專利名稱：含有異體寡和/或多核糖核苷酸的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有異體寡和/或多核糖核苷酸作為活性成分的藥物，此外涉及所述異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于治療皰疹病毒感染和皮膚惡性腫瘤。
背景技術(shù)：
皰疹病毒科病毒是世界常見的病原體，大多數(shù)脊椎動(dòng)物對(duì)其敏感。最重要的人皰疹病毒是單純性皰疹病毒1與2(HSV-1，HSV-2)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)和人巨細(xì)胞病毒(HCMV)。HSV導(dǎo)致免疫競(jìng)爭性個(gè)體皮膚或黏膜病變，并且能夠以不同頻率復(fù)發(fā)。各種皰疹病毒是按照病變部位加以區(qū)分的，例如唇皰疹或生殖器皰疹等。
目前關(guān)于這類病毒的治療方法主要致力于病毒復(fù)制的抑制作用，例如阿昔洛韋是已知的病毒DNA聚合酶抑制劑。不過，病毒能夠隨著時(shí)間的推移變成阿昔洛韋耐藥性，特別是對(duì)單純性皰疹來說情況更是如此。另外，盡管常規(guī)藥物在急性病變的情況下能夠提供減輕效果，不過它們不能有效地預(yù)防復(fù)發(fā)。
在二十世紀(jì)六十年代后期和七十年代早期，在移植研究中發(fā)現(xiàn)，用異體異種核酸預(yù)處理的組織或弱抗原在各種免疫檢查方法中大大增加了抗體效價(jià)。在體外和體內(nèi)研究中利用大量不同抗原都進(jìn)一步確認(rèn)了這些結(jié)果。不過，沒有跡象表明核酸、特別是異體來源的寡和/或多核糖核苷酸能夠適合于控制病毒感染。
與此同時(shí)，尤其是在美國，利用確定的合成的多與寡核苷酸、特別是核糖核苷酸進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，不過，由于體內(nèi)毒性高，這些實(shí)驗(yàn)沒有繼續(xù)下去。
因此，本發(fā)明的目的是提供適合于治療皰疹病毒感染以及惡性皮膚疾患的藥物。此外，本發(fā)明的目的是提供降低皮膚病變、特別是由病毒導(dǎo)致的病變復(fù)發(fā)率的藥物。
按照本發(fā)明，發(fā)明目的通過包含異體寡和/或多核糖核苷酸作為活性物質(zhì)的藥物得以實(shí)現(xiàn)。
按照本發(fā)明，異體表示核糖核苷酸來源于不同于受治療者的生物，也就是這些寡和/或多核糖核苷酸不是來自所要給藥的同一生物。按照本發(fā)明所使用的異體寡和/或多核糖核苷酸優(yōu)選地來自動(dòng)物組織(例如牛組織、胎牛組織)、植物和單細(xì)胞生物，優(yōu)選地來自酵母細(xì)胞(特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。優(yōu)選地使用在進(jìn)化上盡可能遠(yuǎn)離受治療生物的生物的寡和/或多核糖核苷酸。因而，在人用藥物中，優(yōu)選地使用來自動(dòng)物組織的RNA，或者特別優(yōu)選地使用來自植物或單細(xì)胞生物的RNA，例如酵母。
本發(fā)明是基于利用RNA制劑所進(jìn)行的皰疹感染研究的。在這一點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)，將分離的異體RNA施用于唇單純性皰疹、播散性單純皰疹(Herpes Simplex cruris disseminata)和生殖器單純性皰疹患者的皮膚病變部位上，除了對(duì)病變本身的立即作用以外，另外還驚人地顯著降低多年頻繁復(fù)發(fā)患者的復(fù)發(fā)率。然后發(fā)現(xiàn)所述RNA對(duì)皮膚腫瘤也具有相似活性，例如基底細(xì)胞癌。
按照本發(fā)明所使用的寡和/或多核糖核苷酸是無毒的，本身是非抗原性的。
有效使用總RNA及其鹽和化合物的制劑是可能的。特別優(yōu)選為tRNA。獲得按照本發(fā)明可以使用的RNA的特別優(yōu)選的方式是苯酚萃取，具體是本文方法I和II所述方法。
每劑異體寡和/或多核糖核苷酸的有效量在每名患者中取決于各種因素，例如病變部位或受影響面積的大小和程度，以及給藥類型。每單位劑量的劑量范圍在0.1mg以上。每單位劑量的劑量下限優(yōu)選為至少0.5mg，更優(yōu)選為至少2mg，進(jìn)而更優(yōu)選為至少5mg；上限優(yōu)選為5mg，更優(yōu)選為20mg，進(jìn)而更優(yōu)選為10mg。
