一種血清cenpf抗體定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種血清CENPF抗體定量檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型。由于HCC 缺乏早期癥狀，大部分病人出現(xiàn)癥狀時(shí)已屬中晚期，失去有效治療的機(jī)會(huì)，存活期一般少于 1年，早期HCC通過(guò)切除術(shù)或肝移植，5年生存率在60-70%以上。因此，通過(guò)對(duì)高危人群的 定期篩查及時(shí)發(fā)現(xiàn)和診斷早期病例至關(guān)重要。但目前臨床上仍缺乏敏感度高、特異性好，且 具有臨床可操作性的HCC篩查及早期診斷方法。
[0003] 理想的HCC早期診斷方法不僅要有較高的特異性，能夠?qū)CC與肝硬化、肝炎等區(qū) 別開(kāi)來(lái)，還要有較高的敏感性，能夠在肝細(xì)胞癌的早期階段即能檢出。此外，作為HCC的篩 查及早期診斷方法，還必須具備臨床可操作性，如簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，尤其是對(duì)患者創(chuàng)傷最小而易于 被接受等。作為目前臨床常用的HCC篩查和診斷方法，超聲檢查雖然無(wú)創(chuàng)但高度依賴臨床 醫(yī)生的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)且不易從肝硬化背景中發(fā)現(xiàn)早期HCC ;CT及MRI檢查能顯著提高早期HCC 的檢出率，但需要使用專門(mén)的儀器設(shè)備，費(fèi)用非常昂貴；肝穿刺組織病理學(xué)檢查雖然仍是早 期HCC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于侵入性特點(diǎn)、操作復(fù)雜且難度大，不易為病人接受。比較而言， 通過(guò)檢測(cè)病人血清標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)HCC的早期診斷無(wú)疑具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和很強(qiáng)的可操作性。
[0004] 目前已用于HCC臨床診斷的血清標(biāo)志物主要為甲胎蛋白（AFP)，由于受研宄設(shè)計(jì) (回顧性研宄和前瞻性研宄）、HCC病因?qū)W因素、受檢人群及所設(shè)定的臨界值不同等因素 的影響，AFP的敏感度和特異度存在較大的差異。大多數(shù)臨床研宄結(jié)果表明，當(dāng)臨界值為 20ng/ml時(shí)，AFP診斷HCC的敏感度和特異度分別為40 %~65 %和75 %~90 %不等。而且， 只有當(dāng)AFP血清濃度達(dá)到500ng/ml時(shí)才表現(xiàn)出很好的特異性，提示AFP作為HCC診斷標(biāo)志 物特異性高但敏感度不夠，可能不適合HCC的早期診斷。近年來(lái)出現(xiàn)的AFP異構(gòu)體（AFP-L3) 和異常凝血酶原（DCP)的敏感度或特異性有了一定的提高，可與AFP聯(lián)合使用以提高敏感 度。其他仍處于實(shí)驗(yàn)室研宄階段的HCC血清標(biāo)志物還包括硫酸肝素多糖3 (GPC3)、高爾基蛋 白73(6?73)、生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子（如了6?|3 1、16?-11、邪？等）以及一些酶和同工酶（如 GGT-II、AFU、AAG)等。近年來(lái)，隨著以蛋白質(zhì)雙向電泳、新型質(zhì)譜分析為主的蛋白質(zhì)組學(xué)方 法的應(yīng)用，為尋找新型HCC標(biāo)志物提供了強(qiáng)有利的工具，已報(bào)導(dǎo)篩選出一些新的潛在血清 標(biāo)志物。但總體說(shuō)來(lái)，目前已有的或已報(bào)道的血清標(biāo)志物均不同程度存在檢測(cè)敏感度或特 異性問(wèn)題，大都距臨床實(shí)際應(yīng)用較遠(yuǎn)，尤其是用于HCC的早期診斷。
