螯合親和柱(Hi-trap，可購自Amersham，遵循制造商的操作)回收表達(dá)的抗原。表達(dá)的抗原通過在適合的緩沖液中透析而復(fù)性，并通過SDS-PAGE、western印跡和ELISA評估表達(dá)的抗原的產(chǎn)率，并在保存前定量。陰性對照VOL為空載體(即未克隆的cDNA)，其仍然包括組氨酸和生物素標(biāo)簽序列)。
多種標(biāo)志物cDNA的GenBank登記號如下P53 B003596c-myc V00568￡0)6(冊1 2)胞外結(jié)構(gòu)域]\111730NY-ESO NM_001327BRCA2 U43746BRCAl 89-10 :NM_007302。I、抗原和V0L(陰性對照)在0. IM碳酸緩沖液中稀釋至適當(dāng)濃度，然后連續(xù)稀釋 以形成半對數(shù)(semi-log)滴定范圍(見表I)。使用電子多通道移液器將抗原稀釋液以50 u I/孔按照板的設(shè)計分配至Falcon微孔板的行中。蓋上板并在4°C下保存48小時。2、使用自動洗板器將板在PBS+0. 1% tween 20中洗一次，然后在紙巾上拍干。3、用高鹽孵育緩沖液(HSB，PBS+0. 5M NaCl+0. 1%酪蛋白)以200 yl/孔將板封閉I小時或封閉至臨用時(在4°C下加蓋保存)。4、室溫下將血清樣品解凍、振蕩并以1/100在HSB中稀釋。5、倒空板并在紙巾上拍干。使用電子多通道移液器以50 Ul/孔將每種稀釋的血清樣品分配至微孔板的所有孔中。對照抗體以1/1000在HSB中稀釋并分配至最終板的適當(dāng)孔中。蓋上板并在室溫下?lián)u動孵育I. 5小時。6、洗滌步驟用自動洗板器將板在PBS+0. 1% tween 20中洗滌三次，然后在紙巾上拍干。7、以50 iil/孔將綴合辣根過氧化物酶的兔抗人Ig (Jackson，1/10，000在HSB中)分配至微孔板的所有孔中。將綴合HRP的兔抗小鼠Ig (Jackson，1/1000在HSB中)分配至微孔板中含有抗抗原抗體的對照孔中。然后將板在室溫下?lián)u動培養(yǎng)I小時。8、將板像步驟6中那樣洗滌。9、以50 ii I/孔加入預(yù)先制備的TMB底物，并且將板在實驗臺上孵育10分鐘。將板輕輕拍打以便混合。10、使用標(biāo)準(zhǔn)讀板器操作在650nm處測定各孔的光密度。表I:標(biāo)準(zhǔn)板的設(shè)計P53 板
I I 丨 2 丨 3 丨 4 j 5 j 6 I 7 丨 8 j 9 I 10 I 11 丨 12 *
A p53 10 pg/ml c-myc 10 pg/ml NY-ESO 10 pg/ml VOL 10 ]ag/ml B p53 3 iig/mlc-myc 3 p.g/ml NY-ESO 3 ixg/ml VOL 3 iig/ml
~C p53 I iig/mlc-myc I iig/ml NY-ESO I p.g/ml VOL I iig/ml
~D p53 0.3 p.g/mi c-myc 0.3 yig/mlNY-ESO 0.3VOL 0.3 iig/ml
____M/ml__
E p53 0,1 pg/ml c-myc 0.1 yig/ml NY-ESO 0.1VOL 0.1 pg/ml
____pg/ml__
~F p53 0.03 jig/ml c-myc 0,03NY-SSO 0,03VOL 0.03 pg/ml~
___yg/ml__iig/ml__
~G p53 0.01 pg/ml~I c-myc 0. 01 NY-ESO 0.01 VOL 0.01 jig/nil~___pg/ml__pg/ml__
H 破酸緩沖液碳酸緩沖液碳酸緩沖液碳酸緩沖液
BRCA 板
|l|2丨3丨4丨5丨6丨7丨8丨9丨10丨11丨12 _—A — BRCAl 10 iig/ml BRCA2 10 iig/ml ECD-6 10 pg/ral. VOL. 10 jig/mlB BRCAl 3 ^ig/m.l B.RCA2 3 jig/ml ECD-6 3 pg/ml VOL 3 pg/ml~C~~ BRCAl I ug/ml BRCA2 I ]ig/ml ECD-6 I jig/ml VOL I pg/ml~D BRCAl 0.3 iig/ml~~BRCA2 . 0 . 3 iig/ml 1ECD-S 0.3 ug/ml I VOL 0.3 iig/ml~E BRCAl 0.1 ug/ml~~BRCA2 0.1 pg/ml ECD-6 0.1 jig/ml~~VOL 0.1 jig/ral~~F BRCAl 0.03BRCA2 0.03ECD-6 0.03VOL 0.03 pg/ml~
__pg/ml__pg/ml__pg/ml__
G" BRCAl 0.01 BRCA2 0.01 ECD-6 0.01 VOU 0.01 yg/ml~ __ug/ml__iig/ml__pg/mi__
H 破酸緩沖液碳酸緩沖液碳酸緩沖液碳酸緩沖液
