一種便攜家庭式梅毒快速檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領域，尤其涉及一種便攜家庭式梅毒快速檢測試紙條。
【背景技術】
[0002] 目前，體外培養(yǎng)梅毒病原體仍然沒有實現(xiàn)。因此，臨床上和實驗室對于梅毒的診斷 主要集中在血清學特征的檢測。雖然也可以通過直接確定病原體進行診斷，但是現(xiàn)有的技 術主要是利用暗視野顯微鏡對樣品直接觀察，這樣的操作具有較強的主觀性，即使非常有 經(jīng)驗的檢測者，也可能會出現(xiàn)假陰性結果；PCR方法也可直接測定病原體的存在，但是該方 法的費用昂貴，不易作為血站和醫(yī)院的常規(guī)檢測。由此可見，梅毒患者血清學檢測在梅毒診 斷方面至關重要。血清學診斷包括特異和非特異兩種方法，二者之間存在區(qū)別。非特異性 梅毒診斷方法主要有VDRL、USR、RPR和TRUST等試驗，它們具有相同的抗原成分，即一種由 美國Pangborn等發(fā)現(xiàn)的性病研究實驗室抗原（VDRL)，從牛心肌中提取的心擬脂，適量加入 膽固醇及卵磷脂以提高敏感性，通常稱這種抗原為心擬脂抗原，可有效診斷神經(jīng)梅毒。但 該類方法的特異性受生物學假陽性反應和某些生理性反應的影響，即該方法的靈敏度依賴 于病程所處階段。因此，非特異性梅毒診斷方法只能有限用于常規(guī)篩查。特異性梅毒抗體 檢測方法有 FTA-ABS 法（Fluorescent Treponemal Antibody Absorption，梅毒焚光抗體 吸附法）、TPHA 法（Treponema Pallidum Hemagglutination Assay)、TPPA 法（Treponema Pallidum Particle Agglutination Assay),、Captia·? Syphilis G/Syphilis M法等。特 異性方法常用于非特異性方法陽性樣本的確認，TPHA/TPPA法也常用于初篩結果的確證。特 異性抗梅毒抗體與疾病的進程沒有相關性，即使經(jīng)過治療也能終身攜帶。在特異性梅毒抗 體檢測方法中，F(xiàn)TA-ABS具有高敏感性，尤其針對早期梅毒，但在HIV感染、自身免疫疾病和 懷孕的時候會發(fā)生一定比例的假陽性結果（0.35%)。FTA-ABS法對各階段的梅毒都敏感， 但評價具有主觀性，有時較困難且復雜，不適合用于初步篩查，僅適用于確證。其他幾種特 異性梅毒抗體檢測方法也具有同樣的問題，由于傳統(tǒng)的梅毒診斷方法比較繁瑣，耗時較長， 不易推廣。
[0003] 申請?zhí)枮?2137626. 3的專利公開了一種用于診斷梅毒螺旋體感染的梅毒螺旋體 抗體酶標診斷試劑。它包括用合成肽抗原或基因工程表達的抗原：P15、P17、P47抗原0. 1~ 10μg/ml包被在酶標板上、酶標二抗（IgG、IgM):含1 : 20~1 : 100K酶標二抗稀釋溶液 和顯色劑組合及增溶劑，所述的顯色劑組合中的顯色劑是TMB丙磺酸鈉。顯色劑組合可包 括TMB丙磺酸鈉與過氧化氫異丙苯或其衍生物的組合或TMB丙磺酸鈉與羥基脲的組合。這 種梅毒螺旋體抗體酶標診斷試劑，在應用合成肽抗原、基因工程表達的抗原基礎上，使用了 一種水溶性極好、性能穩(wěn)定的TMB鹽類，配合適量的增溶劑、穩(wěn)定劑，使梅毒螺旋體抗體酶 標診斷試劑獲得了更好的穩(wěn)定性能。其高特異性、高靈敏度、操作簡便、試劑穩(wěn)定，使得梅毒 檢測能自動化、血源批量篩選、規(guī)范化管理得到了保證。
[0004] 上述方法的缺點是主要以酶聯(lián)免疫反應為主要原理對樣品進行檢測，需要酶標 儀，孵育溫箱等大型儀器，不適合家庭使用。且操作復雜，耗時較長，不利于快速的初篩檢 測。
[0005] 申請?zhí)枮?01010215044. 8的專利公開了一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋 體（TP)抗體檢驗試劑盒及其制備和檢測方法，屬于免疫分析醫(yī)學診斷技術領域。具體包括 用TP重組抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封閉空白結合點，制成特異性TP探針一 高聚分子微球；與待測標本共培養(yǎng)捕獲TP抗體，洗滌離心除去未結合的TP抗體，再加入熒 光標記的抗人IgG或IgM抗體；使用流式細胞儀檢測微球的熒光強度，對受測抗體進行定性 或定量分析。本方法具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，并可對標本進行微量、多價 分析。
[0006] 上述方法的缺點是需要使用流式細胞儀這種昂貴大型儀器，該儀器在血站和基層 醫(yī)院的配置較少，且該儀器的保養(yǎng)維護成本較高，不適用推廣，且無法進行家庭使用和檢 測。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種便攜家庭式梅毒快速檢測試紙條，旨在解決傳統(tǒng)的梅 毒診斷方法比較繁瑣，耗時較長，費用高，不易推廣的問題。