本發(fā)明的藥物優(yōu)選地含有本質(zhì)上為無水形式的異體寡和/或多核糖核苷酸，例如薄片、粉末、顆粒、軟膏等。不過，寡和/或多核糖核苷酸也可以溶解在水或另一種溶劑中。
另外，本發(fā)明的藥物可以包含生理學(xué)上可接受的載體、助劑、稀釋劑和/或添加劑和/或輔劑。
含有本發(fā)明異體寡和/或多核糖核苷酸的藥物組合物可以配制成用于口服的片劑、錠劑與咀嚼片、液體懸液、粉劑、顆粒劑、乳劑、硬或軟膠囊劑、糖漿劑或酏劑，或者用于緩慢釋放的緩釋劑型或滲透膠囊劑。
另一種具有特別有利作用的藥物劑型是由PEG混合物制成的無水軟膏劑。
給藥優(yōu)選地是通過局部方式進(jìn)行的，但是也可以通過口服、腸胃外、直腸或吸入。術(shù)語腸胃外在這里涉及皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
關(guān)于局部用藥，優(yōu)選地將總RNA或tRNA粉劑或PEG軟膏劑(即無水形式)施用于受影響的部位；在粉劑的情況下，酌情可以將皮膚略微濕潤，優(yōu)選地在空氣中自然干燥。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是用于治療由皰疹病毒所導(dǎo)致的疾患的藥物，它還減少這些疾患復(fù)發(fā)的頻率。本發(fā)明的藥物特別優(yōu)選地用于治療由單純性皰疹病毒和帶狀皰疹(VZV)所導(dǎo)致的病變，例如由唇單純性皰疹(唇的皰疹)和生殖器單純性皰疹所導(dǎo)致的病變和復(fù)發(fā)。
本發(fā)明的異體寡和/或多核糖核苷酸和藥物同樣適合于治療皮膚惡性腫瘤，例如基底細(xì)胞癌。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于制備治療皰疹病毒疾患和皮膚腫瘤的藥物。
在病變或復(fù)發(fā)的情況下，均優(yōu)選盡可能早地進(jìn)行治療，一次的用藥就已經(jīng)減少復(fù)發(fā)的頻率。
除了用本發(fā)明的異體寡和/或多核糖核苷酸治療人以外，以這種方式治療溫血?jiǎng)游镆彩强赡艿模珩R、牛、羊等。
下列實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1按照本發(fā)明可用的寡和/或多核糖核苷酸的制備有關(guān)文獻(xiàn)描述了大量獲得核酸、核苷酸和核苷的方法，它們是任何具有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的人員已知的。這里優(yōu)選地采用兩種略作改動(dòng)的方法，二者都是基于酚處理的，方法I用于獲得總RNA(Georgiev，G.P.和Mantieva，V.L.《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》61，153(1962))，方法II用于獲得tRNA(Bauer，S.等《生物技術(shù)與生物工程》15，1081(1973))。兩種方法都適合于相對(duì)大量地萃取。
方法I在Waring混合機(jī)內(nèi)，將啤酒酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))在緩沖液(A)(0.001M EDTA，0.01M Tris-HCl緩沖液，pH5-6.25％蔗糖，0.5％ SDS(十二烷基硫酸鈉)，0.3％脫氧氯酸鈉)中的15％懸液在10℃和3000rpm下均化3分鐘。將組織勻漿與相同體積的溶液(B)(80％重結(jié)晶苯酚的緩沖液(A)溶液，0.1％8-羥基喹啉，1.2％二碳酸二乙酯)混合，然后在60℃下緩慢攪拌30分鐘。所有緩沖溶液都是用預(yù)先與膨潤土攪拌的去離子水制備的。
然后將酚處理后的組織勻漿在室溫(約20℃)和10000g下離心15分鐘。移取水相，棄去苯酚和中間相。將水相與相同體積的溶液(B)氯仿/異戊醇(96∶4)的1∶1混合物混合，如上所述進(jìn)行萃取。將水相用一半體積的二乙醚萃取三次，目的是除去殘留的苯酚。調(diào)整溶液至含2％乙酸鈉，用2.5體積的無水乙醇沉淀出RNA。
