一種基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學診斷領域，特別涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒及其制備方法和應用,該試劑盒由檢測反應杯、熒光標記抗體及清洗液組成。在具體檢測時，先繪制標準曲線，然后將待測樣品加入檢測反應杯內，再加入熒光標記抗體，30℃?40℃溫育，用清洗液清洗去除未結合的抗原及熒光標記抗體；然后將熒光信號與標準曲線比對，獲得所述待測樣品的肌紅蛋白濃度。所述肌紅蛋白的檢測方法，由于其超高的靈敏度，易于實現(xiàn)自動化操作，而且反應溫度均一，不受環(huán)境因素影響，準確性更好，精密度也非常優(yōu)異。
【專利說明】
一種基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒及其 制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學診斷領域，特別涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅 蛋白分析試劑盒及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴重疾病，已成為21世紀人類健康的頭號殺 手。2009年8月拜耳醫(yī)藥在歐洲心臟病學會年會上報道指出2005年全球約有1750萬人死于 心血管疾病，預計2015年這一數(shù)字將攀升到2000萬人，大約有一半病例發(fā)生在亞太地區(qū)。生 活條件的改善和生活方式的轉變，使中國人發(fā)生心血管疾病的風險迅速趕超美國等發(fā)達國 家。
[0003] 我國1990年城市居民心血管疾病死亡率為92/10萬人，2000年為106/10萬人，平均 每年死亡增長率為1.3%。2008年死亡率已達到121/10萬人，相比2000年時，平均死亡增長 率為1.4%，其中急性心肌梗塞的死亡率占到其中的三分之一，說明心肌梗塞死亡率仍呈不 斷增長趨勢。隨著中國人口老齡化趨勢，按平均死亡增長率為1.5%計算，到2015年，血管疾 病死亡率將達到141/10萬人，急性心肌梗塞的死亡率將達到47/10萬人。
[0004] 中國衛(wèi)生部2008年公布的急性心肌梗塞的死亡率為39.72/10萬人，每年急性心肌 梗塞的發(fā)病人數(shù)超過500萬人，至少有超過200萬的人群去醫(yī)院就醫(yī)進行心肌梗塞疾病的相 關檢測，這并不包含每年因胸痛懷疑為心肌梗塞的病人人數(shù)，實際醫(yī)院每年檢測人數(shù)已達 千萬人次。
[0005] 心肌梗塞的典型臨床癥狀是胸痛，心律失常，心力衰竭等。但實際臨床上胸痛的癥 狀表現(xiàn)復雜多樣，危險性差異也較大，還有心梗病人無典型癥狀。醫(yī)學上將急性心肌梗死發(fā) 病后6小時以內作為搶救的"黃金時間"，超過這個時間段，治療效果就會大打折扣，甚至產(chǎn) 生嚴重后果危及生命。中華醫(yī)學檢驗分會2006年制定的"冠狀動脈疾病和心力衰竭時心臟 標志物臨床檢測應用建議"指出，適用于臨床的心臟標記物應具有較好的診斷、危險分層和 預后估計的價值，分析檢測方法應特異、靈敏、快速，而且心臟標志物的檢測周轉時間< 60min〇
[0006] 肌紅蛋白（ΜΥ0)是一種早期心肌標志物，ΜΥ0是一種氧結合血紅素蛋白，主要分布 于心肌和骨骼肌組織。在急性心肌損傷時，ΜΥ0最先被釋放入血液中，在癥狀出現(xiàn)約2-3小時 后，血中ΜΥ0可超出正常上限，9-12小時達到峰值，24-36小時后恢復正常。對于懷疑急性冠 脈綜合征(ACS)的病人建議連續(xù)采樣測定，因為癥狀出現(xiàn)和蛋白標志物釋放到血液之間有 一段延遲。在ACS早期診斷和監(jiān)測的臨床效用已有大量文獻報告。ΜΥ0陰性有助于排除心梗。
[0007] 傳統(tǒng)上ΜΥ0多用乳膠比濁法，化學發(fā)光法及膠體金免疫層析法或者熒光免疫層析 法等方法測定。乳膠比濁法一般采用多克隆抗體包被乳膠微球，靈敏度和特異性都不理想， 如果采用單克隆抗體包被乳膠微球，則試劑成本很高。化學發(fā)光法對技術要求高，操作步驟 相對比較繁瑣，需要多步試劑添加過程。膠體金免疫層析法雖然具有標本用量少，簡便快 速，便宜的優(yōu)勢，然而當遇到某些樣品中抗原或抗體含量極低時，膠體金的顏色將很淺甚至 無顯色，很難用肉眼來判斷結果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低。熒光免疫層析法雖然靈敏度 比膠體金免疫層析法要高，但是其檢測精密度并不理想，靈敏度與大型化學發(fā)光或者電化 學發(fā)光儀器仍有差距。
