一種快速高分離度液相色譜檢測金銀花和山銀花藥材的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及中藥材檢測方法，具體涉及中藥材金銀花和山銀花的 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干 燥花蕾或帶初開的花，原產(chǎn)于亞洲東部，包括中國、日本、韓國。金銀花具有清熱解毒、涼散 風(fēng)熱及抗菌消炎等功效，被廣泛用于治療癰、急性痢疾、咽炎以及由病毒或細(xì)菌感染引發(fā)的 上呼吸道系統(tǒng)疾病。此外，金銀花還具有抗菌、抗炎及抗病毒（如：甲型H1N1流感病毒）等藥 理作用。雙黃連口服液是一種傳統(tǒng)的復(fù)方中藥，金銀花作為其主要原料之一，主要用于治療 上呼吸道感染、急性支氣管炎以及輕度肺炎。金銀花還廣泛應(yīng)用于食品、飲料以及其他相關(guān) 產(chǎn)品。因此，金銀花獲得了廣泛的關(guān)注和市場需求，其結(jié)果不可避免的是市場上發(fā)現(xiàn)了大量 金銀花摻假產(chǎn)品，主要是摻入不同種類的山銀花。山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬 Loniceramacranthoides Hand · -Mazz ·、華南忍冬Loni ceraconfusa DC ·、紅腺忍冬 LonicerahypoglaucaMiq.或黃褐毛忍冬Lonicerafulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干 燥花蕾或帶初開的花，摘自《中國藥典》。雖然這兩種草藥外觀形態(tài)和化學(xué)成分不同，但其藥 材特性和適應(yīng)癥類似。按《中國藥典》采用高效液相色譜法測定，山銀花含綠原酸 (C16H1809)不得少于2.0%，含灰氈毛忍冬皂苷乙（C65H106032)和川續(xù)斷皂苷乙 (C53H86022)的總量不得少于5.0%。金銀花含綠原酸(C16H1809)不得少于1.5%，含木犀草 苷(C21H20011)不得少于0.050%。綠原酸(3-0-咖啡?？鼘幩?是金銀花中的主要化合物， 可作為重要的標(biāo)志物用于檢測。大量研究表明，綠原酸有潛在的抗炎、鎮(zhèn)痛、退熱、抗誘變和 抗癌活性[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，HPLC法與UV-LESD[4]或者M(jìn)S[5]聯(lián)用可用于分析金銀花的活性成 分。然而，這些方法不僅分析時間長，而且需使用大量有機(jī)溶劑作為流動相。目前，尚未發(fā)現(xiàn) 有相對LC更簡便的方法可從金銀花中區(qū)分出山銀花，尤其是RRLC法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的任務(wù)是提供一種快速高分離度液相色譜檢測金銀花和山銀花藥材的方 法。
[0004] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供的這種快速高分離度液相色譜檢測金銀花和山銀花藥材的方法，其特 征在于，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.1 %甲酸水溶液為流動相A，以含 〇. 1 %甲酸的乙腈溶液為流動相B對待檢藥材樣品檢測。該方法的色譜條件為:柱溫為40°C， 流速為1 .〇ml/min，進(jìn)樣量為ΙμL，按下表進(jìn)行梯度洗脫：
[0006]
[0007] 檢測波長為327nm(0~3min)、350nm(3~5min)，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測阜苷類 化合物(5~8min)。
[0008] 本發(fā)明提供的這種快速高分離度液相色譜檢測金銀花和山銀花藥材的方法，包括 制備待測樣品溶液、色譜檢測、結(jié)果判斷三個步驟，各步驟的具體方法是：
[0009] 步驟一、制備待測樣品溶液:取待測樣品，用研缽磨成細(xì)粉，取細(xì)粉0.10g，精密稱 定，然后加70 %甲醇水溶液10ml，并在37 °C超聲處理15min，超聲處理后，放冷至室溫，用 70%的甲醇水溶液調(diào)整至10ml，制得待測樣品溶液；
[0010] 步驟二、色譜檢測：
[0011] 取待測樣品溶液用〇 . 20μπ?的濾膜過濾，取ΙμL進(jìn)樣，記錄色譜，
[0012] 色譜條件為：
[0013] 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Luna C18-HST(2)柱(2.5μπι，100mm X 3.0mm));
[0014] 以0.1 %甲酸水溶液為流動相A，以含0.1 %甲酸的乙腈溶液為流動相B，柱溫為40 °C；
[0015] 流速為 1 .Oml/min;
[0016] 進(jìn)樣量為ΙμL;梯度洗脫見表1。
[0017]表1梯度洗脫
[0018]
