專利名稱：一種紫杉醇純品的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
紫杉醇，英文名為Paclitaxel，系統(tǒng)命名為5β，20-環(huán)氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2’R，3’S)-N-苯甲酰-3’苯基異絲氨酸酯]。其分子式為C47H51NO14，分子量為853.9，是制造紫杉醇類抗癌藥物的重要原料。本發(fā)明以天然或人工紅豆杉枝葉及樹皮為原料，經(jīng)過浸提、粗分離、精制等工藝過程獲得純度大于99％的精品，屬于生物化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紫杉醇能夠與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白聚合裝配成微管二聚體，從而抑制細(xì)胞中微管的生理解聚，使細(xì)胞有絲分裂停止在G2期及M期，阻止了癌細(xì)胞的快速繁殖，這一機(jī)理與其它紡錘體毒性的抗癌藥物的作用機(jī)制恰好相反，至今仍是獨(dú)一無二的。臨床研究表明，紫杉醇治療晚期卵巢癌總響應(yīng)率為56％，治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，總響應(yīng)率為30％，治療非小細(xì)胞肺癌總響應(yīng)率為24％，而且對(duì)前列腺癌、上胃腸道癌、頭頸癌、白血病等亦有較好療效。早在1856年Lucas就從漿果紅豆杉(Taxus baccataL.)中分離得到了堿性物質(zhì)Taxine，但直到本世紀(jì)60年代，在現(xiàn)代光譜技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，有關(guān)這方面的研究才得以全面展開。1967年，美國(guó)化學(xué)家M.E.Wall和M.C.Wani首先從短葉紅豆杉中分離得到紫杉醇，1971年由M.C.Wani及其同事鑒定了結(jié)構(gòu)并說明其有抗癌活性。1979年，美國(guó)愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的Susan B.Horwitz等發(fā)現(xiàn)紫杉醇獨(dú)特的抗癌機(jī)理。1980年進(jìn)行給藥規(guī)程研究，1982年美國(guó)開始I期臨床試驗(yàn)，1986年開始II期臨床試驗(yàn)。1992年12月29日，美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)首先批準(zhǔn)紫杉醇作為治療晚期卵巢癌的新抗癌藥上市，一年后又批準(zhǔn)用于治療乳腺癌。90年代以來，紫杉醇的研究空前發(fā)展，主要集中在原料浸出率的提高、分離方法的改進(jìn)、細(xì)胞組織培養(yǎng)法的工業(yè)化、半合成及全合成法的工業(yè)化、低毒及水溶新劑型的研究等等。
現(xiàn)有的紫杉醇浸提方法一般均是將原料干燥、粉碎后，先用甲醇、乙醇浸出，加水稀釋，用己烷或石油醚萃取脫脂，二氯甲烷或氯仿萃取，濃縮后得到浸膏。其缺點(diǎn)是萃取有機(jī)溶劑用量大，乳化嚴(yán)重，浸出收率難以超過85％，浸膏純度低。