[0008] 時間分辨焚光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一種非同位素焚光標記物， 與普通熒光相比，具有Stock位移大，熒光壽命長等特點，可以有效的避免樣品中的本底熒 光，以及激發(fā)光等雜散光的影響，因此相比普通熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。
[0009] 目前市面上采用時間分辨熒光檢測的試劑均采用解離增強鑭系元素熒光免疫分 析(DELFIA)，它采用具有雙功能基團結構的螯合物，使其一段與銪(Eu)連接，另一端與抗 體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應后形成免疫復合 物，由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，需要加入一種解離增強劑，使得銪離子從復 合物上解離下來，并與增強劑中的另一種螯合劑形成膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的 激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒，該 試劑盒能在較短的檢測時間內完成肌紅蛋白的檢測，檢測時間短，檢測靈敏度高。
[0011]本發(fā)明還提供了基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒的制備方法。
[0012] 本發(fā)明還提供了基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白的檢測方法。
[0013] 為了實現(xiàn)以上技術效果，本發(fā)明是通過如下步驟實現(xiàn)：
[0014] -種基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒，其特征在于:該試劑盒 由檢測反應杯、熒光標記抗體及清洗液組成;該試劑盒的檢測基礎是雙抗體夾心的免疫反 應。
[0015] 所述檢測反應杯的固相表面包被有肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體；
[0016] 所述熒光標記抗體為時間分辨熒光微球與肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體通 過共價鍵交聯(lián)。
[0017] 所述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物，其粒徑為100-1000nm。優(yōu)選的， 所述鑭系元素螯合物為銪螯合物。進一步優(yōu)選的，該銪螯合物為Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA) 3/Phen〇
[0018] 上述基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒的制備方法，其步驟包 括，
[0019] (1)、檢測反應杯的制備:將肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體稀釋后37°C包被， 并用封閉緩沖液封閉、拍干;置于37°C的干燥箱中烘干、密封保存；
[0020] 優(yōu)選的，將肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體用〇.2mol/L的磷酸緩沖液稀釋至20 yg/mL，200yL/孔，37 °C包被4小時，并用封閉緩沖液按300yL/孔加入反應杯，37 °C封閉4小 時，棄去包被反應杯中的封閉液，拍干，置于37°C的干燥箱中烘干、密封保存；
[0021] (2)、熒光標記抗體的制備:將時間分辨熒光微球活化;然后加入肌紅蛋白單克隆 抗體或多克隆抗體混勻、封閉、清洗，并用反應緩沖液稀釋，獲得終濃度到20-50yg/mL的熒 光標記抗體；
[0022] (3)清洗液的制備:該清洗液中含有1?，NaCl，Tween 20，該清洗液的pH值為7-9。優(yōu) 選的，清洗液中含有5mmol/L的PB，0.9 % NaCl，0.05 % Tween 20，該清洗液的pH值為7.8。
[0023] 所述步驟(2)中，時間分辨熒光微球活化的步驟為，在羧基時間分辨熒光微球中加 入MES和EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15-60min，加入MES、NHS和EDC進行 再次活化處理;每lmg羧基時間分辨焚光微球對應10-100yL 50mmol/L氨基己酸。
