本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種判定中國人群rs125055單核苷酸多態(tài)性與兒童IBD之間的相關(guān)性的方法。

背景技術(shù)：

IBD是一種胃腸道的慢性炎癥，影響了美國將近200萬的兒童和成人。過去IBD在中國被認(rèn)為是少見病，但事實證明，近年來越來越多的兒童IBD患者被明確診斷，且兒童IBD越來越被消化科醫(yī)師所重視。IBD包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)及克羅恩病(CD)。前者是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥，病變主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層，范圍多自遠(yuǎn)段結(jié)腸開始，可逆行向近段發(fā)展，甚至累及全結(jié)腸，呈連續(xù)性分布，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛和黏液膿血便。后者為一種慢性肉芽腫性炎癥，病變可累及胃腸道各部位，以末段回腸及其鄰近結(jié)腸為主，呈穿壁性炎癥，多為節(jié)段性、非對稱性分布，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、瘺管和肛周病變等。

ZMIZ1基因位于10q22.3，編碼的PIAS蛋白家族的成員(激活STAT的蛋白抑制劑)之一。所編碼的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)錄因子，包括雄激素受體、Smad3/4蛋白和p53的活性。所編碼的蛋白質(zhì)也可在蛋白修飾發(fā)揮作用。該位點上的10號染色體和第9號染色體的蛋白酪氨酸激酶ABL1基因之間的易位已與急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)。目前ZMIZ1基因也被發(fā)現(xiàn)與多種自身免疫性疾病有關(guān)。Rs1250550所在的ZMIZ1基因座與兒童IBD的相關(guān)性在中國大陸人中并未有報道。在此，我們擬通過新近發(fā)展起來的非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法，來研究中國人群rs1250550單核苷酸多態(tài)性與兒童IBD發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種方法，旨在用于判定中國人群rs125055單核苷酸多態(tài)性與兒童IBD之間的相關(guān)性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的判定中國人群rs125055單核苷酸多態(tài)性與兒童IBD之間的相關(guān)性的方法，所述方法是非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法。

進一步地，所述方法包括如下步驟：

(1)基因分型：取外周血基因組DNA，鑒定其基因型；

(2)統(tǒng)計學(xué)分析：單核苷酸多態(tài)性與疾病相關(guān)性分析通過兒童IBD患者與正常人群次等位基因頻率比較，以及用卡方檢驗或Fisher’s精確概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律結(jié)果來分析，P值小于0.05認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義；

(3)針對ZMIZ1內(nèi)含子區(qū)域的rs1250550設(shè)計非標(biāo)記探針，用于鑒別三種基因型的單核苷酸多態(tài)性，所述rs1250550的擴增序列如SEQID NO:1所示。

更進一步地，所述步驟(1)基因分型的具體流程為：

首先進行PCR，20mL體系含基因組DNA模板20ng，1′PCR緩存液(Takara，Japan)，200mM dNTPs，0.5U rTaq DNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反應(yīng)在Bio-Rad S1000PCR儀上進行(Bio-Rad，美國)；

PCR擴增條件如下：94℃預(yù)變性2分鐘，繼之進行50個循環(huán)，包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min；

反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移10mL PCR產(chǎn)物到HR-1專用的毛細(xì)管中，再加入1mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology，USA)，最后以HRM in CFX96實時熒光系統(tǒng)C1000Thermal Cycler(Bio-Rad，美國)進行檢測；

Rs1250550引物序列為：正向SEQ ID NO:2，反向SEQ ID NO:3。

本發(fā)明所述方法是通過非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法進行兒童IBD患者進行基因分型，進而判定中國人群rs1250550單核苷酸多態(tài)性與兒童IBD之間的相關(guān)性。目前已經(jīng)明確基因因素在兒童IBD的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，因此本發(fā)明的研究結(jié)果為更深入的了解兒童IBD疾病提供了理論依據(jù)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖示出的結(jié)構(gòu)獲得其他的附圖。

圖1為非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法分析樣本中rs1250550的基因型和測序驗證。

本發(fā)明目的的實現(xiàn)、功能特點及優(yōu)點將結(jié)合實施例，參照附圖做進一步說明。

具體實施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制，基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

下面參照附圖詳細(xì)描述本發(fā)明實施例的判定中國人群rs125055單核苷酸多態(tài)性與兒童IBD之間的相關(guān)性的方法。

實施例

1、研究對象

我們在北京大學(xué)深圳醫(yī)院以及一些深圳地區(qū)合作醫(yī)院收集根據(jù)2010年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會消化學(xué)會兒童炎癥性腸病協(xié)作組商定的兒童炎癥性腸病診斷規(guī)范確診的153例兒童IBD病人(男，81例，女，72例；平均年齡為10.2歲；年齡跨度在4–15歲之間)和254例正常人(男，131例，女，123例；年齡中位數(shù)為10.9歲；年齡跨度在5–15歲之間)。所有正常人均無IBD家族史或患其他IBD相關(guān)的疾病。本研究獲得北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會同意及所有參與者的知情同意。