國(guó)內(nèi)外目前分離紫杉醇的方法一般是用將浸膏經(jīng)多級(jí)硅膠柱層析、硅膠鍵合C-18柱層析或吸附樹脂柱層析，再經(jīng)結(jié)晶、重結(jié)晶后得到產(chǎn)品。上述方法分離紫杉醇與鄰近衍生物Cephalomannine是比較困難的，且產(chǎn)量很小，因而有時(shí)需要經(jīng)過溴化或氧化后再用硅膠柱層析將二者分開。上述方法所得產(chǎn)品純度＞98％，但存在如下缺陷(1)收率低。硅膠對(duì)紫杉醇存在不可逆吸附，造成產(chǎn)品損失，生產(chǎn)純度大于98％的紫杉醇，總收率小于60％。(2)操作繁瑣、產(chǎn)量小。(3)溶劑消耗量大，成本高。(4)吸附樹脂抗壓能力弱，柱效低。(5)難以利用可再生的紅豆杉枝葉為原料進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、工業(yè)化、低成本地提純獲得高純度紫杉醇的方法。本發(fā)明采用紫杉醇含量大于萬分之一的紅豆杉枝葉或樹皮為原料，經(jīng)過浸提、脫脂、脫膠后得到含量大于百分之一點(diǎn)五的浸膏。將浸膏用溶劑溶解，加入吸附劑混合濃縮吸附，采用工業(yè)固-液相柱色譜分離技術(shù)，用極性、弱極性溶劑或混合溶劑洗脫，分段除去與紫杉醇極性不同的雜質(zhì)，將富含紫杉醇段經(jīng)過濃縮、結(jié)晶、真空干燥后得到高純度的紫杉醇精品，純度大于99％。按紫杉醇量計(jì)算，產(chǎn)品直接收率大于70％，總收率大于85％。其工藝步驟詳述如下A.提取 將紅豆杉枝葉或樹皮陰干，粉碎過5mm直徑篩，分三次加入浸提液進(jìn)行三級(jí)間歇浸提，粉碎原料∶浸提液＝1∶7(W/V)，浸提液為甲醇\乙醇，優(yōu)選甲醇。其中第三級(jí)浸提液用作下批投料時(shí)的一級(jí)浸提液。第一、二級(jí)浸提液合并濃縮，得到濃縮液，有機(jī)溶劑回收利用。
B.脫酯 將步驟A產(chǎn)生的濃縮液分兩次加入脫脂液進(jìn)行二級(jí)間歇脫脂，濃縮液∶脫脂液＝1∶1(V/V)，脫脂液為石油醚\正己烷\環(huán)己烷\6號(hào)溶劑油等，優(yōu)選石油醚。攪拌20分鐘，靜置60分鐘，棄去下層膠狀或絮狀沉淀物，收集下層液，上層液合并回收溶劑。
C.脫膠 將步驟B的下層液加入二氯甲烷，下層液∶二氯甲烷＝1∶1(V/V)，攪拌15分鐘，靜置30分鐘，棄去下層膠狀或絮狀沉淀物，得混合液。
D.反萃取 將步驟C的混合液加入含1％NaCl的水，攪拌20分鐘，靜置60分鐘，棄去上層液，混合液∶鹽水＝1∶1(V/V)；下層液中分兩次再加入甲醇及鹽水，每次攪拌20分鐘，靜置60分鐘，棄去上層液，下層液∶甲醇∶鹽水＝1∶1∶1(V/V/V)，得下層有機(jī)相。
E.濃縮 將步驟C的下層有機(jī)相于60℃減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得到含紫杉醇1.5％以上的浸膏。
F.制料 將步驟E所得浸膏加丙酮溶解，加入吸附劑，紫杉醇凈含量∶吸附劑＝1∶200(W/W)，在60℃減壓濃縮至干。吸附劑為活性炭\硅藻土\活性白土\硅膠\氧化鋁\離子交換樹脂\吸附樹脂等，優(yōu)選硅膠。
G.一次固-液色譜分離 將步驟F制好的物料裝入預(yù)柱，自由沉降壓實(shí)。將預(yù)柱與分離柱串聯(lián)，用極性溶劑及弱極性溶劑的混合液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫收集液通過TLC及HPLC檢測(cè)進(jìn)行分段處理。洗脫梯度為極性溶劑∶弱極性溶劑＝10∶90～100∶0的階梯梯度。上述極性溶劑為甲醇\乙醇\異丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮\乙酸乙酯，優(yōu)選乙酸乙酯。上述弱極性溶劑為氯仿\四氯化碳\二氯甲烷\1，2-二氯乙烷\石油醚\正己烷\環(huán)己烷\6號(hào)溶劑油等，優(yōu)選正己烷。上述預(yù)柱為300mm直徑×1000mm長(zhǎng)度的不銹鋼或玻璃柱；上述分離柱為200mm直徑×2000mm長(zhǎng)度的不銹鋼或玻璃柱，柱內(nèi)為硅膠或氧化鋁，優(yōu)選硅膠。