[0024] 優(yōu)選的，所述初次活化處理包括:每lmg羧基時間分辨熒光微球，加60yL 500mmol/ L ρΗ5·0_7·0的MES，0.02-0.2mg 1-(3-二甲氛基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，加純化水 至終體積600yL，室溫混勻15~60min;
[0025] 所述再次活化處理包括：加入所述氨基己酸室溫混勻后，加lmL 100mm〇l/L的MES pH6 · 0，離心清洗15000rpm 20min，棄去上清；加400yL的100mmol/L的MES pH6 · 0，超聲分離， 加0.02-0.211^1羥基琥珀酰亞胺，加0.01-0.111^0(：，室溫混勻151^11;加11^100臟〇1/1的 MES ρΗ5·0-7·0緩沖液，離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清；100mmol/L MES ρΗ5·0-7·0緩 沖液恢復到lmL。熒光微?；罨^程中添加氨基己酸作為手臂，使得抗體與微球之間的距離 增加，有效的降低了空間位阻效應，提高了檢測系統(tǒng)靈敏度。
[0026] 上述基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白的檢測方法，其步驟包括，
[0027] (A)、標準曲線的繪制:采用基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒測 定不同濃度的校準品，并根據(jù)熒光讀數(shù)儀上的熒光信號值，以校準品濃度為橫坐標，以熒光 信號值為縱坐標，繪制成標準曲線；
[0028] (B)、將待測樣品加入檢測反應杯內，再加入熒光標記抗體，30°C-4(TC溫育，用清 洗液清洗去除未結合的抗原及熒光標記抗體；
[0029] (C)在340-380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試檢測反應杯中熒光信號，檢測波長為600- 630nm；
[0030] (D)將所述熒光信號與步驟(A)中的標準曲線比對，獲得所述待測樣品的肌紅蛋白 濃度。
[0031] 所述步驟(A)中，濃度為為0、l、10、50、100、200、400、800ng/mL的校準品中加入熒 光標記抗體，37°C溫育5-25min，然后用清洗液清洗去除未結合的抗原及熒光標記抗體，所 述校準品與熒光標記抗體的體積比為1:8-12。
[0032]所述步驟(B)中，待測樣品與熒光標記抗的體積比為1:8-12，溫育溫度為37°(：。 [0033]本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 1)本發(fā)明所制備的熒光標記物為時間分辨熒光乳膠微球，每個微球中填充了幾萬 到幾十萬個稀土元素離子螯合物，檢測過程中并不需要解離增強過程，便可發(fā)出很強的熒 光，簡化了時間分辨熒光檢測步驟，解離增強時間分辨熒光檢測往往需要1個小時左右時間 才能得到檢測結果，而采用時間分辨熒光微球作為標記物，由于每個微球中填充了大量的 鑭系元素螯合物，熒光信號放大數(shù)千倍以上，因此可以在5-20分鐘的檢測時間內完成檢測， 縮短了檢測時間，并有效的提高了檢測靈敏度。
[0035] 2)熒光微?；罨^程中添加氨基己酸作為手臂，使得抗體與微球之間的距離增 加，有效的降低了空間位阻效應，提高了檢測系統(tǒng)靈敏度。
[0036] 3)本發(fā)明提供的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白的檢測方法，由于其超高 的靈敏度，易于實現(xiàn)自動化操作，而且反應溫度均一，不受環(huán)境因素影響，準確性更好，精密 度也非常優(yōu)異。
【附圖說明】
[0037]圖1是本發(fā)明的原理示意圖。
[0038] 圖2是本發(fā)明根據(jù)熒光讀數(shù)儀上的熒光信號值，以校準品濃度為橫坐標，以熒光信 號值為縱坐標，繪制成的標準曲線。
[0039] 圖3是采用實施例1中制備的試劑組合成肌紅蛋白時間分辨熒光定量試劑盒，測定 臨床樣本，與化學發(fā)光臨床樣本測試結果的對比結果圖。
[0040] 圖1中：1為熒光標記抗體，2為肌紅蛋白抗原，3為包被抗體，4為反應杯固相表面，5 為光免疫復合物。
【具體實施方式】
[0041] 下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步說明：
[0042] 實驗所用到的設備:PerkinElmer公司的Victor X4多功能酶標儀。
