專利名稱：通過分批或半連續(xù)培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1996年4月27日的中國專利申請(qǐng)96190419.4(PCT/KR96/00060)的分案申請(qǐng)。
另一方面，已采用全化學(xué)合成、半合成和提取方法制備紫杉醇。
然而，全化學(xué)合成法尚未實(shí)際應(yīng)用，因?yàn)槠湫枰浅０嘿F的化學(xué)試劑并且收率也不是很高，這一點(diǎn)可從紫杉醇的復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)料到。
采用前體如10-脫乙?；鶟{果赤霉素III的半合成方法已被證明存在一些缺點(diǎn)，因?yàn)槠湫枰獜?fù)雜而繁多的從紫杉屬植物中分離和純化紫杉醇前體并將前體轉(zhuǎn)化成紫杉醇的步驟。
考慮到這些方面，現(xiàn)有技術(shù)中主要采用經(jīng)濟(jì)的提取方法，通過該方法可直接從紫杉屬植物中分離紫杉醇。然而，所述方法已證明也存在令人不滿意之處，即其需要大量的紫杉樹來純化紫杉醇，由此最終導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境破壞。
因此，用全化學(xué)合成、半合成和提取方法提供用于世界范圍的化學(xué)治療學(xué)用途的紫杉醇得不到保證，仍非常有必要開發(fā)生產(chǎn)紫杉醇的其它方法。
作為一種很有潛力的解決所述問題的方法，細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法已在現(xiàn)有技術(shù)中有提議。
不同于現(xiàn)有技術(shù)，基于細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)紫杉醇的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)首先，可以以穩(wěn)定的方式生產(chǎn)紫杉醇，而不受枯萎病和害蟲等導(dǎo)致供給的紫杉屬植物不穩(wěn)定的影響；第二，細(xì)胞培養(yǎng)物可在大的生物反應(yīng)器中繁殖，由此通過控制培養(yǎng)條件可以大量生產(chǎn)紫杉醇；第三，與其它現(xiàn)有技術(shù)方法相比，細(xì)胞培養(yǎng)物能生產(chǎn)光譜較簡(jiǎn)單的化合物，大大地簡(jiǎn)化了分離和純化過程；第四，細(xì)胞培養(yǎng)法可以比其它方法更好地迅速適應(yīng)需求量的快速變化；第五，細(xì)胞培養(yǎng)法可以生產(chǎn)紫杉醇以及能轉(zhuǎn)化為紫杉醇的紫杉烷前體如漿果赤霉素。
現(xiàn)有技術(shù)中已描述了利用培養(yǎng)的植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的方法USP5,019,504公開了一種利用短葉紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇及其衍生物的方法，然而，其中所述的紫杉醇產(chǎn)量為1-3mg/L，不足以工業(yè)應(yīng)用。另外，通過該細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉醇不穩(wěn)定，甚至即使通過選擇可獲得高產(chǎn)率的初級(jí)細(xì)胞，通過次級(jí)培養(yǎng)也很難保持其含量(見E.R.M.Wickremesine等，細(xì)胞和組織培養(yǎng)世界會(huì)議(1992))。
USP5,015,744教導(dǎo)了一種從漿果赤霉素III(一種生物合成紫杉醇的前體)進(jìn)行半合成的方法，通過使用植物組織培養(yǎng)物，可以生產(chǎn)用于半合成方法的原料如漿果赤霉素III，因此，該植物組織培養(yǎng)物也可用于通過上述半合成方法生產(chǎn)紫杉醇。
WQ 93/17121提供了一種通過紫杉屬植物的細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)改變培養(yǎng)基的組成、生長速率和生產(chǎn)速率等而生產(chǎn)紫杉醇的方法，在應(yīng)用中國紫杉(Taxuschinensis)的情況下，在生物量每2.5天加倍的18天的培養(yǎng)物中可獲得24.1mg/L的紫杉醇。
所有這些專利描述的均是通過采用分批培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，在所述的專利中沒有教導(dǎo)也沒有預(yù)期生產(chǎn)紫杉醇的細(xì)胞系的半連續(xù)培養(yǎng)。
在這種情況下，USP5,407,816描述了將中國紫杉細(xì)胞接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基中形成懸液，然后培養(yǎng)該懸液以形成懸浮培養(yǎng)物，該懸浮培養(yǎng)物又在其它營養(yǎng)培養(yǎng)基中次級(jí)培養(yǎng)以形成生產(chǎn)培養(yǎng)物，該生產(chǎn)培養(yǎng)物最終以153mg/L的收率生產(chǎn)出紫杉醇和紫杉烷。所述的方法顯著提高了紫杉醇的產(chǎn)率，但是已證明該方法仍有不令人滿意之處，即其需要許多組成非常復(fù)雜的營養(yǎng)培養(yǎng)基，并且高產(chǎn)率僅在相當(dāng)受限的生長條件下才能達(dá)到。
因此，仍需要開發(fā)一種實(shí)用簡(jiǎn)便的生產(chǎn)紫杉醇的方法，該方法應(yīng)能滿足高產(chǎn)率的要求，而這一點(diǎn)是決定該方法能否適于工業(yè)應(yīng)用的主要因素。
本發(fā)明的一個(gè)主要目的在于提供一種通過半連續(xù)培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一個(gè)從中國紫杉分離出的新的生產(chǎn)紫杉醇的細(xì)胞系。