H.再制料 將步驟G所得富含紫杉醇段的收集液，加入吸附劑，紫杉醇凈含量∶吸附劑＝1∶200(W/V)，在60℃減壓濃縮。吸附劑為活性炭\活性白土\硅膠\氧化鋁\離子交換樹脂\吸附樹脂等，優(yōu)選吸附樹脂。
I.二次固-液色譜分離 將步驟H制好的物料裝入預(yù)柱，自由沉降壓實(shí)。將預(yù)柱與分離柱串聯(lián)，用極性溶劑及水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫收集液通過TLC及HPLC檢測(cè)進(jìn)行分段處理。洗脫梯度為極性溶劑∶水＝40∶60～100∶0的階梯梯度。上述極性溶劑為甲醇\乙醇\異丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮，優(yōu)選丙酮。上述預(yù)柱為300mm直徑×1000mm長(zhǎng)度的不銹鋼或玻璃柱；上述分離柱為200mm直徑×2000mm長(zhǎng)度的不銹鋼或玻璃柱，柱內(nèi)為鍵合十八烷基填料或以硅膠\氧化鋯為基質(zhì)包覆聚苯乙烯\聚苯乙烯-二乙烯基苯\聚丁二烯\聚丙烯酸酯\聚丙烯腈\聚環(huán)氧乙烷\聚醚\聚丙烯酰胺等的填料，優(yōu)選硅膠\氧化鋯為基質(zhì)包覆聚丙烯酸酯。
J.結(jié)晶 將步驟I所得富含紫杉醇段的收集液于60℃減壓濃縮，靜置12小時(shí)，過濾，得一次結(jié)晶。
K.重結(jié)晶 將步驟J所得一次結(jié)晶加丙酮溶解，溶解液濃度為8g/L，攪拌加入二氯甲烷，攪拌陳化4小時(shí)，過濾，濾液中攪拌加入正己烷，攪拌陳化8小時(shí)，過濾，得重結(jié)晶濾餅。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷＝1∶1∶7(V/V/V)。
L.干燥 將步驟K所得重結(jié)晶濾餅在60℃溫度減壓干燥得到高純度的紫杉醇精品，純度大于99％，直接收率大于70％。
M.將步驟I所得低含紫杉醇段的收集液及步驟J、K所得回收母液減壓濃縮，重復(fù)步驟F～L，繼續(xù)得到高純度的紫杉醇精品，純度大于99％，總收率大于85％。


附圖1為本發(fā)明提取過程工藝流程圖；附圖2為本發(fā)明精制過程工藝流程圖；附圖3為本發(fā)明的預(yù)柱與分離柱的連接示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.前處理 取云南紅豆杉樹皮400kg，含紫杉醇為0.016％用甲醇2800L，三級(jí)浸提，提取液濃縮至480L，用480L的正己烷進(jìn)行二級(jí)脫脂；用480L二氯甲烷，按甲醇∶二氯甲烷∶1％鹽水＝1∶1∶1(V/V/V)的比例，連續(xù)三次反萃取，將下層有機(jī)相濃縮得膏狀物2.6kg，經(jīng)HPLC檢測(cè)紫杉醇含量為2.2％。
2.制料 將步驟1所得紫杉醇浸膏2.6Kg，加丙酮溶解，加入硅膠11Kg，在60℃減壓濃縮至干。
3.洗脫 將步驟2制好的物料裝入預(yù)柱，自由沉降壓實(shí)。將預(yù)柱與分離柱串聯(lián)，洗脫梯度為乙酸乙酯∶正己烷＝10∶90～100∶0的階梯梯度。上述預(yù)柱為300mm直徑×1000mm長(zhǎng)度的不銹鋼柱；上述分離柱為200mm直徑×2000mm長(zhǎng)度的不銹鋼柱，柱內(nèi)為硅膠。
4.再制料 將步驟3所得富含紫杉醇段的收集液，加入硅藻土11Kg，在60℃減壓濃縮至干。
5.二次固-液色譜分離 將步驟4制好的物料裝入預(yù)柱，自由沉降壓實(shí)。將預(yù)柱與分離柱串聯(lián)，洗脫梯度為丙酮∶水＝40∶60～100∶0的階梯梯度。上述預(yù)柱為300mm直徑×1000mm長(zhǎng)度的不銹鋼柱；上述分離柱為200mm直徑×2000mm長(zhǎng)度的不銹鋼柱，柱內(nèi)為硅膠基質(zhì)包覆\聚丙烯酸酯填料。