_3] 實施例2、檢測原發(fā)性乳腺癌中的自身抗體以下數(shù)據(jù)得自評估滴定自身抗體測定在原發(fā)性乳腺癌(PBC)中板的靈敏度和再現(xiàn)性的試驗性研究。該研究包括來自17個無癌癥證據(jù)婦女的血清以及來自20個原發(fā)性乳腺癌婦女手術(shù)前的血清樣品。正常與癌癥樣品的年齡匹配。一個正常樣品和三個癌癥樣品只能除去，因為它們顯示了抗生物素抗體應(yīng)答的證據(jù)，因此不能使用目前的測定形式進(jìn)行評估。群體中的約10%被認(rèn)為會發(fā)生針對生物素的免疫應(yīng)答。根據(jù)實施例I給出的操作使用抗原p53、c-myc、NY-ES0-1和BRCA2進(jìn)行測定。圖I給出了該抗原滴定測定用于測量血清中p53自身抗體時所得曲線的實例?？梢钥闯觯┌Y患者的血清17766(C)以特征性反S型曲線的方式與測試抗原(p53)強(qiáng)烈結(jié)合，但不與陰性對照VOL結(jié)合。相比之下，來自正常個體的血清18052 (N)沒有給出與測試抗原或陰性對照結(jié)合的滴定曲線。自身抗體水平表達(dá)為由于結(jié)合測試抗原產(chǎn)生的光密度(650nm)減去由于結(jié)合陰性對照(VOL)而產(chǎn)生的光密度。正常的截止值計算作為正常組的95% (平均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差)。在圖2中該點以點劃線顯示，其中將正常個體中抗p53自身抗體水平與癌癥患者進(jìn)行比較?？梢姲┌Y組顯示出通常較高的自身抗體水平，并且水平在截止值以上的個體的比例也較聞。板由四種抗原組成p53、c-myc、NY-ES0-1和BRCA2。單個測定的靈敏度在表2中與這種具有四種抗原的板在原發(fā)性乳腺癌檢測中的組合靈敏度(63%) —起給出。
P53~c-mycNY-ES0-1 ~BRCA2
6/17(35% ) 5/17(29% ) 4/17(24% ) 4/17(24% )63%表2 :抗原滴定自身抗體測定的靈敏度。測量了針對四種不同抗原的自身抗體，并且計算了該板的組合靈敏度。截止值水平計算為正常樣品集的平均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差。具有抗生物素抗體應(yīng)答的個體由于不能進(jìn)行評估而被排除。為了評估使用滴定自身抗體測定得到的測量是否可以重現(xiàn)，在分開的三天中進(jìn)行測定，結(jié)果示于表3。如果所有三次結(jié)果一致則認(rèn)為該測定是可重現(xiàn)的。以正常血清進(jìn)行測量的重現(xiàn)性為94% (15/16)，而在乳腺癌樣品中則為88(14/16)。
執(zhí)行執(zhí)行
it常A B C原發(fā)性乳腺癌 ABC
18017-++17733+--
18010---17734 AB+--
18019--，17735-
16020-- 17742+++■ 18021~17743+++
18047-17744+++
18048SB + - +17755- 十 - X3045 - - - 17756 - - - 18050 MD - - 17757 -
1B051-17758ND-
1Q052-17759++ +
18053-- -17766++ +
18054-17774-
IB055-17775 AB + 4- -
1B056 -17776 -
1S057-17777HD
18058- - ~17796-
17797 m + - - 17832+ 十+
X7450 - - -表3 :對p53自身抗體進(jìn)行抗原滴定測定的重現(xiàn)性。在分開的三天中，在來自原發(fā)性乳腺癌患者(PBC)或正常對照的血清樣品上進(jìn)行測定(執(zhí)行A、B和C)。在每日基礎(chǔ)上，截止水平計算為正常樣品集的平均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差。AB表示顯示抗生物素抗體應(yīng)答證據(jù)的個體，不能通過此測定形式進(jìn)行評估。如果所有三次結(jié)果一致則認(rèn)為測定是可重現(xiàn)的。正常個體的重現(xiàn)性為94% (15/16)，而在PBC患者中則為88% (14/16)。實施例3、肺癌中自身抗體的測定在試驗性肺癌研究(10個正常和9個肺癌血漿)中的對2種抗原(p53和NY-ES0)的自身抗體應(yīng)答進(jìn)行分析，顯示檢出率為78% (圖3)。根據(jù)實施例I中的一般方案進(jìn)行該測定，只是使用血漿樣品代替血清。陽性患者樣品表現(xiàn)為與圖I所示類似的反S型滴定曲線。圖3顯示了使用抗原滴定測定測量的正常個體與肺癌患者中P53和NY-ESO自身抗體水平的比較。正常截止值計算正常群體的平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。實施例4、其他滴定曲線 以下其他滴定曲線均在基于實施例I中所述一般方法的測定中產(chǎn)生。結(jié)果顯示該滴定曲線方法可用于在不同類型的體液和不同的疾病(以不同類型的癌癥示例)中檢測許多不同的抗原，并且還展示了本發(fā)明在區(qū)分“真”或“假”陽性結(jié)果上的優(yōu)點。