[0005] 近年來(lái)的研宄發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，由于機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，患者體 內(nèi)會(huì)出現(xiàn)針對(duì)某些自體細(xì)胞抗原的抗體免疫反應(yīng)。這些自體細(xì)胞抗原又稱為腫瘤相關(guān)抗原 (Tumor Associated Antigens，TAAs)。通過(guò)檢測(cè)外周血中這些針對(duì)自身抗原成分的自身抗 體可以區(qū)分正常人和癌癥患者。由于當(dāng)腫瘤相關(guān)抗原水平很低，利用常規(guī)蛋白檢測(cè)方法無(wú) 法檢測(cè)到時(shí)，免疫系統(tǒng)就能監(jiān)測(cè)到該特異蛋白的存在，從而引發(fā)免疫反應(yīng)產(chǎn)生大量的抗體。 因此自身抗體檢測(cè)方法與抗原檢測(cè)方法相比具有更高的敏感度，血清自身抗體有可能成為 用于癌癥早期診斷的非常有前景的標(biāo)志物。
[0006] 本課題組前期已通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選出一批在HCC和非HCC人群（肝硬化、 慢性肝炎及健康對(duì)照）中存在不同血清學(xué)水平的抗原蛋白，通過(guò)購(gòu)買(mǎi)或重組這些抗原蛋白 制成蛋白芯片，大通量驗(yàn)證HCC和非HCC人群血清中相應(yīng)自身抗體的水平，篩選出能夠區(qū)分 HCC和非HCC的血清自身抗體。研宄發(fā)現(xiàn)血清著絲粒蛋白F (CENPF)自身抗體區(qū)分HCC和 非HCC的價(jià)值最高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。值得注意的是，與AFP抗原的陽(yáng)性率隨著腫瘤的 進(jìn)展而升高不同，CENPF自身抗體的陽(yáng)性率一般在腫瘤早期較高，然后隨著腫瘤的進(jìn)展而下 降。CENPF在cutoff值為1152時(shí)，其區(qū)分HCC和肝硬化、慢性肝炎以及健康對(duì)照的AUC為 0. 816,區(qū)分早期肝癌的AUC為0. 795 ;而AFP的cutoff值為20ng/ml時(shí)，其區(qū)分HCC和早期 HCC的AUC分別為0. 821和0. 789。CENPF自身抗體診斷早期HCC的靈敏度為和特異度分別 為76. 19%和66. 67%，而AFP分別為47. 96%和100%，可見(jiàn)CENPF自身抗體診斷早期HCC 的敏感性顯著高于目前常用的指標(biāo)AFP，顯示出CENPF自身抗體在HCC早期診斷方面具有潛 在價(jià)值。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在AFP陰性的HCC和早期HCC患者中，分別有74. 56%和72. 55%的 患者CENPF自身抗體為陽(yáng)性，顯示出CENPF自身抗體對(duì)AFP陰性的HCC患者有潛在的診斷 價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能夠定量檢測(cè)血清中CENPF抗 體水平，將有助于肝細(xì)胞癌尤其是早期肝細(xì)胞癌的篩查及早期診斷。
[0008] 本發(fā)明檢測(cè)試劑盒采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，抗體檢測(cè)反應(yīng)板為包被有重組CENPF抗 原蛋白的酶標(biāo)板，待測(cè)血清或標(biāo)準(zhǔn)品中的特異性CENPF抗體能夠與酶標(biāo)板微孔中的CENPF 蛋白特異性結(jié)合而吸附于微孔內(nèi)，加入HRP標(biāo)記的兔抗人IgG二抗孵育，充分洗滌后加入顯 色底物，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定各微孔的吸光度即OD值，其OD值與CENPF抗體水平呈正 比。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并對(duì)各血清標(biāo)本中的CENPF抗體水平進(jìn)行定量。
[0009] 本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒的制備包括如下步驟：
[0010] 1.重組CENPF抗原蛋白的制備：本課題組制備的重組CENPF抗原蛋白為帶有GST 標(biāo)簽的GST-CENPF(121a. a. -220a. a.)融合蛋白，采用化學(xué)合成的方法合成基因，然后采用 可溶性表達(dá)載體PGEX-4T-1構(gòu)建表達(dá)人CENPF重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌并誘 導(dǎo)其表達(dá)GST-CENPF融合蛋白，收集菌體并處理得到菌體上清，利用Glutathione FF親和 層析柱純化得到重組CENPF抗原蛋白。