[0043] 本發(fā)明的原理示意圖如圖1所示，包被抗體3結合在反應杯固相表面4上，在反應杯 中添加一定量的樣品使得樣品中的肌紅蛋白抗原2與反應杯固相表面結合的抗體3結合，再 加入熒光標記抗體1，溫育形成發(fā)光免疫復合物5,采用清洗液清洗反應杯后去除未結合的 抗原及熒光標記抗體，檢測反應杯中的熒光信號，與標準曲線進行對比，得到待測樣本中肌 紅蛋白的濃度。
[0044] 實施例1
[0045] (1)、檢測反應杯的制備：
[0046] A、檢測反應杯包被：肌紅蛋白抗體7004(Medix公司）用0.2mol/L的磷酸緩沖液 (pH7 · 8)稀釋成20μg/ml，200yL/孔，37 °C包被4小時，洗板。
[0047] B、檢測反應杯封閉：用封閉緩沖液按300μ!7孔加入反應杯，37°C封閉4小時，棄去 包被反應杯中的封閉液，拍干。
[0048] C、檢測反應杯干燥:將上述封閉好的反應杯放置于濕度低于30%的37°C干燥箱中 烘干8小時，密封干燥保存。
[0049] (2)、熒光標記抗體的制備：
[0050] A、熒光微?；罨?br>[0051 ]取111^羧基時間分辨焚光微球（20〇11111，0.11111，1〇11^/1111^，1^叫81313公司），加6(^1^ 500mmol/L的MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積600yL，室溫混勻15min。加100yL 50mmol/L 氨基己酸，室溫混勾30min。加lmL 100mmol/L MES ρΗ6·0,離心清洗15000rpm 20min，棄去 上清。加400yL lOOmmol/L MES ρΗ6·0,超聲分離，加0.2mg N-羥基琥?自酰亞胺（NHS)，加 O.lmgEDC，室溫混勾 15min。加lmL 100mmol/L MES ρΗ6·0緩沖液，離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清。100mmol/L MES pH6.0緩沖液恢復到lml。
[0052] B、抗體交聯(lián)：加0.2mg的肌紅蛋白單克隆抗體7001(Medix公司），室溫25°C混勻 60min〇
[0053] C、封閉：加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0054] D、清洗:加 3mL交聯(lián)緩沖液，25000rpm離心清洗30min，棄去上清。加 500yL緩沖液， 超聲分離，終濃度2mg/mL。
[0055] E、工作用熒光標記抗體配制：
[0056] 配制反應緩沖液:緩沖液中含有50mmol/L tris，1 %酪蛋白，0.9%NaCl，1 %葡聚 糖，0.5%tween 20,ρΗ7.2。
[0057]用反應緩沖液將上述清洗好的熒光標記抗體稀釋到終濃度到30yg/mL，作為檢測 用熒光標記抗體。
[0058] (3)、清洗液的制備
[0059] 配制清洗緩沖液，含5mmol/L PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，ρΗ7·2。
[0060] 實施例2
[00611 (1)標準曲線的繪制：
[0062] 采用實施例1中制備的試劑組合成肌紅蛋白時間分辨熒光定量試劑盒，測定校準 品，每個濃度重復10次。
[0063] 每個檢測中加入校準品5yL，熒光標記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進行讀數(shù)(激發(fā)波長340-380nm,檢測波 長600-630nm)具體數(shù)據(jù)如表1所示。
[0064] 表 1
[0065]
[0066] 根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，以校準品濃度為橫坐標，以熒光信號均值為縱坐標，繪制成標 準曲線。標準曲線如圖2所示。該標準曲線線性良好，可以通過該標準曲線對樣本中所含的 肌紅蛋白濃度進行定量分析。
[0067] 通過表1結果可知，檢測試劑盒的批內精密度良好，校準品各濃度點精密度均小于 10%，且試劑靈敏度良好(0值校準品除外），在Ing/mL水平與0值校準品有顯著區(qū)分。
[0068] (2)、樣本檢測
[0069] 采用實施例1中制備的試劑組合成肌紅蛋白時間分辨熒光定量試劑盒，測定臨床 樣本，與Beckman access2系統(tǒng)測試結果進行相關性分析。
[0070] 每個檢測中加入樣品5yL，熒光標記抗體50yL，37°C溫育20min，然后清洗檢測杯， 在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進行讀數(shù)(激發(fā)波長340-380nm,檢測波長 600-630nm)，將測試結果帶入圖2標準曲線，計算樣品測試濃度，測試結果如表2所示，與 Beckman access2系統(tǒng)測試結果進行相關性分析，相關性曲線如圖3所示。