圖2示出檸檬酸銨對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響的圖表。
圖3示出麥芽糖對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響的圖表。
圖4示出在SYG-1半連續(xù)培養(yǎng)中的紫杉醇產(chǎn)率與培養(yǎng)循環(huán)的關(guān)系。
隨后，本發(fā)明人優(yōu)化了本發(fā)明的細(xì)胞系的生長條件，并確定SYG-1細(xì)胞在B5培養(yǎng)基上生長良好，更優(yōu)選是補(bǔ)加20μM NAA(萘氧基乙酸)、0.4μM BAP(6-芐基氨基嘌呤)、1g/L酪素水解物和30g/L蔗糖的B5培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度24℃，搖瓶速度為150rpm。另外，還檢測(cè)了AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響，本發(fā)明人總結(jié)出添加這些物質(zhì)能顯著提高紫杉醇的產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明，通過采用SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)可以高收率制備紫杉醇，該方法包括(i)將紫杉屬植物細(xì)胞接種到含1-10％(重量/體積)糖的培養(yǎng)基中并保溫培養(yǎng)；以及，(ii)將1/10-1/2體積的步驟(i)得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中并重復(fù)步驟(i)，向剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)糖并培養(yǎng)至紫杉醇最大產(chǎn)量時(shí)間。
在開始培養(yǎng)時(shí)可以將AgNO3以1-15μM、優(yōu)選5-10μM的濃度加入到紫杉屬植物細(xì)胞培養(yǎng)物中并培養(yǎng)10-20天，更優(yōu)選10-15天。另外，可以在培養(yǎng)后5-30天、更優(yōu)選5-10天將檸檬酸銨和麥芽糖分別以1-15mM、更優(yōu)選1-10mM和1-10％(重量/體積)、更優(yōu)選1-5％(重量/體積)的濃度加入到培養(yǎng)物中。
培養(yǎng)5-30天后，將1/10-1/2體積的總培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中開始循環(huán)培養(yǎng)，該新鮮培養(yǎng)基的成分與培養(yǎng)開始時(shí)采用的培養(yǎng)基成分相同。然后，向相當(dāng)于總培養(yǎng)物的9/10-1/2體積的剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)、更優(yōu)選1-5％(重量/體積)麥芽糖，培養(yǎng)30-60天，此時(shí)紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到最高，培養(yǎng)溫度為24℃、搖瓶速度為150rpm，并在暗處培養(yǎng)。
本發(fā)明方法中所用的紫杉屬植物包括短葉紫杉，加拿大紫杉(Taxuscanadensis)、東北紫杉(Taxus cuscidata)、歐洲紫杉(Taxus baccata)、Taxusglobosa、佛羅里達(dá)紫杉(Taxus floridana)、喜馬拉雅紫杉(Taxus wallichiana)、Taxus media和中國紫杉，然而，最優(yōu)選采用的是本發(fā)明人新開發(fā)的中國紫杉SYG-1。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)采用中國紫杉SYG-1半連續(xù)培養(yǎng)并添加提高紫杉醇產(chǎn)率的AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖時(shí)，在培養(yǎng)42-49天后觀察到紫杉醇的產(chǎn)率達(dá)到300mg/L的水平。紫杉醇的定量分析在下表1所述的具體條件下，用高效液相色譜定量分析根據(jù)本發(fā)明的方法從中國紫杉SYG-1培養(yǎng)物中生產(chǎn)的紫杉醇。
表1紫杉醇定量分析的條件
在下述實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，實(shí)施例不應(yīng)看作是對(duì)本通過將愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有技術(shù)中公知的幾種培養(yǎng)基中，例如MS(見Murashige，T.和F.Skoog，F(xiàn).，植物生理學(xué)，5473(1962))，SH(見Schenk和Hilderbrandt，加拿大植物學(xué)雜志，50199-204(1972))，WPM(見Lloyd和Mccown，Int.Plant Prop.Soc.Proc.，30421-427(1981))和B5培養(yǎng)基(見上述)，并肉眼觀察愈傷組織的生長模式而選擇愈傷組織的生長培養(yǎng)基。從上述結(jié)果可以確定愈傷組織在含20μM NAA、0.4μM BAP和2g/L酪素水解物的B5培養(yǎng)基上生長良好。