[0019] 檢測波長為327nm(0~3min)、350nm(3~5min)，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測阜苷類 化合物(5~8min);
[0020] 步驟三、結(jié)果判斷:將所得色譜圖與金銀花及山銀花指紋圖譜比較，主峰即為綠原 酸，金銀花及山銀花都有此主峰，所述的主峰具體為2.295min處的色譜峰;6min處出現(xiàn)兩個 色譜峰即判斷樣品為山銀花，具體是6.021min和6.341min處有兩個色譜峰即判斷樣品為山 銀花，此兩個色譜峰分別為灰氈毛忍冬皂苷乙峰和川續(xù)斷皂苷乙峰。6min處無特征色譜峰 即判斷樣品為金銀花。
[0021] 本發(fā)明提供的快速高分離度液相色譜檢測金銀花和山銀花藥材的方法具有操作 簡單，方法可靠，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可用于綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂 苷乙的含量測定。此外，該方法可以很容易地在8分鐘內(nèi)通過檢測出皂苷類化合物而區(qū)分出 山銀花。
[0022]本發(fā)明方法的具體色譜條件為:Agilent 1200SL型高效液相色譜儀(MW檢測器、自 動進(jìn)樣器）；色譜柱：Luna C18-HST(2.5ym，100X3.0mm);流動相：流動相 Α(Η20+0· 1% HC00H);流動相B(CH3CN+0.1 %HC00H);梯度洗脫見表1;流速：1.0ml/min;檢測波長:UV檢測 器：327nm(0 ~3min)、350nm(3 ~5min);ELSD 檢測器（5 ~8min);柱溫：40°C;進(jìn)樣量：1μ1;總 分析時間：8min。
[0023] 實(shí)驗(yàn)資料 [0024] 1.實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0025]灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬分別從重慶、貴州、廣州收集，并通過psbA-trnH基因間的間距器[6]確定山銀花樣品的產(chǎn)地。
[0026] 2.1.試劑與材料
[0027] 甲醇:色譜純，F(xiàn)isher Scientific (Ottawa，加拿大）
[0028] 乙臆:色譜純，F(xiàn)isher Scientific (Ottawa，加拿大）
[0029] 純水:Nanopure超純水系統(tǒng)（Barns tead，美國）
[0030] 甲酸：色譜純，J.T.Baker Chemical Company(London，英國）
[0031 ] 川續(xù)斷皂苷乙（96%)對照品：TauToBioTech(上海，中國）
[0032] 綠原酸、木犀草苷(91.5%)、氈毛忍冬皂苷乙（93.3%)對照品：中國藥品生物制品 檢定所(北京，中國）
[0033] 金銀花：山東、河南、湖南、貴州、湖北、河北、四川、山西。
[0034]綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙等活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1〇
[0035] 2.2.溶液的制備
[0036] 單一對照品溶液儲備液：
[0037] 分別取綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙對照品適量，以甲醇 為溶劑，制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液儲備液，保存于4°C。
[0038] 分別精密量取上述對照品溶液儲備液適量，稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml備用。 [0039]供試品溶液：
[0040]供試品灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬等山銀花品種藥材和金銀花藥材被保 存在干燥器中。
[0041 ]取5g樣品磨成細(xì)粉，取細(xì)粉0.10g，精密稱定，然后用10ml70 %甲醇水溶液提取并 在37 °C超聲處理15分鐘。
[0042] 超聲處理后，用70%的甲醇水溶液調(diào)整至10ml。在進(jìn)樣之前，所有液體樣品用0.20 Ml的濾膜(VWR Internationa 1:Mississauga，Canada)過濾，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶 液。
[0043] 2.3.實(shí)驗(yàn)儀器和色譜條件
[0044] Agilent 1200SL型高效液相色譜儀(MW檢測器、自動進(jìn)樣器）；
[0045] 色譜柱：Luna C18-HST(2·5μπι，100X3.0mm);