6.結(jié)晶 將步驟5所得富含紫杉醇段的收集液于60℃減壓濃縮，靜置12小時(shí)，過濾，得一次結(jié)晶。將一次結(jié)晶加丙酮溶解，溶解液濃度為8g/L，攪拌加入二氯甲烷，攪拌陳化4小時(shí)，過濾，濾液中攪拌加入正己烷，攪拌陳化8小時(shí)，過濾，得重結(jié)晶濾餅。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷＝1∶1∶7(V/V/V)。
7.干燥 將步驟6所得重結(jié)晶濾餅在60℃溫度減壓干燥得到高純度的紫杉醇精品49.9g，純度99.6％，直接收率77.9％。
實(shí)施例2 以人工種植Media紅豆杉枝葉400kg，含紫杉醇為0.025％，其工藝過程完全與實(shí)施例1相同，所得紫杉醇精品99.70％，直接收率75％。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明采用紫杉醇含量大于萬分之一的紅豆杉枝葉或樹皮為原料，經(jīng)過浸提、脫脂、脫膠后得到含量大于百分之一點(diǎn)五的浸膏。將浸膏用溶劑溶解，加入吸附劑混合濃縮吸附，采用工業(yè)固-液相柱色譜分離技術(shù)，用極性、弱極性溶劑或混合溶劑洗脫，分段除去與紫杉醇極性不同的雜質(zhì)，將富含紫杉醇段經(jīng)過濃縮、結(jié)晶、真空干燥后得到高純度的紫杉醇精品。其工藝步驟詳述如下A.提取 將紅豆杉枝葉或樹皮陰干，粉碎過5mm直徑篩，分三次加入浸提液進(jìn)行三級(jí)間歇浸提，粉碎原料∶浸提液＝1∶7(W/V)。其中第三級(jí)浸提液用作下批投料時(shí)的一級(jí)浸提液。第一、二級(jí)浸提液合并濃縮，得到濃縮液，有機(jī)溶劑回收利用。B.脫酯 將步驟A產(chǎn)生的濃縮液分兩次加入脫脂液進(jìn)行二級(jí)間歇脫脂，濃縮液∶脫脂液＝1∶1(V/V)。攪拌20分鐘，靜置60分鐘，棄去下層膠狀或絮狀沉淀物，收集下層液，上層液合并回收溶劑。C.脫膠 將步驟B的下層液加入二氯甲烷，下層液∶二氯甲烷＝1∶1(V/V)，攪拌15分鐘，靜置30分鐘，棄去下層膠狀或絮狀沉淀物，得混合液。D.反萃取 將步驟C的混合液加入含1％NaCl的水，攪拌20分鐘，靜置60分鐘，棄去上層液，混合液∶鹽水＝1∶1(V/V)；下層液中分兩次再加入甲醇及鹽水，下層液∶甲醇∶鹽水＝1∶1∶1(V/V/V)，每次攪拌20分鐘，靜置60分鐘，棄去上層液，得下層有機(jī)相。E.濃縮 將步驟C的下層有機(jī)相于60℃減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得到含紫杉醇1.5％以上的浸膏。F.制料 將步驟E所得浸膏加丙酮溶解，加入吸附劑，紫杉醇凈含量∶吸附劑＝1∶200(W/W)，在60℃減壓濃縮至干。G.一次固-液色譜分離 將步驟F制好的物料裝入預(yù)柱，自由沉降壓實(shí)。將預(yù)柱與分離柱串聯(lián)，用極性溶劑及弱極性溶劑的混合液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫收集液通過TLC及HPLC檢測(cè)進(jìn)行分段處理。H.再制料 將步驟G所得富含紫杉醇段的收集液，加入吸附劑，紫杉醇凈含量∶吸附劑＝1∶200(W/V)，在60℃減壓濃縮。I.二次固-液色譜分離 將步驟H制好的物料裝入預(yù)柱，自由沉降壓實(shí)。將預(yù)柱與分離柱串聯(lián)，用極性溶劑及水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫收集液通過TLC及HPLC檢測(cè)進(jìn)行分段處理。