隨后，對(duì)如此誘導(dǎo)的細(xì)胞系進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生長條件的研究，并與現(xiàn)有技術(shù)中公知的細(xì)胞系進(jìn)行比較，結(jié)果示于表2和表3。如表2和表3所示，可以確定本發(fā)明開發(fā)的細(xì)胞系在紫杉醇產(chǎn)率和紫杉醇分泌模式等方面明顯區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞系。因此，該細(xì)胞系被命名為中國紫杉SYG-1，并在1996年3月14日保藏于國際保藏機(jī)構(gòu)(IDA)韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，入藏號(hào)為KCTC 0232BP。表2 中國紫杉SYG-1的形態(tài)學(xué)和生長條件
表3本發(fā)明的細(xì)胞系與現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)胞系的特征比較
實(shí)施例2 SYG-1的懸浮培養(yǎng)為選擇用于SYG-1懸浮培養(yǎng)的最優(yōu)選的培養(yǎng)基，將細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)移到MS、SH、WPM和B5培養(yǎng)基中，與實(shí)施例1類似觀察生長模式，其結(jié)果是，與愈傷組織類似，SYG-1細(xì)胞在含20μM NAA、0.4μM BAP和2g/L酪素水解物的B5培養(yǎng)基上生長良好。另外，還確定了SYG-1細(xì)胞在24℃的培養(yǎng)溫度和150rpm的搖瓶速度下生長良好。
在固化培養(yǎng)基的情況下每4周進(jìn)行愈傷組織的系列培養(yǎng)，同時(shí)借助于鑷子將部分轉(zhuǎn)移將一片愈傷組織保留在固體培養(yǎng)基平板上。隨后將保留在固體培養(yǎng)基上的愈傷組織接種到少量B5培養(yǎng)基中，并且隨著細(xì)胞生長至增加培養(yǎng)物的總體積，向其中補(bǔ)加少量培養(yǎng)基。而后以1/5(體積/體積)的比率將生長良好的細(xì)胞系在裝于500ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中的改良的B5培養(yǎng)基中稀釋，并每2周接種到懸浮培養(yǎng)基中。實(shí)施例3 AgNO3對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響業(yè)已熟知AgNO3是作用于植物細(xì)胞生長和二級(jí)代謝物產(chǎn)生的植物激素乙烯的拮抗劑，因此，本發(fā)明測(cè)試了AgNO3對(duì)SYG-1懸浮培養(yǎng)中紫杉醇的生產(chǎn)的影響。
向-250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入75ml含10μM AgNO3的B5培養(yǎng)基，將25ml 14天的細(xì)胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實(shí)施例2所述類似的方式培養(yǎng)，然后，將紫杉醇的產(chǎn)率與不含AgNO3的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比(見

圖1)。如圖1所示，可以很清楚地確定，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入AgNO3時(shí)紫杉醇的產(chǎn)率98.95mg/L(-●-)是對(duì)照(-○-)的4.7倍。實(shí)施例4 檸檬酸銨對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響在加入檸檬酸銨后監(jiān)測(cè)SYG-1懸浮培養(yǎng)物中的紫杉醇產(chǎn)率。向一250ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中加入75ml B5培養(yǎng)基，將25ml 14天的細(xì)胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實(shí)施例2所述相同的生長條件培養(yǎng)，然后，在培養(yǎng)9天后向培養(yǎng)物中加入5mM檸檬酸銨，將紫杉醇的產(chǎn)率與未加檸檬酸銨的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比(見圖2)。如圖2所示，可以確定，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入檸檬酸銨時(shí)紫杉醇的產(chǎn)率約為103.6mg/L(-●-)，其是對(duì)照(-○-)的4.9倍。實(shí)施例5 麥芽糖對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響已熟知在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提高糖的濃度能導(dǎo)致二級(jí)代謝物的增加，例如，據(jù)報(bào)道在野胡蘿卜(Daucus carota)的愈傷組織培養(yǎng)物中加入3％(重量/體積)蔗糖和5％(重量/體積)甘露醇提高了單花青苷(antocyanin)的產(chǎn)率(見Knobloch，K.-H.等，Zeiteshrift fur Natruforschung，35c55-556(1981))；在葡萄(Vitis vinifera)的懸浮培養(yǎng)物中加入88mM蔗糖和165mM甘露醇提高了單花青苷的產(chǎn)率(見Rajendran，L.等，Biotechnology Letters，14(8)707-712(1992))。另一方面，還報(bào)道了當(dāng)糖的加入量超過一定濃度時(shí)生長和二級(jí)代謝物的產(chǎn)量均下降，這可能是由于滲透應(yīng)力造成(見DO，C.B.和Cormier，F(xiàn).，Plant Cell Reports，9500-504(1990))。
評(píng)價(jià)麥芽糖加入到SYG-1中的效果。