在0℃和5000rpm下離心移取沉淀出來的RNA，溶于冰冷的0.01MTris-HCl緩沖液，pH7.0和0.001M MgCl2。向溶液中加入電泳純的胰腺DNA酶(4g/ml)，在22℃下恒溫3小時(shí)，降解可能存在的DNA。將蛋白質(zhì)殘余物、DNA酶和RNA酶用鏈霉蛋白酶(10μg/ml)在37℃下消化3小時(shí)。在此期間，鏈霉蛋白酶也通過自我消化所破壞。如上所述在60℃下用溶液(B)萃取RNA溶液，溫和攪拌20分鐘，離心分離各相，移取水相，用二乙醚萃取。加入乙酸鈉(最終濃度2％)后，用2.5體積乙醇沉淀出RNA，離心移取。將沉淀溶于冷的2％乙酸鈉，用2.5體積乙醇沉淀，在-20℃醇混合物中保持過夜。然后離心移取沉淀，用75％乙醇洗滌兩次，用無水乙醇洗滌兩次，用二乙醚洗滌兩次。在烘箱內(nèi)干燥后，得到散裝的干燥RNA，在室溫下貯存在深色玻璃容器內(nèi)。
方法II本方法也適合于萃取大量酵母(數(shù)千克)。
在冷室內(nèi)，在四倍量緩沖液(A)(見上方法I)中均化給定重量的酵母。向組織勻漿中加入40％ v/v苯酚溶液(B)和5％ w/v由去離子水制成的冰立方體，將混合物攪拌30分鐘。吸濾移取上清液，然后酚處理兩次，如方法I下所述。將水性上清液收集在一個(gè)容器內(nèi)，其中含有DEAE-纖維素懸液(約10％ w/v，Whatman DE-22)，相當(dāng)于所收集上清液體積的一半。攪拌30分鐘，使DEAE懸液保持混懸狀態(tài)。然后使DEAE沉降一小時(shí)。吸濾移取上清液。在此期間，將中間相和苯酚相與等量溶液(C)(83％去離子水，15％ w/v冰立方體，2％乙酸鎂濃縮液(0.5M乙酸鎂的0.25巰基乙醇溶液))攪拌30分鐘兩次，然后分離70-80分鐘。將含水上清液轉(zhuǎn)移到含有DEAE的容器內(nèi)，然后再次攪拌，使之沉降。吸濾移取上清液，如上將DEAE先用溶液C洗滌兩次，再用溶液(D)洗滌(2體積乙酸鎂濃縮液，2體積NaCl濃縮液(3.75M NaCl水溶液)，0.2體積Tris-HCl濃縮液(2.5M Tris-HCl，pH7.5水溶液)，96體積水)。
然后將DEAE-纖維素上柱，柱子底部是封閉的。以下所有步驟都是在4℃冷室內(nèi)進(jìn)行的。將柱子用12倍柱內(nèi)容物量的溶液(D)洗滌，流速1.4l/h(僅受重力作用)。然后用溶液(E)(2體積乙酸鎂濃縮液，0.2體積Tris-HCl濃縮液，14體積NaCl濃縮液，84體積水，最終NaCl濃度0.525M，洗脫tRNA，流速3l/h。合并含有超過35 A260nm單位/ml的部分，用1.5體積乙醇沉淀。進(jìn)一步的操作同方法I。
或者，將最終的沉淀溶于水中，冷凍干燥。
這種方法的一個(gè)變例是原料的普通酚處理用異丙醇使粗tRNA從上相中沉淀出來。離心后，將沉淀用乙酸鈉緩沖液提取，經(jīng)過DEAE-纖維素色譜分離。用乙酸鈉/氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫，這是本領(lǐng)域生化技術(shù)人員已知的。見上，借助商的測(cè)量確定適合的部分，合并。用乙醇沉淀tRNA，如上將沉淀溶解，優(yōu)選地冷凍干燥。
采用下列測(cè)定法分析總RNA和tRNA的純度，并鑒定之。
蛋白質(zhì)根據(jù)Lowry，O.H.等(《生物化學(xué)雜志》193，265(1951))并通過A260/A280≌2，DNA根據(jù)Dische(《微量化學(xué)》8，4(1930))，總RNA根據(jù)Mejbaum(《生理學(xué)與化學(xué)》258，117(1939))，tRNA和氨基酸結(jié)構(gòu)單元的定量測(cè)定根據(jù)Sprinzl和Sternbach(《酶學(xué)方法》59，182(1979))，毒性根據(jù)M.Noeldner(私人交流)，體外熱原的缺乏根據(jù)DAB 1997(LAL測(cè)定法)，體內(nèi)熱原的缺乏根據(jù)Ph.Eur./DAB 1997確定。
分析結(jié)果(總RNA和tRNA的性質(zhì)，十次試驗(yàn)的平均值)吸光度A260/A280≌1.94-2.0C、H、N分析C 32.6732.42H 5.22 5.20N 2.29 2.00各種總RNA和tRNA的對(duì)應(yīng)值。
UV與IR光譜UV與IR光譜因生物物質(zhì)而異，它們幾乎相同但不完全相同。