[0008] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種便攜家庭式梅毒快速檢測試紙條包括樣本墊、結合墊、 硝酸纖維素膜和吸附墊，梅毒抗原作為捕獲抗原被固定到硝酸纖維素膜上，膠體金標記試 劑吸附在結合墊上。
[0009] 進一步，以梅毒抗原TP17和TP47構建大腸桿菌表達載體，梅毒抗原的表達、純化 和鑒定方法為：
[0010] 利用大腸桿菌密碼子的偏嗜性人工設計并合成基因，合成的基因兩端含有BamH I 和Not I位點，表達載體為pETDuet-1，該表達載體含有T7啟動子，在IPTG的誘導下，外源 基因在T7RNA聚合酶的作用下轉錄表達；
[0011] 所述表達載體的c端含有His *Tag序列，表達的外援蛋白用金屬螯合親和層析法 純化，在設計目的基因時，插入12KD大小的分子伴侶肽鏈，將表達的外援蛋白分泌到細胞 周質中；
[0012] 將合成的外源基因通過酶切鏈接插入到載體pETDuet-Ι中，轉化大腸桿菌BL21 中，通過IPTG誘導表達，抗原以可溶性形式表達于細菌周質中，收集細菌，超聲破碎，上清 通過金屬螯合和分子篩層析，純化的蛋白通過SDS-PAGE、Western-blot鑒定。
[0013] 進一步，所述便攜家庭式梅毒快速檢測試紙條的制備方法包括：
[0014] 步驟一、TP目的基因的設計和克?。?br>[0015] 通過美國國立生物技術信息中心網(wǎng)站，查找梅毒螺旋體TP-17和TP-47的全基因 組序列；
[0016] 合成目的基因開放閱讀框內的cDNA序列，并將合成好的序列克隆入pMDIS-T Simple載體，在進行序列合成時，分別在目的序列的5'端和3'端插入BamH I和Not I的 酶切位點，并利用這兩種限制性內切酶將目的基因從PMD18-T Simple載體上剪切下來，進 行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收電泳條帶；
[0017] 將回收的目的條帶通過去磷酸化酶處理后，與經(jīng)同樣限制性內切酶及去磷酸化酶 處理的pETDuet-Ι載體在T4連接酶存在的條件下，16°C連接過夜；將連接好的載體電轉到 大腸桿菌DH10B菌種的感受態(tài)細胞中，涂布于含有50 μ g/ml氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)板 中，37°C培養(yǎng)過夜；第二天挑取單克隆接種到含有50 μ g/ml氨芐抗生素的5ml LB液體培養(yǎng) 基中，37°C，250rpm，震蕩培養(yǎng)過夜；第三天利用小抽質粒提取試劑盒提取菌液中的質粒，進 行BamH I和Not I雙酶切并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將具有目的條帶的陽性質粒電轉 到大腸桿菌BL21菌種的感受態(tài)細胞中，重復以上操作，涂板，挑克隆進行液體培養(yǎng)后，通過 Bam HI和Not I雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，將含有目的條帶的質?；蚓哼M行測 序；
[0018] 步驟^、目的蛋白的表達和純化；
[0019] 將含有正確目的基因TP17和TP47序列的質粒的菌液分別接種至50ml含有 50 μ g/ml氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于250rpm，37 °C培養(yǎng)過夜；隨后將兩瓶50ml過夜 培養(yǎng)的菌液接種到1L含有50 μ g/ml氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm震蕩培 養(yǎng)；
[0020] 當菌液的A_0D值為0. 2~0. 4時，將培養(yǎng)箱溫度調至22°C，依然250rpm震蕩培 養(yǎng)2. 5~3h ;當菌液的A6QQ0D值為0. 9~1. 0時，加入IPTG誘導劑至終濃度為lmmol/L，將 培養(yǎng)箱溫度調至18°C，250rpm震蕩培養(yǎng)過夜；
[0021] 第二天收集菌液，4000g，離心20min，收集菌體沉淀，稱重，記錄菌體重量；
[0022] 然后按照lg菌體重量加入5ml濃度為0. 1M的磷酸鹽緩沖液重懸細菌；
[0023] 將重懸后的菌液放在冰上，進行超聲破碎，超聲處理10s，暫停20s，作用lOmin后， 于12000g，離心25min，收集上清；將收集到的上清繼續(xù)于12000g，離心25min，再收集上清； 再次重復上述操作，然后將收集到的上清通過0. 45 μ m的濾膜，用BCA試劑盒檢測溶液中的 蛋白濃度，記錄結果；
[0024] 選用GE公司的Ni Sepharose? 6Fa