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一種免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒及其制備方法

文檔序號(hào):9809019閱讀:997來源:國知局
一種免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)療用品技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及生物和醫(yī)學(xué)檢測用醫(yī)療用品技術(shù)領(lǐng)域, 具體涉及一種免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 感染性疾病是一類對健康威脅比較嚴(yán)重的疾病,膿毒癥和一些嚴(yán)重的感染性疾病 已成為發(fā)病和死亡的主要原因。測定感染最常用的傳統(tǒng)指標(biāo)有:降鈣素原、C反應(yīng)蛋白、白細(xì) 胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比、血沉、體溫等,但這些指標(biāo)都不同程度的存在滯后、敏感度低、特異 性不高的缺陷。在感染性疾病的預(yù)防和治療中,如果能及早準(zhǔn)確的診斷,就可以及早的采取 合理的應(yīng)對措施,進(jìn)而提高感染性疾病的治療成功率。
[0003] 肝素結(jié)合蛋白(heparin-binding protein,HBP)是中性粒細(xì)胞來源的顆粒蛋白, 是一個(gè)包含222個(gè)氨基酸的單鏈蛋白,當(dāng)有細(xì)菌感染發(fā)生時(shí),部分細(xì)菌侵入到血管中,細(xì)菌 本身或細(xì)菌釋放的毒素刺激中性粒細(xì)胞釋放HBP,從而導(dǎo)致血中HBP含量升高。HBP與其它傳 統(tǒng)指標(biāo)相比,除具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、陽性/陰性檢出率高之外,還具有出現(xiàn)早,只在急 性細(xì)菌感染時(shí)濃度極度升高,而在病毒感染和非特異性炎癥時(shí)保持較低的水平。因此,HBP 作為臨床新的炎癥標(biāo)志物,具有早期、高特異性、高靈敏度的特點(diǎn),明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的標(biāo)志物, 在臨床應(yīng)用具有對病情的早期評估,預(yù)后評價(jià),療效觀察等價(jià)值,同時(shí)可以指導(dǎo)抗生素的應(yīng) 用,減少抗生素的濫用,減少耐藥菌的發(fā)生。因此,研究開發(fā)出一種快速、特異、敏感、準(zhǔn)確的 測定肝素結(jié)合蛋白的濃度,具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒,該試劑盒 能夠快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確地測定肝素結(jié)合蛋白。
[0005] 同時(shí),本發(fā)明的目的還在于提供一種免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒 的制備方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007] -種免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒,包括第一緩沖液、第二緩沖液 和試劑卡;
[0008] 所述第一緩沖液為含有0.83~2ngAil兔抗人肝素結(jié)合蛋白抗體的磷酸鹽緩沖液; 所述第二緩沖液為含有〇. 05~0.2yg/yl熒光標(biāo)記的雞抗兔二抗的磷酸鹽緩沖液;
[0009]所述試劑卡包括試紙條,所述試紙條包括塑料墊板,塑料墊板上設(shè)置硝酸纖維素 膜,硝酸纖維素膜上左右間隔設(shè)置檢測線和質(zhì)控線,檢測線左側(cè)硝酸纖維素膜上設(shè)置玻璃 纖維素膜,質(zhì)控線右側(cè)硝酸纖維素膜上設(shè)置吸水紙,玻璃纖維素膜上設(shè)置濾血膜;所述檢測 線上包被鼠抗人肝素結(jié)合蛋白抗體;所述質(zhì)控線上包被羊抗兔抗體。
[0010]所述試劑卡還包括外殼,所述外殼包括連接在一起的上蓋和下蓋,所述上蓋上設(shè) 置有血樣孔和檢測窗;所述血樣孔的位置對應(yīng)濾血膜的位置;所述檢測窗的位置對應(yīng)檢測 線和質(zhì)控線的位置,使檢測線和質(zhì)控線處在檢測窗中。
[0011]所述檢測線上鼠抗人肝素結(jié)合蛋白抗體的包被量為0.2~0.8yg/cm。
[0012]所述質(zhì)控線上羊抗兔抗體的包被量為0.5~1.4yg/cm。
[0013] 所述熒光標(biāo)記的雞抗兔二抗為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的雞抗兔二抗。
[0014] 所述檢測線和質(zhì)控線之間的間隔距離為5mm~10mm。
[0015] 所述試紙條的寬度為3mm~6mm。
[001 ?] 所述磷酸鹽緩沖液的pH=6.5~7.3,磷酸鹽濃度為30~80mmol/L。
[0017] 所述試劑盒的使用方法包括以下操作步驟:
[0018] I:取不同濃度的肝素結(jié)合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入到第一緩沖液中,然后再加入第二緩沖 液,混合均勻后加入到試劑卡的濾血膜上,室溫水平放置10~15min后,將試劑卡插入熒光 免疫讀數(shù)儀,設(shè)定激發(fā)光波長為494nm,發(fā)射光波長為518nm,讀取不同濃度肝素結(jié)合蛋白標(biāo) 準(zhǔn)品的熒光值,并將熒光值與肝素結(jié)合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值進(jìn)行線性分析,繪制熒光值 和肝素結(jié)合蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到熒光值和肝素結(jié)合蛋白濃度關(guān)系式;
[0019] Π :取待測樣品加入到第一緩沖液中,然后再加入第二緩沖液,混合均勻,加入到 試劑卡的濾血膜上,室溫水平放置10~15min,將試劑卡插入熒光免疫讀數(shù)儀,設(shè)定激發(fā)光 波長為494nm,發(fā)射光波長為518nm,讀取待測樣品的熒光值,將該熒光值帶入步驟I得到的 關(guān)系式中,計(jì)算得到待測樣品肝素結(jié)合蛋白的濃度。
[0020] 所述試劑盒儲(chǔ)存在4~8°C環(huán)境下,在使用時(shí)首先將第一緩沖液在室溫下平衡15分 鐘后再使用。
[0021] 上述免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒的制備方法,包括以下操作步 驟:
[0022] 1)制備第一緩沖液:取兔抗人肝素結(jié)合蛋白抗體加入磷酸鹽緩沖液中,混合均勻, 即得第一緩沖液;
[0023] 2)制備第二緩沖液:取熒光標(biāo)記的雞抗兔二抗加入磷酸鹽緩沖液中,混合均勻,即 得第一緩沖液;
[0024] 3)制備試劑卡:取硝酸纖維素膜,標(biāo)記出檢測線和質(zhì)控線,然后在檢測線上噴點(diǎn)包 被鼠抗人肝素結(jié)合蛋白抗體,在質(zhì)控線上噴點(diǎn)包被羊抗兔抗體,然后將硝酸纖維素膜、玻璃 纖維素膜、吸水紙、濾血膜依次搭接在塑料墊板上,并切割成所需寬度的試劑卡;
[0025] 4)將步驟1)制備的第一緩沖液、步驟2)制備的第二緩沖液、步驟3)制備的試劑卡, 組裝,即得所述的免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒。
[0026] 本發(fā)明免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒,第一緩沖液中包括兔抗人肝 素結(jié)合蛋白抗體,第二緩沖液中包括熒光標(biāo)記的雞抗兔二抗,試劑卡檢測線上包被鼠抗人 肝素結(jié)合蛋白抗體,采用熒光免疫層析抗體夾心法的原理實(shí)現(xiàn)對血清中肝素結(jié)合蛋白濃度 的檢測。該試劑盒檢測肝素結(jié)合蛋白具有好的線性范圍,線性范圍為1~200yg/L,線性相關(guān) 系數(shù)R 2 0.990,陽性預(yù)測值范圍2 1 lyg/L;具有好的重復(fù)性,標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測試所得結(jié)果的變 異系數(shù)CV < 8% ;具有好的準(zhǔn)確度,標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差< 10%。
[0027] 本發(fā)明免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒的制備方法,操作簡便,易于 控制,適于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
【附圖說明】:
[0028] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒中的試 劑卡結(jié)構(gòu)示意圖;
[0029] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒外殼結(jié) 構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0031 ]下述實(shí)施例中兔抗人肝素結(jié)合蛋白抗體購自Abnova,商品名為H00000566-K;異硫 氰酸熒光素標(biāo)記的雞抗兔二抗購自Abnova,商品名為PAB29109;鼠抗人肝素結(jié)合蛋白抗體 購自Abno va,商品名為H00000566-B01P;肝素結(jié)合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自Abno va。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] -種免疫熒光層析法檢測肝素結(jié)合蛋白用試劑盒,包括第一緩沖液、第二緩沖液 和試劑卡;
[0034]所述第一緩沖液為含有1.5ngAU兔抗人肝素結(jié)合蛋白抗體的磷酸鹽緩沖液;所述 第二緩沖液為含有〇.12ygAU異硫氰酸熒光素
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