一種晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞egfr的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測EGFR的新方法，尤其是檢測晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫 瘤細胞EGFR的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 晚期結(jié)直腸癌患者，靶向聯(lián)合化療可以明顯延長晚期結(jié)直腸癌無病無進展生存期 和總生存期。晚期結(jié)直腸癌患者臨床目前應(yīng)用的靶向藥物中。西妥西單抗是一種靶向EGFR 的IgGl單克隆抗體，已在臨床上應(yīng)用，并取得一定療效。
[0003] EGFR是配體激活受體酪氨酸激酶erB-B家族成員之一，其參與腸黏膜的生長、增殖 和再生，并在結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。在50%-85%的結(jié)直腸癌標本中 EGFR呈陽性表達，并且其表達程度與臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期、總生存期、5 年復(fù)發(fā)率等密切相關(guān)。
[0004] 人EGF受體（human epidermal growth factor receptor，HER)家族由4個成員組 成，分別稱為HER1 (EGF erbB)、HER2 (Neu/erbB2)、HER3 (erbB3)和HER4 (erbB4)，均屬于I 型 酪氨酸激酶受體基因家族。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以分為3個區(qū)域:細胞表面的配體結(jié)合區(qū)、跨膜 區(qū)和細胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)。EGFR在缺乏特異性配體時以單體形式存在，但與配體結(jié)合后 發(fā)生聚合。二聚體形式改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象，導致酪氨酸激酶活化和受體自身磷酸化，后者通 過JAK-STAT和PI 3K-Akt等轉(zhuǎn)導途徑將信號傳遞到細胞核內(nèi)，從而促進細胞增殖，血管生成、 轉(zhuǎn)移和抑制細胞凋亡。EGFR與惡性細胞的生長有關(guān)，激活EGFR可以促進腫瘤的生長和進展。
[0005] 目前常用的EGFR檢測方法為免疫組織化學方法，通過檢測結(jié)直腸癌組織標本中的 EGFR蛋白表達情況判定EGFR狀態(tài)。免疫組化法是以腫瘤組織為檢測對象，而對于晚期無法 獲取組織標本的結(jié)直腸癌患者，EGFR表達狀態(tài)評估變得困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實體腫瘤脫落進入外周血液 循環(huán)的腫瘤細胞，自1989年被發(fā)現(xiàn)以來，目前已有多種方法用于外周血循環(huán)腫瘤細胞的檢 測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預(yù)后以及選擇合適的 個體化治療具有重要的臨床意義。因 CTC檢測具有微創(chuàng)、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的"液 態(tài)活檢"。
[0007] 研究表明，外周血循環(huán)腫瘤細胞與原發(fā)瘤細胞活性存在一定的一致性。目前對于 晚期無法獲得臨床標本結(jié)直腸癌患者的治療仍采用經(jīng)驗用藥，為了避免無法獲取組織標本 的晚期結(jié)直腸癌患者無法檢測EGFR表達，進而不能評估患者EGFR狀態(tài)的不足，本發(fā)明提供 了一種晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞EGFR的檢測方法:利用膜過濾裝置分離獲得 無法獲取組織標本的晚期結(jié)直腸癌患者外周血中的CTC，運用細胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片， 進而檢測無法獲取組織標本的晚期結(jié)直腸癌患者外周血CTC的EGFR表達情況。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] -、利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的晚期結(jié)直腸癌患者外周血中的 CTC：
[0010] 1、采集晚期結(jié)直腸癌患者外周血:肘正中靜脈血5ml;
[0011] 2、外周血樣預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：lmmol/lEDTA+ 0.1%BSA，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%;
[0012] 3、利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環(huán)腫瘤細胞： 將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過 濾；
[0013] 4、過濾結(jié)束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環(huán)腫瘤細胞染色液A 液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈;濾液過濾完全后加入B液，lml，染色 2min，純水lml，沖洗2次，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存 在 CTC。
[0014] 二、運用細胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片：
[0015] 1、脫色:將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC 染色液，所述脫色液為:95 %酒精與100 %二甲苯按容積比1:1混勻。