圖4顯示用于在來自乳腺癌患者的腹水樣品中檢測針對p53和NY-ESO的自身抗體的滴定曲線。測試了該患者，但發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生抗c-myc的自身抗體。圖5顯示用于在來自乳腺癌患者(導(dǎo)管原位癌)的血清樣品中檢測針對BRCA1、BRCA2和HER2的自身抗體的滴定曲線。圖6顯示用于在來自肺癌患者的血清樣品中檢測針對NY-ESO的自身抗體的滴定曲線。測試了該患者，但發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生抗p53或c-myc的自身抗體。圖7顯示用于在來自肺癌患者的血清樣品中檢測針對NY-ESO和p53的自身抗體的滴定曲線。測試了該患者，但發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生抗c-myc的自身抗體。圖8(a)和圖8(b)展示了用于在來自“正常”受試者(即無癌癥證據(jù)的個體)的血清樣品中針對抗P53、c-myc和NY-ES0-1的自身抗體的兩次獨立滴定測定的結(jié)果。在圖8(a)顯示的測定中，隨著抗原量的增加觀察到了平坦的線，表明血清樣品中不包含針對任 何測試抗原的自身抗體。當(dāng)同一患者血清樣品的第二個等分試樣用同樣的測定方法再次測試時，測定失敗并產(chǎn)生示于圖8(b)的反常結(jié)果?？乖吭黾訒r的特征滴定曲線的消失表明這是反常結(jié)果，而不是真陽性。如果使用單個固定抗原量在單點測定中測試這一樣品，就得到看起來像“假陽性”的結(jié)果。因而，這些結(jié)果說明該滴定曲線方法的優(yōu)點在于區(qū)分真陽性和假陽性結(jié)果。圖9(a)和圖9(b)顯示使用一系列不同抗原對來自單個侵襲性乳腺癌患者的血清樣品進(jìn)行兩次獨立滴定測定的結(jié)果。該特定患者顯示了針對NY-ES0-1、HER2和BRCA2的自身抗體。對于每個陽性抗原，當(dāng)抗原濃度提高時信號強(qiáng)度(即滴定信號)的提高表示陽性測定結(jié)果。圖10(a)和圖10(b)展示了本發(fā)明在區(qū)分抗生物素應(yīng)答和對特定抗原(即腫瘤標(biāo)志物)的“真”自身抗體中的效用。在這些測定中，使用生物素化的抗原BRCA2、HER2、c-myc和NY-ES0-1、非生物素化的BRCAl和“空”載體VOL的對照表達(dá)產(chǎn)物(其編碼生物素標(biāo)記但沒有其他抗原)對來自臨床正常人受試者的血清樣品測試自身抗體的存在情況。測試個體對生物素化抗原和空載體VOL (其僅為有效的生物素)均顯示滴定應(yīng)答，但不應(yīng)答于非生物素化抗原BRCA1，表明對生物素化標(biāo)志物的“陽性”結(jié)果事實上是由于在該個體中存在抗生物素抗體造成的。實施例5、與單點測量相比較對抗原滴定測定的靈敏度和特異性進(jìn)行分析使用滴定法和在單個抗原濃度(IOii g/ml)下測量對100個患有原發(fā)性乳腺癌(PBC)的婦女和80個無惡性疾病證據(jù)的婦女進(jìn)行自身抗體(AAb)測量。以下各表顯示了兩種方法的直接比較。表4 :在PBC中對滴定AAb測定與在單個抗原濃度下測量的靈敏度進(jìn)行比較抗原單點済定測定
p5317.Slr13.91
c-rayc6.2%22.9%
ITY-ESO-I24,7%25.0%
BRCA220.6%31.3%
H3SR223.7%25.0%
HtJCl18,5%19,8%
板(6Ags)54,6%62,2% 表5 :在正常婦女中對滴定AAb測定與在單個抗原濃度下測量的靈敏度進(jìn)行比較
抗原單點滴定測定
p5393.8 "37.3IT
c~myc93.8%:34. Clr
NY-ESO-I90.0%93.3%
BRCA290.0%94.€lr
HSR291.3%95. Sir
MOCl92,5%95.9^
板 UAg3)71,3%78.41-可以看出，通過使用抗原滴定曲線上的多個點得到了與單點測量相比更高的靈敏度和特異性。實施例6、抗原滴定測定靈敏度和特異性較高的可能原因不限于理論地，申請人認(rèn)為在滴定抗原的測定中觀察到的較高的特異性和靈敏度有多個原因。(i)圖11顯示了使用抗原p53、c-myc和NY-ES0-1在不同濃度下對來自原發(fā)性乳腺癌(PCB)患者的血清進(jìn)行AAb分析的結(jié)果。這些結(jié)果表明在一些情況下，滴定曲線在高抗原水平時下降(NY-ES0-1曲線)。這在免疫化學(xué)中是經(jīng)常觀察到的現(xiàn)象。如果使用在10 ug/ml的單點測量，該患者將被歸類為NY-ES0-1自身抗體陰性，而事實上明顯為陽性應(yīng)答。(ii)圖12顯示了同樣使用滴定抗原p53、c-myc和NY_ES0_1對來自正常個體的血清進(jìn)行的分析。