[0011] 2.檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的選定：本課題組在前期工作基礎(chǔ)上，已通過(guò)蛋白芯片技術(shù) 定量檢測(cè)篩選出一批高水平表達(dá)CENPF抗體的血清標(biāo)本，可以作為本檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品 進(jìn)行質(zhì)量控制和抗體定量。
[0012] 3.制備酶標(biāo)反應(yīng)板：用棋盤(pán)法確定酶標(biāo)板的最佳包被濃度，各微孔內(nèi)加入最佳 濃度的重組CENPF抗原蛋白IOOuI，4 °C過(guò)夜后甩掉蛋白溶液，用洗滌液PBS-T (0. 0 Imo 1 / L PBS，pH 7. 2-7. 4，0. 05% Tween 20)洗板3次。然后向各微孔內(nèi)加入1%的BSA封閉液 IOOul以封閉未結(jié)合的空白位點(diǎn)，37°C孵育2h后甩掉封閉液，用洗滌液洗板3次，在吸水紙 上拍干后置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒的優(yōu)勢(shì)之處在于：提供了一種新的篩查及早期診斷HCC 的方法，該試劑盒所檢測(cè)的血清CENPF自身抗體用于診斷HCC的敏感性顯著優(yōu)于目前臨床 使用的血清標(biāo)志物AFP。
【附圖說(shuō)明】：
[0014] 圖I :PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒DNA瓊脂糖電泳結(jié)果，其中1-6分別代表6個(gè)菌落重組質(zhì) 粒 DNA 模板，MK 為 DNA 分子 Marker (100-2000bp)。
[0015] 圖2:BL21(DE3)菌株在lmmol/L IPTG誘導(dǎo)下融合蛋白的表達(dá)情況，其中A為 Non-induced crude， B 為 Induced crude， B1-B4 為 Induced crude， C 為 Supernatant of lysate，D 為 Precipitation of lysate，MK 為彩虹預(yù)染蛋白 Marker。
[0016] 圖3 :大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western-Blot結(jié)果，a為純化前菌體上清 Western-Blot結(jié)果：其中A、B為來(lái)自兩個(gè)不同菌落的BL21(DE3)所誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白， C為化學(xué)發(fā)光蛋白Marker ;b為純化后CENPF蛋白Western-Blot結(jié)果：其中A為reduced CENPF蛋白，B為non-reduced CENPF蛋白，C為陰性對(duì)照，MK為蛋白marker。
[0017] 圖4 :融合蛋白純化結(jié)果，其中A為上柱樣品，B為洗滌液，C為lOmmol/L GSH-I洗 脫液，D為lOmmol/L GSH-2洗脫液，E為6M Gua-HCl洗脫液，MK為彩虹預(yù)染蛋白Marker。
[0018] 圖5 :酶標(biāo)板包被濃度為0. 55ng/ml時(shí)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品的稀 釋倍數(shù)（稀釋2、4、8、16、32、64、128倍以及陰性對(duì)照），縱坐標(biāo)為各稀釋倍數(shù)下的OD值均 值。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 CENPF重組蛋白的制備
[0020] 一、材料
[0021] DNA marker (100-2000bp)和彩虹預(yù)染蛋白 marker (14-120KD)均購(gòu)自北京天根 生化科技有限公司；化學(xué)發(fā)光蛋白Marker(20-90KD)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司； 大腸桿菌 0rigammi2 和 BL21 (DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存；Fast Taq Mastermix、BamHI、Xhol、 T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；DNA電泳凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；異丙基硫代 盧-D-半乳糖苷（IPTG)為Amresco產(chǎn)品；GST抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研宄所；HRP標(biāo)記的 山