一種免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)療用品技術領域，尤其涉及生物和醫(yī)學檢測用醫(yī)療用品技術領域， 具體涉及一種免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，也是 全身十大常見腫瘤之一，占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次 于前列腺癌，居第2位。2012年全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率為6.61/10萬，列惡性腫瘤 發(fā)病率的第9位。膀胱癌可發(fā)生于任何年齡，甚至于兒童。其發(fā)病率隨年齡增長而增加，高發(fā) 年齡50~70歲，男性膀胱癌發(fā)病率為女性的3~4倍。目前診斷膀胱癌主要是尿液脫落細胞 檢測和內窺鏡檢查，但是尿液脫落細胞檢查靈敏度太低，只有34%，而內窺鏡檢查是有創(chuàng)檢 查不適合體檢，只適合確診。
[0003] 核基質蛋白22(NMP22)是核基質蛋白家族的一種，由2101個氨基酸組成，NMP22作 為膀胱癌的生物標志物是近幾年發(fā)現的指標。以10U/毫升為診斷參考值的時候，NMP22診斷 膀胱癌的靈敏度達到82.76%，當以NMP22體檢而陽性者用內窺鏡確診的情況下，對膀胱癌 診斷的靈敏度達到86%，特異度達到97%，所以NMP22作為診斷標志物具有非常的科學價值 和經濟價值。
[0004] 因此，研究開發(fā)出一種簡單、快速、準確測定出核基質蛋白22的濃度的方法，對于 膀胱癌的早期診斷和預防具有很大的臨床價值和意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種免疫熒光法檢測核基質蛋白22用試劑盒，該試劑盒能夠 靈敏、快速、準確、特異的測定核基質蛋白22的濃度。
[0006] 同時，本發(fā)明的目的還在于提供一種免疫熒光法檢測核基質蛋白22用試劑盒的制 備方法。
[0007] 為了實現以上目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0008] -種免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒，包括緩沖液和試劑卡；
[0009] 所述緩沖液為含有0.25~0.92ngAil熒光標記的兔抗人核基質蛋白22抗體的磷酸 鹽緩沖液；
[0010]所述試劑卡包括試紙條，所述試紙條包括塑料墊板，塑料墊板上設置硝酸纖維素 膜，硝酸纖維素膜上左右間隔設置檢測線和質控線，檢測線左側硝酸纖維素膜上設置玻璃 纖維素膜，質控線右側硝酸纖維素膜上設置吸水紙，玻璃纖維素膜上設置濾血膜;所述檢測 線上包被鼠抗人核基質蛋白22抗體;所述質控線上包被羊抗兔抗體。
[0011]所述試劑卡還包括外殼，所述外殼包括連接在一起的上蓋和下蓋，所述上蓋上設 置有血樣孔和檢測窗;所述血樣孔的位置對應濾血膜的位置;所述檢測窗的位置對應檢測 線和質控線的位置，使檢測線和質控線處在檢測窗中。
[0012]所述檢測線上鼠抗人核基質蛋白22抗體的包被量為50~160ng/cm。
[0013]所述質控線上羊抗兔抗體的包被量為0.3~1 .Oyg/cm。
[0014] 所述磷酸緩沖液的pH=6.5~7.3，磷酸鹽濃度為30~80mmol/L。
[0015] 所述檢測線和質控線之間的間隔距離為5mm~10mm。
[0016] 所述試劑條的寬度為3mm~6mm。
[0017] 所述熒光標記的兔抗人核基質蛋白22抗體采用的熒光素的激發(fā)光波長為652nm， 發(fā)射光波長為668nm〇
[0018] 所述試劑盒的使用方法的操作步驟包括：
[0019] I:取不同濃度的核基質蛋白22標準品加入到緩沖液中，混合均勻后加入到試劑卡 的濾血膜上，室溫水平放置10~15min后，將試劑卡插入熒光免疫讀數儀，設定激發(fā)光波長 為652nm，發(fā)射光波長為668nm，讀取不同濃度核基質蛋白22標準品的熒光值，并將熒光值與 核基質蛋白22標準品的濃度值進行線性分析，繪制熒光值和核基質蛋白22濃度值標準曲 線，得到熒光值和核基質蛋白22的濃度關系式；
[0020] Π :取待測樣品加入到緩沖液中，混合均勻后加入到試劑卡的濾血膜上，室溫水平 放置10~15min，將試劑卡插入熒光免疫讀數儀，設定激發(fā)光波長為652nm，發(fā)射光波長為 668nm，讀取待測樣品的熒光值，將該熒光值帶入步驟I得到的關系式中，計算得到待測樣品 核基質蛋白22的濃度。
[0021] 所述試劑盒儲存在4~8°C環(huán)境下，在使用時首先將緩沖液在室溫下平衡15分鐘后 再使用。
[0022] 上述免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒的制備方法，包括以下操作步 驟：
[0023] 1)制備緩沖液:取熒光標記的兔抗人核基質蛋白22抗體加入磷酸鹽緩沖液中，混 合均勻，即得緩沖液；
[0024] 2)制備試劑卡:取硝酸纖維素膜，標記出檢測線和質控線，然后在檢測線上包被鼠 抗人核基質蛋白22抗體，在質控線上包被羊抗兔抗體，然后將硝酸纖維素膜、玻璃纖維素 膜、吸水紙、濾血膜依次搭接在塑料墊板上，并切割成所需寬度的試劑卡；
[0025] 3)將步驟1)制備的緩沖液、步驟2)制備的試劑卡，組裝，即得所述的免疫熒光層析 法檢測核基質蛋白22用試劑盒。
[0026] 上述步驟2)中采用噴點的方式在檢測線上包被鼠抗人核基質蛋白22抗體，在質控 線上包被羊抗兔抗體。