2、基因分型

采用Innogent的全基因組DNA提取試劑盒(Innogent，China)，根據(jù)試劑盒說明書要求提取所收集的外周血基因組DNA。采用非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線的方法鑒定樣本的基因型。方法簡述如下：首先進行PCR，20mL體系含基因組DNA模板20ng，1′PCR緩存液(Takara，Japan)，200mM dNTPs，0.5U rTaq DNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反應(yīng)在Bio-Rad S1000PCR儀上進行(Bio-Rad，美國)。PCR擴增條件如下：94℃預(yù)變性2分鐘，繼之進行50個循環(huán)，包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移10mL PCR產(chǎn)物到HR-1專用的毛細(xì)管中，再加入1mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology，USA)后，最后以HRM in CFX96實時熒光系統(tǒng)C1000Thermal Cycler(Bio-Rad，美國)進行檢測。Rs1250550引物序列為：正向SEQ ID NO:2，反向SEQ ID NO:3。

3、統(tǒng)計學(xué)分析

SNP與疾病相關(guān)性分析通過兒童IBD患者于正常人群次等位基因頻率(MAF)比較，以及用卡方檢驗或Fisher’s精確概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律結(jié)果來分析。相關(guān)性程度以讓步比(OR)的95％置信區(qū)間(95％CI)表示。連鎖不平衡及單倍型分析均在SHEsis軟件上完成。P值小于0.05認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義。

4、結(jié)果

高分辨率溶解曲線是近年來發(fā)展起來的一種高效廉價的SNP檢測方法，通過此方法獲得的溶解曲線能明顯區(qū)分三種類型基因型(野生型，雜合突變及純合突變)。HRMA的敏感性與精確度均較高。在此，我們針對ZMIZ1基因內(nèi)含子區(qū)域的rs1250550(G>T)設(shè)計了擴增引物并將擴增產(chǎn)物用于高分辨率熔解曲線分析，三種基因型的單核苷酸多態(tài)性(野生型、雜合突變及純合突變)均可精確的鑒別(圖1)。如圖1所示，從熔融曲線獲得的基因型在PCR產(chǎn)物測序后得到進一步的證實。之后，這種方法應(yīng)用于對本研究的篩查。

rs1250550單核苷酸多態(tài)性與兒童IBD的相關(guān)性

表1所示為兒童IBD患者和正常健康人群rs1250550的基因型及等位基因頻率。兒童IBD患者和正常人群的基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡。兒童IBD患者rs1250550單核苷酸多態(tài)性的基因型和等位基因頻率與健康對照人群相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。rs1250550(P＝0.0247，OR＝1.139，[95％CI1.019-1.272])次等位基因?qū)和疘BD均有保護作用。

表1.Genotype and allele frequencies of indicated polymorphisms in controls and patients with兒童IBD^*

^*兒童IBD:early-onset inflammatory bowel disease；OR:odds ratio；CI:confidence interval.

5、討論

HRMA，中文譯為“高分辨率熔解”是近幾年來在國外興起的最新的SNP及突變研究工具。這種檢測方法不受突變堿基位點與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。這種方法因其操作簡便、快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。本文所設(shè)計的針對rs1250550的設(shè)計的特異性引物經(jīng)PCR擴增后產(chǎn)物用HRMA法分型清晰，無需使用非標(biāo)記探針法，可直接應(yīng)用于臨床。

SNP 1250550位于ZMIZ1基因，后者編碼的蛋白是PIAS(STAT抑制蛋白)蛋白家族的成員。目前被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)。如其與ABL基因的易位可引起B(yǎng)細(xì)胞白血??；其異常表達(dá)可在老鼠模型中引起鱗狀細(xì)胞癌。近年來也發(fā)現(xiàn)其與很多免疫反應(yīng)有關(guān)，如其能影響iNOS(一氧化氮)信號通路下游進而改變IL-1β的表達(dá)改變；在狼瘡性腎病中ZIMZ1也存在異常。rs1250550的不同基因型可能與NOS2的活性和表達(dá)有一定的相關(guān)性。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)rs1250550SNP與兒童IBD顯著相關(guān)，這與對其在其他一些人種中的研究結(jié)果一致。單倍型分析發(fā)現(xiàn)：rs1250550的GG與TT分別為兒童IBD的危險性和保護性的單倍型。值得一提的是，rs1250550SNP基因型及等位基因分布在亞洲人與歐洲人有所不同：歐洲人中rs1250550SNP具有較高的G等位基因頻率(65.2％)，與中國人群(57.7％)相差了7.5％左右，因此該位點相關(guān)的兒童IBD患病幾率有所提升。

因此，通過本發(fā)明知道ZMIZ1內(nèi)含子區(qū)域的基因突變可能可以引起基因表達(dá)或活性的異常，從而導(dǎo)致兒童IBD的發(fā)生與發(fā)展，使我們對兒童IBD預(yù)期診斷的篩查有較大的幫助，可以正確且迅速地判斷是否有兒童IBD發(fā)病的可能性，本發(fā)明的研究結(jié)果為更深入的了解兒童IBD疾病提供了理論依據(jù)。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是在本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下，利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接/間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域均包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。