分子量來自酵母的總RNA和tRNA≌平均22000-27000道爾頓，因不同制劑而異；蛋白質(zhì) DNA(總含量)2.3％ neg.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的總RNA1.9％ neg.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的tRNA0.9％ neg.牛來源的總RNA平均為一般普通的質(zhì)量。提高純度沒有引起治療作用顯著提高，與更高的成本不相稱。
關(guān)于tRNA的氨基酸結(jié)構(gòu)單元，10次分析的平均值賴氨酸69-85 pMol/A260單位Phe 41-55Ser 39-50Val 77-90這些平均值因不同批次酵母而異，在所述范圍內(nèi)變化。
毒性小鼠急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物 NMRI小鼠，雄性，Janvier，法國給藥 尾靜脈內(nèi)觀察期 24小時(shí)隨機(jī)樣本數(shù) 最高濃度下n＝10測(cè)定物質(zhì) a.牛總RNAb.來自啤酒酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))的tRNA溶劑 0.9％NaCl水p.i.溶液結(jié)果直至1g/kg/10ml i.v.的最大劑量，試驗(yàn)所用動(dòng)物顯示在24小時(shí)觀察期內(nèi)沒有任何突出特征。
熱原的缺乏A、如前文所述，總RNA和tRNA的熱原含量是根據(jù)DAB 1997(LAL試驗(yàn))用內(nèi)毒素的體外測(cè)定法測(cè)定的，也是根據(jù)Ph.Eur./DAB 1997用兔子測(cè)定的。
1、總RNA內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)EC5變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物-標(biāo)稱靈敏度0.06EU/ml-實(shí)測(cè)靈敏度0.06EU/ml試驗(yàn)溶液100mg RNA的20ml水-LAL溶液(0.5％)結(jié)果用水-LAL按1∶5稀釋的0.5％試驗(yàn)溶液的內(nèi)毒素含量＜0.03EU/ml2、tRNA內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)EC5變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物-標(biāo)稱靈敏度0.06EU/ml-實(shí)測(cè)靈敏度0.06EU/ml試驗(yàn)溶液100mg RNA的20ml水-LAL溶液(0.5％)結(jié)果用水-LAL按1∶10稀釋的0.5％試驗(yàn)溶液的內(nèi)毒素含量＜0.03EU/mlB、根據(jù)Ph.Eur./DAB 1997的體內(nèi)熱原缺乏試驗(yàn)1、總RNA試驗(yàn)溶液1％測(cè)定物質(zhì)的無熱原水p.i.溶液劑量1.0ml/動(dòng)物動(dòng)物3只兔子，符合DAB 1997結(jié)果3只兔子的溫度差異之和為1.05℃，因而熱原是不可檢出的。
2、tRNA試驗(yàn)溶液1％測(cè)定物質(zhì)的無熱原水p.i.溶液劑量1.0ml/動(dòng)物動(dòng)物2次6只兔子，符合DAB 1997結(jié)果 a.6只兔子的溫度差異之和5.40℃b.6只兔子的溫度差異之和4.10℃，熱原可檢出實(shí)施例2本發(fā)明物質(zhì)功效的檢測(cè)70名患者中，40名患有I型單純性皰疹(唇皰疹)，30名患有II型單純性皰疹(生殖器皰疹)，都頻繁復(fù)發(fā)，用總RNA治療。RNA來自牛胎組織的提取物，肝臟除外。將粉狀RNA施用于略微濕潤的病變部位，用量5至10mg，取決于病變部位的大小，自然干燥。所有患者均觀察1年。
5名患者沒有復(fù)發(fā)，7名患者不能被分析，因?yàn)轫槕?yīng)性不足。所有其他原來每年總有若干次復(fù)發(fā)的患者顯示復(fù)發(fā)顯著減少。借助非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果的顯著性為p＜0.001(SPSS，Npar，Mann-Whitney U檢驗(yàn))。