[0016] 2、包裹:浸泡結(jié)束后取出濾膜，用顯微鏡擦鏡紙或濾紙包裹；
[0017] 3、固定:將包裹物置于10%中性福爾馬林中，固定4-6h;
[0018] 4、浸蠟包埋：固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細 胞石蠟塊；
[0019] 5、薄層切片:用切片機將細胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為4μπι的薄層切片。
[0020] 三、檢測晚期結(jié)直腸癌患者外周血CTC的EGFR表達情況：
[0021] 1、將CTC蠟塊薄層切片在染色缸中按以下步驟進行脫蠟和水化:二甲苯溶液浸泡3 次，每次10分鐘;無水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘;95 %乙醇溶液浸泡5分鐘;85 %乙醇溶 液浸泡5分鐘；75 %乙醇溶液浸泡5分鐘；蒸餾水浸泡2次，每次3分鐘;ΡΗ = 7.4的PBS浸泡3 次，每次3分鐘。
[0022] 2、采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法對組織抗原進行修復(fù):取ρΗ = 6.0檸檬 酸鹽緩沖液800_1500ml于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐 高溫不銹鋼切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，鍋蓋繼續(xù)加熱至噴汽開始計時，噴汽1-2分 鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用pH = 7.2-7.4 的PBS沖洗兩次，每次各3分鐘；
[0023] 3、3%H2〇2去離子水孵育5分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次3分 鐘；
[0024] 4、滴加 EGFR-抗，室溫或37 °C孵育1-2小時或4°C過夜，PBS沖洗3次，每次5分鐘；
[0025] 5、滴加通用型生物素化二抗，室溫或37 °C孵育60分鐘，PBS沖洗3次，每次2分鐘；
[0026] 6、應(yīng)用DAB溶液顯色：甩去roS液，每張切片加2滴或100μΙ新鮮配制的DAB溶液，顯 微鏡下觀察5-10分鐘；
[0027] 7、蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片:蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘;蘇木素復(fù)染1分 鐘;0.1 %鹽酸酒精分化;0.1 %氨水溶液返藍;50 %、70 %、85 %、95 %、無水乙醇脫水干燥； 二甲苯透明，中性樹脂膠封片；
[0028] 8、細胞病理學專家閱片，根據(jù)細胞著色程度判定EGFR表達情況。
[0029] 步驟中所述的膜過濾分離腫瘤細胞裝置，包括濾器、血樣容器、廢液缸和鐵架臺， 所述鐵架臺設(shè)有底座、立架和支架，所述血樣容器通過支架設(shè)置于鐵架臺上部，血樣容器的 下方為濾器，濾器通過輸液器聯(lián)通至廢液缸，廢液缸設(shè)置于底座上。
[0030] 所述濾器包括濾器上口、濾膜、載濾膜平臺和濾器下口，濾膜置于載濾膜平臺上； 濾器上口接血樣容器，濾器下口通過輸液器接廢液缸。
[0031 ]所述濾膜為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔。
[0032] 本發(fā)明的有益效果是:通過該技術(shù)方法，不用結(jié)直腸癌組織即可檢測到無法獲取 組織標本的晚期結(jié)直腸癌患者EGFR表達情況。該技術(shù)屬于微創(chuàng)，并能夠?qū)崟r檢測。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明的膜過濾裝置結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034] 圖2為本發(fā)明膜過濾裝置的濾器的結(jié)構(gòu)示意剖視圖；
[0035] 圖3為本發(fā)明膜過濾裝置的濾器濾膜的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0036] 圖4為晚期結(jié)直腸癌患者外周血分離獲取的循環(huán)腫瘤細胞影像圖；
[0037] 圖5為晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞EGFR免疫組化染色圖像。
[0038]圖中：1鐵架臺、2血樣容器、3濾器、4輸液器、5廢液缸、6濾器上口、7濾膜、8載濾膜 平臺、9濾器下口、10濾孔、11底座、12立架、13支架。
【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明闡述如下。
[0040] 運用此技術(shù)方法分離獲取并鑒定8例晚期結(jié)直腸癌患者（同時檢測8例正常人樣本 做陰性對照)外周血循環(huán)腫瘤細胞的實施例。
[0041] -、利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的晚期結(jié)直腸癌患者外周血中的 CTC：
[0042] 采集各樣本外周血5ml，用45ml稀釋液（成分：lmmol/l EDTA+0.1%BSA)稀釋外周 血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀釋后的血樣10分鐘。
[0043] 在固定的間期，組裝膜過濾裝置：如附圖1、圖2、圖3所示，該過濾裝置由濾器3、濾 膜7、血樣容器2、廢液缸5、鐵架臺1構(gòu)成。用lOmlPBS潤濕濾器3,然后將固定好的外周血樣加 入到膜過濾裝置的血樣容器2中，使其依靠重力自然過濾，CTC被截留在濾膜7上。
[0044] 腫瘤細胞直徑一般大于15微米，而血細胞(包括紅細胞、白細胞)直徑一般小于10 微米，因此當含有CTC的外周血經(jīng)過濾后，血細胞因直徑小于濾孔能夠被濾過，而CTC因直徑 大于濾孔被截留在濾膜上。
[0045]過濾結(jié)束后，從過濾裝置中取下濾器3，打開并移走濾器上口 6，將循環(huán)腫瘤細胞染 色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