該圖展示了申請人在約10%的測定中觀察到的一種效應(yīng)，其中抗原測量(在此為P53)的基線偏移至陰性對照(VOL)的水平以上。這就產(chǎn)生了不真實的高讀數(shù)。這種類型的結(jié)果很容易用被滴定測定鑒別，但在一組單點測定中是無法查覺的。這些假陽性將導(dǎo)致特異性降低(見表5)。(iii)正如實施例4中的討論，用于滴定AAb測定的抗原具有用于蛋白質(zhì)純化的生物素標(biāo)簽。然而，已知群體中的約10%對生物素(一種維生素)產(chǎn)生抗體應(yīng)答。圖13展示了原發(fā)性乳腺癌(PBC)患者中的抗生物素應(yīng)答。這種應(yīng)答可以使用滴定曲線明確鑒別，因為對陰性對照VOL(其也是生物素化的)產(chǎn)生強(qiáng)烈抗體應(yīng)答。這樣的個體必須認(rèn)為是不能用這種測定形式來評估的。然而，如果使用單點測定，抗生物素應(yīng)答則不能從真實應(yīng)答中區(qū)分出來。_9] 實施例7、與血■清滴定相比，抗原滴定顯示靈敏度的提高在兩個完全無關(guān)的實驗中以兩種方式進(jìn)行AAb測量。第一種使用標(biāo)準(zhǔn)形式，其中用從10 V- g/ml降至0. 01 V- g/ml半對數(shù)滴定的抗原包被板。封閉后，加入1/100稀釋的血清。在第二種方式中，用濃度為3 yg/ml的抗原包被板，封閉后加入從1/10稀釋度降至1/10，000稀釋度的半對數(shù)滴定范圍內(nèi)的血清。測定中其余的方法相同。將兩種已知為p53和c-myc陽性的血清混合物與8種來自原發(fā)性乳腺癌婦女的血清以及10種來自正常個體的血清一起測定。結(jié)果顯示于以下文表6中。表6 :涉及抗原滴定的AAb測定與涉及血清滴定的AAb測定相比的靈敏度
權(quán)利要求
1.多種不同量的抗原在制備用于在包含哺乳動物受試者體液的測試樣品中檢測抗體譜之藥劑中的用途，其中所述抗體為疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物，其中所述檢測包括 (a)使該測試樣品接觸所述多種不同量的該抗體特異性抗原， (b)檢測該抗體與該抗原之間特異性結(jié)合的量，以及 (C)對步驟(a)中所用的每一個抗原量，繪制或計算該特異性結(jié)合量對該抗原量的曲線，從而建立疾病發(fā)作前或整個疾病過程中所述受試者的抗體產(chǎn)生譜，其中重復(fù)該檢測以建立抗體產(chǎn)生譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的用途，其中所述抗體是自身抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述抗體是對腫瘤標(biāo)志物蛋白具有特異性的自身抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述抗原是腫瘤標(biāo)志物蛋白或其抗原片段或表位。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中該腫瘤標(biāo)志物蛋白是MUCl、MUC16、c-myc、EGRF、p53、ras、BRCAl、BRCA2、APC, HER2、PSA、CEA, CA19. 9、NY-ESO-U4-5, CAGE、PSMA, PSCA, EpCam、細(xì)胞角蛋白、恢復(fù)蛋白、激肽釋放酶、膜聯(lián)蛋白、么 、61^78、04125、乳腺珠蛋白或^1
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項的用途，其中所述藥劑可用于診斷、預(yù)后或監(jiān)測癌癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項的用途，其中所述藥劑可用于 (a)篩選無癥狀人受試者群體以鑒定發(fā)生癌癥的風(fēng)險提高的受試者，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者體液的樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平升高的受試者鑒定為具有發(fā)生癌癥的風(fēng)險，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平；或 (b)檢測無癥狀人受試者的早期腫瘤性或早期致癌性改變，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者體液的樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平的升高作為該受試者中早期腫瘤性或早期致癌性改變的指示，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平；或 (C)篩選無癥狀人受試者群體以鑒定已發(fā)生癌癥的受試者，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者體液的樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平升高的受試者診斷為患有癌癥，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平；或 (d)測試有癥狀人受試者群體以鑒定已發(fā)生癌癥的受試者，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者體液的樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平升高的受試者診斷為患有癌癥，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平； (e)監(jiān)測患者癌癥或其它腫瘤疾病的發(fā)展中的用途，其中使用該檢測測試的樣品是取自人患者體液的樣品，并且其中所述患者中存在的自身抗體水平與正常對照相比較，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平； (f)評估已診斷為癌癥患者的預(yù)后； (g)預(yù)測癌癥患者對抗癌治療的反應(yīng)，所述抗癌治療例如抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療、化學(xué)治療或疫苗； (h)監(jiān)測癌癥患者對抗癌治療的應(yīng)答，所述抗癌治療例如抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療、化學(xué)治療或疫苗；或(i)選擇用于癌癥患者的抗癌疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述抗體為自身抗體，其為自身免疫病的特征或與其相關(guān)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述自身抗體是導(dǎo)致器官功能不全或衰竭的腎病或肝病的特征或與其相關(guān)的自身抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求I的用途，其中所述抗體針對移植進(jìn)入哺乳動物受試者的組織上存在的表位。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的用途，其中該抗原為天然存在的蛋白質(zhì)或多肽、重組蛋白或多肽、合成蛋白質(zhì)或多肽、合成肽、肽模擬物、多糖或核酸。
12.兩組或更多組抗原在制備用于在包含哺乳動物受試者體液的測試樣品中檢測兩種或更多種抗體之藥劑中的用途，其中至少一種所述抗體為疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物，其中所述檢測包括 (a)使該測試樣品接觸所述兩組或更多組抗原，其中所述抗原組的每一組是測試樣品中待檢測的所述抗體之一特異性的，其中每組抗原包含多種不同量的所述抗原， (b)檢測該抗體與該抗原之間特異性結(jié)合的量，以及 (C)對步驟(a)中所用的每組抗原的抗原量，繪制或計算該特異性結(jié)合量對該抗原量的曲線，從而建立疾病發(fā)作前或整個疾病過程中所述患者的抗體產(chǎn)生譜。
13.權(quán)利要求12的用途，其中基于所述抗體所有測試抗原濃度下特異性結(jié)合量的集合值檢測每種抗體的存在情況。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的用途，其中所述抗體至少一種或每一種是對腫瘤標(biāo)志物蛋白具有特異性的自身抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中每種抗原是腫瘤標(biāo)志物蛋白或其抗原片段或表位。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中每種腫瘤標(biāo)志物蛋白選自MUCl、MUC16、c-myc、EGRF、p53、ras、BRCAl、BRCA2、APC, HER2、PSA、CEA, CA19. 9、NY-ESO-U4-5, CAGE、PSMA, PSCA,EpCam、細(xì)胞角蛋白、恢復(fù)蛋白、激肽釋放酶、膜聯(lián)蛋白、AFP、GRP78、CA125、乳腺珠蛋白和raf o