[0027] 本發(fā)明免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒，包括緩沖液和層析試劑卡， 緩沖液中加入熒光標記的兔抗人核基質蛋白作為捕獲抗體，試劑卡檢測線上包被鼠抗人核 基質蛋白22抗體作為檢測抗體，采用熒光免疫層析抗體夾心法的原理實現對尿液中核基質 蛋白22濃度的檢測。該試劑盒檢測核基質蛋白22線性范圍好，線性范圍為2.5~187U/ml，線 性相關系數R2 0.990,陽性預測值范圍2 10U/ml;同時本發(fā)明試劑盒檢測核基質蛋白22的 重復性好、準確度高，標準品重復測試所得結果的變異系數CV < 8%，相對標準偏差< 9%。
[0028] 本發(fā)明免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒的制備方法，操作簡便，易于 控制，適于工業(yè)化推廣應用。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實施例1提供的免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒中的試 劑卡結構示意圖；
[0030] 圖2為本發(fā)明實施例1提供的免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒外殼結 構示意圖。
【具體實施方式】
[0031 ]下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術方案進行詳細說明。
[0032]下述實施例和試驗例中焚光標記的兔抗人核基質蛋白22抗體購自Abeam，商品號 為ab204018;鼠抗人核基質蛋白22抗體購自Abeam，商品號為ab5675;核基質蛋白22抗體標 準品購自Abeam。
[0033] 實施例1
[0034] 本實施免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒，包括緩沖液和試劑卡；
[0035] 其中緩沖液為含有0.5ngAU熒光標記的兔抗人核基質蛋白22抗體的pH = 7.0、磷 酸鹽濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液;其中熒光標記采用的熒光素的激發(fā)光波長為652nm， 發(fā)射光波長為668nm;
[0036] 所述試劑卡包括試紙條，所述試劑條寬度為5mm，如圖1所示，包括塑料墊板1，塑料 墊板上設置硝酸纖維素膜2,硝酸纖維素膜2上左右間隔7mm設置檢測線3和質控線4,檢測線 3左側硝酸纖維素膜2上設置玻璃纖維素膜5，質控線4右側硝酸纖維素膜2上設置吸水紙6， 玻璃纖維素膜5上設置濾血膜7;所述檢測線上每厘米包被100ng鼠抗人核基質蛋白22抗體； 所述質控線上每厘米包被〇. 6yg羊抗兔抗體；
[0037] 所述試劑卡還包括外殼，所述試紙條放置于所述外殼內，如圖2所示，所述外殼包 括連接在一起的上蓋和下蓋，所述上蓋上設置有血樣孔8和檢測窗9;所述血樣孔8的位置對 應濾血膜的位置;所述檢測窗9的位置對應檢測線和質控線的位置，使檢測線和質控線處在 檢測窗中；所述外殼上蓋檢測窗右側空白處可作為用于記錄數據的記錄面10。
[0038] 本實施例免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒的制備方法，包括以下操作 步驟：
[0039] 1)制備緩沖液:取熒光標記的兔抗人核基質蛋白22抗體30ng，加入60μ1，ρΗ=7.0、 磷酸鹽濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，混合均勻，即得緩沖液；
[0040] 2)制備試劑卡:取硝酸纖維素膜，標記出檢測線和質控線，然后在檢測線上噴點包 被鼠抗人核基質蛋白22抗體，在質控線上噴點包被羊抗兔抗體，然后將硝酸纖維素膜、玻璃 纖維素膜、吸水紙、濾血膜依次搭接在塑料墊板上，并切割成所需寬度，然后裝入由上蓋和 下蓋連接在一起形成的外殼中，即得所述的試劑卡;其中外殼上蓋上設置有血樣孔和檢測 窗，所述血樣孔的位置對應濾血膜的位置，所述檢測窗的位置對應檢測線和質控線的位置， 使檢測線和質控線處在檢測窗中，所述外殼上蓋檢測窗右側空白處可作為記錄數據的記錄 面；
[0041] 3)將步驟1)制備的緩沖液、步驟2)制備的試劑卡，組裝，即得所述的免疫熒光層析 法檢測核基質蛋白22用試劑盒。
[0042]本實施例試劑盒儲存在4~8°C環(huán)境下。
[0043] 實施例2
[0044]本實施免疫熒光層析法檢測核基質蛋白22用試劑盒，包括緩沖液和試劑卡；
[0045]其中緩沖液為含有0.25ngAU熒光標記的兔抗人核基質蛋白22抗體的pH=6.5、磷 酸鹽濃度為80mm〇l/L的磷酸鹽緩沖液;其中熒光標記采用的熒光素的激發(fā)光波長為652nm， 發(fā)射光波長為668nm;
[0046] 所述試劑卡包括試紙條，所述試紙條寬度為3mm，包括塑料墊板，塑料墊板上設置 硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上左右間隔5_設置檢測線和質控線，檢測線左側硝酸纖維素 膜上設置玻璃纖維素膜，質控線右側硝酸纖維素膜上設置吸水紙，玻璃纖維素膜上設置濾 血膜;所述檢測線上每厘米包被50ng鼠抗人核基質蛋白22抗體;所述質控線上每厘米包被 〇.3yg羊抗兔抗體；
[0047] 所述試劑卡還包括外殼，所述試紙條放置于所述外殼內，所述外殼包括連接在一 起的上蓋和下蓋，所述上蓋上設置有血樣孔和檢測窗；所述血樣孔的位置對應濾血膜的位 置;所述檢測窗的位置對應檢測線和質控線的位置，使檢測線和質控線