[0046] 流動相：流動相Α(Η20+0 · 1 %HC00H);
[0047] 流動相B(CH3CN+0 · 1 %HC00H);
[0048] 梯度洗脫見表1;
[0049] 流速：1 .Oml/min;
[0050] 檢測波長:UV 檢測器：327nm(0 ~3min)、350nm(3 ~5min);ELSD 檢測器（5 ~8min)
[0051] 柱溫：40 °C
[0052] 進(jìn)樣量：1μ1
[0053] 總分析時間：8min
[0054] 表1梯度洗脫
[0055]
[0056] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
[0057] 3.1.實(shí)驗(yàn)方法的建立
[0058]流動相和檢測波長的確定是RRLC法最重要的兩點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中曾對多種流動相進(jìn)行考 察，如以0.1 %磷酸水溶液為流動相A。需用ELSD來檢測山銀花中的皂苷類化合物，因此，流 動相A選用具有揮發(fā)性的溶劑甲酸來代替磷酸。通過比較對照品溶液的紫外吸收，發(fā)現(xiàn)綠原 酸在327nm處具有特征吸收，木犀草苷最大吸收在350nm處，而灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂 苷乙均沒有紫外吸收。因此，檢測波長被確定為327nm(0~3min)，350nm(3~5min)和ELSD 檢測器(5~8min)，來同時分析金銀花中的目標(biāo)化合物。
[0059] 3.2.方法學(xué)驗(yàn)證
[0060] 3.2.1線性和范圍、檢測限和定量限、回收率實(shí)驗(yàn)
[0061] 以峰面積(y)對濃度x(mg/ml)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果見表2。相關(guān) 系數(shù)均高于0.99,可知綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量濃度在相 應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系，可以滿足測定要求。
[0062] 圖2為"2.3 .實(shí)驗(yàn)儀器和色譜條件"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析的混合對照品溶液的 RRLC色譜圖（綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙）；
[0063]信噪比（S/N)為3:1計(jì)算，綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙檢 測限分別為 0.08、0.16、0.25、0.24ug/ml;
[0064] 信噪比（S/N)為10:1計(jì)算，定量限分別為綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川 續(xù)斷皂苷乙 〇.28、0.50、0.85、0.85ug/ml;
[0065] 回收率實(shí)驗(yàn)可對方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行評價(jià)。正品金銀花和黃褐毛忍冬、華南忍冬等 山銀花品種的粉末提取物中分別摻入已知量的四個對照。然后將樣品以一式三份進(jìn)行提取 分析。并將結(jié)果與原來未摻入對照品的樣品進(jìn)行比較。4種生物活性化合物的回收率為 95.5-99.5%，4種對照品的RSD值均小于2.35%。
[0066]表24個對照品化合物的回歸方程，檢測限和定量限，保留時間，回收率 [0067](綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙）
[0068]
[0069] 3.2.2精密度實(shí)驗(yàn)
[0070]由兩名實(shí)驗(yàn)人員提取分析3批金銀花和黃褐毛忍冬、華南忍冬等山銀花品種的藥 材，進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。每位實(shí)驗(yàn)人員用各自制備的流動相溶液制備一式兩份的樣品溶液進(jìn) 行提取分析。所有待測樣品中的綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的RSD 值均小于1.8%，表明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的重現(xiàn)性。
[0071] 3.2.3耐用性實(shí)驗(yàn)
[0072] 研究不同的色譜參數(shù)對分離的影響可以評價(jià)方法的耐用性，可通過系統(tǒng)地改變下 列因素:流動相A的pH值設(shè)置為1.8、2.0和2.2，流速設(shè)置為為0.95、1.0和1.05ml/