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任一項的用途，其中所述藥劑可用于診斷、預(yù)后或監(jiān)測癌癥。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-16中的用途，其中所述藥劑可用于 (a)篩選無癥狀人受試者群體以鑒定發(fā)生癌癥的風(fēng)險提高的受試者，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者的體液樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平升高的受試者鑒定為具有發(fā)生癌癥的風(fēng)險，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平；或 (b)檢測無癥狀人受試者的早期腫瘤性或早期致癌性改變，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者的體液樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平的升高作為該受試者中早期腫瘤性或早期致癌性改變的指示，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平；或(c)篩選無癥狀人受試者群體以鑒定已發(fā)生癌癥的受試者，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者的體液樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平升高的受試者診斷為患有癌癥，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平；或 (d)測試有癥狀人受試者群體以鑒定已發(fā)生癌癥的受試者，其中使用該檢測測試的樣品是取自該受試者的體液樣品，并且其中將與正常對照相比自身抗體水平升高的受試者診斷為患有癌癥，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平； (e)監(jiān)測患者癌癥或其它腫瘤疾病的發(fā)展中的用途，其中使用該檢測測試的樣品是取自人患者的體液樣品，并且其中所述患者中存在的自身抗體水平與正常對照相比較，所述正常對照代表對照個體中自身抗體水平或者該受試者的基線水平；或 (f)評估已診斷為癌癥患者的預(yù)后； (g)預(yù)測癌癥患者對抗癌治療的反應(yīng)，所述抗癌治療例如抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療、化學(xué)治療或疫苗； (h)監(jiān)測癌癥患者對抗癌治療的應(yīng)答，所述抗癌治療例如抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、 放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療、化學(xué)治療或疫苗；或 (i)選擇用于癌癥患者的抗癌疫苗。
19.多種不同量的抗原在制備用于在包含哺乳動物受試者體液的測試樣品中測定抗體譜之藥劑中的用途，其中所述抗體針對引入所述哺乳動物受試者的外源物質(zhì)，其中所述測定包括 (a)使該測試樣品接觸所述多種不同量的該抗體特異性的抗原， (b)檢測該抗體與該抗原之間特異性結(jié)合的量，以及 (C)對步驟(a)中所用的每一個抗原量，繪制或計算該特異性結(jié)合量對該抗原量的曲線，從而建立所述受試者的抗體產(chǎn)生譜。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述外源物質(zhì)是 (i)治療劑，例如藥物、前藥、人抗體治療或疫苗； (ii)與治療劑一起施用的遞送載體、運載體或賦形劑的組分； (iii)治療劑或疫苗的非祀標(biāo)部分；或 (iv)傳染原，例如真菌、細(xì)菌、病毒或寄生蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測哺乳動物受試者中疾病狀態(tài)或疾病易感性的方法，包括檢測包含所述哺乳動物受試者體液的測試樣品中的抗體，其中所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標(biāo)志物，該方法包括(a)使所述測試樣品接觸多種不同量的所述抗體特異性抗原，(b)檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結(jié)合的量，(c)對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算所述特異性結(jié)合量對抗原量的曲線，以及(d)基于每個所用的不同抗原濃度下所述抗體與所述抗原之間的特異性結(jié)合量，確定該疾病狀態(tài)或疾病易感性是否存在。
文檔編號G01N33/564GK102749447SQ201210248279
公開日2012年10月24日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月27日
發(fā)明者卡羅琳·查普曼, 安德烈亞·默里, 托尼·巴爾內(nèi)斯, 約翰·福賽思·魯塞爾·羅伯特森 申請人:昂西免疫有限公司