[0071] 表2臨床樣本測試結果
[0072]
[0073] 從圖3中可知，本發(fā)明的試劑盒測定結果與Beckman儀器及配套試劑盒測定結果相 關系數(shù)R2為0.986，相關性很好。Beckman access2系統(tǒng)和配套的肌紅蛋白試劑盒是知名的 化學發(fā)光檢測試劑盒，但其價格昂貴，一般只有大型三甲醫(yī)院的中心實驗室才有配置，其精 度和結果公認可靠。但是本發(fā)明制備的試劑盒無論從價格上還是從檢測準確度上考慮，可 用于臨床診斷使用。
[0074] 實施例3
[0075] (1)、檢測反應杯的制備：
[0076] A、檢測反應杯包被：肌紅蛋白抗體7004(Medix公司）用0.2mol/L的磷酸緩沖液 (pH7 · 8)稀釋成20μg/ml，200yL/孔，37 °C包被4小時，洗板。
[0077] B、檢測反應杯封閉：用封閉緩沖液按300μ!7孔加入反應杯，37°C封閉4小時，棄去 包被反應杯中的封閉液，拍干。
[0078] C、檢測反應杯干燥:將上述封閉好的反應杯放置于濕度低于30%的37°C干燥箱中 烘干8小時，密封干燥保存。
[0079] (2)、熒光標記抗體的制備：
[0080] A、熒光微?；罨?br>[0081 ]取111^羧基時間分辨焚光微球（20〇11111，0.11111，1〇11^/1111^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加0.4mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，40yL，10mg/mL)，加純化水至終體積 600yL，室溫混勾 15min。加lmL 1 OOmmol /], MES ρΗ6·0,離心清洗 15000rpm 20min，棄去上 清。
[0082] B、抗體交聯(lián)：加0.2mg的肌紅蛋白單克隆抗體7001(Medix公司），室溫25°C混勻 60min〇
[0083] C、封閉：加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0084] D、清洗:加3mL交聯(lián)緩沖液，25000rpm離心清洗30min，棄去上清。加500yL緩沖液， 超聲分離，終濃度2mg/mL。
[0085] E、工作用熒光標記抗體配制：
[0086] 配制反應緩沖液:緩沖液中含有50mmol/L tris，1 %酪蛋白，0.9%NaCl，1 %葡聚 糖，0.5%tween 20,ρΗ7.2。
[0087]用反應緩沖液將上述清洗好的熒光標記抗體稀釋到終濃度到30yg/mL，作為檢測 用熒光標記抗體。
[0088] (3)、清洗液的制備
[0089] 配制清洗緩沖液，含5mmol/L PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，ρΗ7·2。
[0090] (4)、校準品測試
[0091] 采用上述方法制備的試劑組合成肌紅蛋白時間分辨熒光定量試劑盒，測定校準 品，每個濃度重復10次。
[0092]每個檢測中加入校準品5yL，熒光標記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進行讀數(shù)。
[0093] 通過表3結果可知，檢測試劑盒的批內精密度良好，校準品各濃度點熒光信號精密 度均小于10% (除0和lng/ml水平以外），試劑靈敏度相比實施例1來說有所降低，僅在5ng/ ml水平與0值校準品有較為顯著區(qū)分。說明熒光微粒前處理過程中通過添加手臂的方式能 有有效的提升檢測的靈敏度。
[0094] 表3肌紅蛋白定量檢測標準曲線數(shù)據(jù)
[0095]
【主權項】
1. 一種基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒，其特征在于：該試劑盒由 檢測反應杯、熒光標記抗體及清洗液組成； 所述檢測反應杯的固相表面包被有肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體； 所述熒光標記抗體為時間分辨熒光微球與肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體通過共 價鍵交聯(lián)。2. 根據(jù)權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒，其特征 在于:所述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物，其粒徑為l〇〇-l〇〇〇nm。3. 根據(jù)權利要求2所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒，其特征 在于:所述鑭系元素螯合物為銪螯合物。