在觀察期為1年的雙盲研究中，如上用牛總RNA或者用來自啤酒酵母的tRNA試驗(yàn)了兩組各100名患者，他們患有唇單純性皰疹和生殖器單純性皰疹，每年復(fù)發(fā)4次以上。一年后用程序SPSS，Npar檢驗(yàn)Mann-Whitney和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
與安慰劑給藥的患者相比，復(fù)發(fā)的減少是非常顯著的在兩種情況下均為p＜0.001。兩種RNA之間的差異不大。
這些結(jié)果證明了所述RNA在患者中的用途，特別是在若干年內(nèi)都觀察到?jīng)]有任何副作用或中毒癥狀。
在將所述物質(zhì)施用于同時(shí)患有面基底細(xì)胞癌的面單純性皰疹患者時(shí)，發(fā)現(xiàn)所述基底細(xì)胞癌減弱了。因此，本發(fā)明藥物的適應(yīng)癥也包括惡性腫瘤。
權(quán)利要求
1.藥物，特別是用于治療皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤，其特征在于它包含異體寡和/或多核糖核苷酸作為活性物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的藥物，其特征在于它另外包含生理學(xué)上可接受的載體、助劑、稀釋劑和/或添加劑。
3.如權(quán)利要求1或2所要求保護(hù)的藥物，其特征在于該活性物質(zhì)包含來自動(dòng)物組織、植物和/或單細(xì)胞生物的寡和/或多核糖核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所要求保護(hù)的藥物，其特征在于該活性物質(zhì)包含來自酵母細(xì)胞的寡和/或多核糖核苷酸。
5.如任意前述權(quán)利要求所要求保護(hù)的藥物，其特征在于該活性物質(zhì)包含異體tRNA。
6.如任意前述權(quán)利要求所要求保護(hù)的藥物，其特征在于該活性物質(zhì)包含通過苯酚萃取所得到的異體寡和/或多核糖核苷酸。
7.如任意前述權(quán)利要求所要求保護(hù)的藥物，其特征在于該異體寡和/或多核糖核苷酸來源于進(jìn)化上遠(yuǎn)離受治療生物的生物。
8.如任意前述權(quán)利要求所要求保護(hù)的藥物，其特征在于該寡和/或多核糖核苷酸是以無水形式存在的。
9.如任意前述權(quán)利要求所要求保護(hù)的藥物，其特征在于它是以適合于局部給藥的形式存在的。
10.異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于治療皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤。
11.如權(quán)利要求10所要求保護(hù)的用途，用于治療由單純性皰疹病毒和/或水痘帶狀皰疹病毒導(dǎo)致的皮膚和/或黏膜病變。
12.如權(quán)利要求10所要求保護(hù)的用途，用于治療基底細(xì)胞癌。
13.異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于制備治療皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤的藥物。
14.皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤的治療方法，其特征在于將每單位劑量的有效量為0.1mg及以上的異體寡和/或多核糖核苷酸對(duì)需要這種治療的患者或動(dòng)物給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有異體寡和/或多核糖核苷酸作為有效組分的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述異體寡和/或多核糖核苷酸的用途,用于治療皰疹病毒感染和皮膚腫瘤。
文檔編號(hào)A61K31/70GK1371282SQ00812122
公開日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2000年8月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者塞恩菲爾德·胡戈 申請(qǐng)人:塞恩菲爾德·胡戈