洗脫梯度為極性溶劑∶水＝40∶60～100∶0的階梯梯度。上述預(yù)柱為300mm直徑×1000mm長(zhǎng)度的不銹鋼或玻璃柱；上述分離柱為200mm直徑×2000mm長(zhǎng)度的不銹鋼或玻璃柱。J.結(jié)晶 將步驟I所得富含紫杉醇段的收集液于60℃減壓濃縮，靜置12小時(shí)，過濾，得一次結(jié)晶。K.重結(jié)晶 將步驟J所得一次結(jié)晶加丙酮溶解，溶解液濃度為8g/L，攪拌加入二氯甲烷，攪拌陳化4小時(shí)，過濾，濾液中攪拌加入正己烷，攪拌陳化8小時(shí)，過濾，得重結(jié)晶濾餅。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷＝1∶1∶7(V/V/V)。L.干燥 將步驟K所得重結(jié)晶濾餅在60℃溫度減壓干燥得到高純度的紫杉醇精品，純度大于99％，直接收率大于70％。M.將步驟I所得低含紫杉醇段的收集液及步驟J、K所得回收母液減壓濃縮，重復(fù)步驟F～L，繼續(xù)得到高純度的紫杉醇精品，純度大于99％，總收率大于85％。
2.權(quán)利要求1所指紅豆杉是指各種天然紅豆杉及人工種植的紅豆杉。
3.權(quán)利要求1之步驟A所述浸提液為甲醇\乙醇，優(yōu)選甲醇。
4.權(quán)利要求1之步驟B采用甲醇與脫脂液兩相分配脫脂，不加水。所述脫脂液為石油醚\正己烷\環(huán)己烷\6號(hào)溶劑油等，優(yōu)選石油醚。
5.權(quán)利要求1之步驟C采用甲醇與二氯甲烷混合脫膠，不加水。
6.權(quán)利要求1之步驟D采用1％濃度的鹽水反萃取。
7.權(quán)利要求1之步驟F所述吸附劑為活性炭\硅藻土\活性白土\硅膠\氧化鋁\離子交換樹脂\吸附樹脂等，優(yōu)選硅膠。
8.權(quán)利要求1之步驟H所述吸附劑為活性炭\硅藻土\活性白土\硅膠\氧化鋁\離子交換樹脂\吸附樹脂等，優(yōu)選吸附樹脂。
9.權(quán)利要求1之步驟I所述極性溶劑為甲醇\乙醇\異丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮，優(yōu)選丙酮。
10.權(quán)利要求1之步驟I所述分離柱內(nèi)填料為鍵合十八烷基填料或以硅膠\氧化鋯為基質(zhì)包覆聚苯乙烯\聚苯乙烯-二乙烯基苯\聚丁二烯\聚丙烯酸酯\聚丙烯腈\聚環(huán)氧乙烷\聚醚\聚丙烯酰胺等的填料，優(yōu)選硅膠\氧化鋯為基質(zhì)包覆聚丙烯酸酯。
11.權(quán)利要求1之步驟J所述重結(jié)晶步驟為將一次結(jié)晶加丙酮溶解，攪拌加入二氯甲烷，攪拌陳化4小時(shí)，過濾，濾液中攪拌加入正己烷，攪拌陳化8小時(shí)，過濾，得重結(jié)晶濾餅。
12.權(quán)利要求1之步驟J所述重結(jié)晶溶劑比例為丙酮∶二氯甲烷∶正己烷＝1∶1∶7(V/V/V)。
全文摘要
本發(fā)明采用紫杉醇含量大于萬分之一的紅豆杉枝葉或樹皮為原料，經(jīng)過浸提、脫脂、脫膠后得到含量大于百分之一點(diǎn)五的浸膏。將浸膏用溶劑溶解，加入吸附劑混合濃縮吸附，采用工業(yè)固－液相柱色譜分離技術(shù)，用極性、弱極性溶劑或混合溶劑洗脫，分段除去與紫杉醇極性不同的雜質(zhì)，將富含紫杉醇段經(jīng)過濃縮、結(jié)晶、真空干燥后得到純度大于99％的紫杉醇精品。按紫杉醇量計(jì)算，產(chǎn)品直接收率大于70％，總收率大于85％。
文檔編號(hào)C07D305/14GK1687044SQ20051006305
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者楊雪峰, 謝曼 申請(qǐng)人:楊雪峰, 謝曼