向一250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入75ml B5培養(yǎng)基，將25ml 14天的細(xì)胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實(shí)施例2所述相同的生長條件培養(yǎng)，然后，分別在培養(yǎng)9天和21天后向培養(yǎng)物中加入2％(重量/體積)和3％(重量/體積)麥芽糖，將紫杉醇的產(chǎn)率與不含麥芽糖的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比(見圖3)。如圖3所示，可以確定，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入麥芽糖時(shí)紫杉醇的產(chǎn)率約為112.75mg/L(-●-)，其是對(duì)照(-○-)的5.3倍。實(shí)施例6 SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)基于實(shí)施例2-5得到的結(jié)果，采用SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)制備紫杉醇。
向一250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入80ml B5培養(yǎng)基和20ml 14天的細(xì)胞培養(yǎng)物，在培養(yǎng)開始時(shí)加入10μM AgNO3，然后，在培養(yǎng)9天后向培養(yǎng)物中加入5mM檸檬酸銨和2％(重量/體積)麥芽糖，培養(yǎng)21天后，將相當(dāng)于總培養(yǎng)物1/5體積的20ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到另一含80ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中開始另一培養(yǎng)循環(huán)。隨后，向相當(dāng)于總培養(yǎng)物4/5體積的80ml剩余培養(yǎng)物中加入3％(重量/體積)麥芽糖，并再培養(yǎng)21天，此時(shí)紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到最大。此時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)定為24℃，搖瓶速度為150rpm。定期從培養(yǎng)物中取樣以檢測(cè)微生物污染，并且如上所述采用高效液相色譜(HPLC，Waters，U.S.A.)測(cè)定培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量。結(jié)果是，為觀察到微生物污染并且培養(yǎng)42天后紫杉醇的產(chǎn)率為284mg/L(見圖4)，如圖4所示，紫杉醇的濃度隨著培養(yǎng)循環(huán)的重復(fù)而增加。
如上所述，本發(fā)明提供了以高產(chǎn)率通過半連續(xù)培養(yǎng)紫杉屬植物而大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在半連續(xù)培養(yǎng)中采用中國紫杉SYG-1并添加提高紫杉醇產(chǎn)率的AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖時(shí)，在培養(yǎng)40-50天后觀察到紫杉醇的產(chǎn)率達(dá)到300mg/L的水平。
權(quán)利要求
1.一種大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，包括下述步驟(i)將紫杉屬植物細(xì)胞接種到含1-15μM AgNO3的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)；以及，(ii)從產(chǎn)生紫杉醇的培養(yǎng)物中回收紫杉醇。
2.權(quán)利要求1的大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，其中紫杉屬植物選自由短葉紫杉、加拿大紫杉、東北紫杉、歐洲紫杉、Taxus globosa、佛羅里達(dá)紫杉、喜馬拉雅紫杉、Taxus media和中國紫杉組成的一組。
3.權(quán)利要求1的大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，其中紫杉屬植物是中國紫杉SYG-1(KCTC 0232BP)。
4.權(quán)利要求1的大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，其中培養(yǎng)以分批或半連續(xù)方式進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及以高產(chǎn)率通過分批或者半連續(xù)培養(yǎng)紫杉屬植物而大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，根據(jù)本發(fā)明，通過采用紫杉屬植物細(xì)胞的分批或半連續(xù)培養(yǎng)可以高產(chǎn)率制備紫杉醇，所述的方法包括(i)將紫杉屬植物細(xì)胞接種到含1－15μMAgNO
文檔編號(hào)C12P15/00GK1394961SQ0114487
公開日2003年2月5日 申請(qǐng)日期1996年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月27日
發(fā)明者崔亨均, 湯姆·李·亞當(dāng)斯, 羅伊·威廉·斯塔爾赫特, 金尚翼, 尹晶煥, 宋鳳圭, 金鎮(zhèn)鉉, 宋準(zhǔn)錫, 洪承緒, 李賢秀 申請(qǐng)人:(株)三養(yǎng)吉尼克斯