4. 根據(jù)權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒的制備方 法，其步驟包括， (1) 、檢測反應杯的制備:將肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體稀釋后37°C包被，并用 封閉緩沖液封閉、拍干;置于37°C的干燥箱中烘干、密封保存； (2) 、熒光標記抗體的制備:將時間分辨熒光微球活化;然后加入肌紅蛋白單克隆抗體 或多克隆抗體混勻、封閉、清洗，并用反應緩沖液稀釋，獲得終濃度到20-50yg/mL的熒光標 記抗體； (3) 清洗液的制備:該清洗液中含有PB，NaCl，Tween 20，該清洗液的pH值為7-9。5. 根據(jù)權利要求4所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒的制備方 法，其特征在于:所述步驟(2)中，時間分辨熒光微球活化的步驟為，在羧基時間分辨熒光微 球中加入MES和EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15-60min，加入MES、NHS和 EDC進行再次活化處理;每lmg羧基時間分辨熒光微球對應10-100yL 50mmol/L氨基己酸。6. 根據(jù)權利要求5所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒的制備方 法，其特征在于:所述初次活化處理包括:每lmg羧基時間分辨熒光微球，加60yL 500mmol/L pH5.0-7.0的MES，0.02-0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，加純化水至 終體積600yL，室溫混勻15-60min; 所述再次活化處理包括：加入所述氨基己酸室溫混勻后，加 lmL 100mm〇l/L的MES pH6 · 0，離心清洗15000rpm 20min，棄去上清；加400yL的100mmol/L的MES pH6 · 0，超聲分離， 加0.02-0.211^1羥基琥珀酰亞胺，加0.01-0.111^0(：，室溫混勻151^11;加11^100臟〇1/1的 MES ρΗ5·0-7·0緩沖液，離心清洗 15000rpm20min，棄去上清；100mmol/L MES ρΗ5·0-7·0緩 沖液恢復到lmL。7. 根據(jù)權利要求4所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒的制備方 法，其特征在于：所述步驟（3)中的清洗液中含有5mmo 1/L的PB，0 · 9 % NaCl，0 · 05 % Tween 20,該清洗液的pH值為7.8。8. 權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白的檢測方法，其步驟包括， (A) 、標準曲線的繪制:采用基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白分析試劑盒測定不 同濃度的校準品，并根據(jù)熒光讀數(shù)儀上的熒光信號值，以校準品濃度為橫坐標，以熒光信號 值為縱坐標，繪制成標準曲線； (B) 、將待測樣品加入檢測反應杯內，再加入熒光標記抗體，30°C-4(TC溫育，用清洗液 清洗去除未結合的抗原及焚光標記抗體； (C) 在340-380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試檢測反應杯中熒光信號，檢測波長為600-630nm; (D) 將所述熒光信號與步驟(A)中的標準曲線比對，獲得所述待測樣品的肌紅蛋白的濃 度。9. 權利要求8所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白的檢測方法，其特征在于： 所述步驟(A)中，濃度為0、1、10、50、100、200、400、800ng/mL的校準品中加入熒光標記抗體， 37°C溫育5-25min，然后用清洗液清洗去除未結合的抗原及熒光標記抗體，所述校準品與熒 光標記抗體的體積比為1:8-12。10. 權利要求8所述的基于微球的杯式時間分辨熒光肌紅蛋白的檢測方法，其特征在 于:所述步驟(B)中，待測樣品與熒光標記抗的體積比為1:8-12，溫育溫度為37°(：。
【文檔編號】G01N33/68GK105866402SQ201610210461
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】石曉強, 李福剛, 徐建新, 周奕璇, 楊晶
【申請人】上海奧普生物醫(yī)藥有限公司