9種植物微小核糖核苷酸及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及9種植物微小核糖核巧酸及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微小核糖核酸（MciroRNA，miRNA)是一類特殊的非編碼單鏈小分子RNA，由19~25 個核巧酸組成，是近10年來生物學(xué)研究的熱點。大量研究證實，動物體內(nèi)的miRNA可通過 抑制祀mRNA翻譯而降低相應(yīng)蛋白合成，廣泛參與細(xì)胞活動的一系列生理及病理活動過程， 包括細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞調(diào)亡、細(xì)胞代謝、腫瘤形成、病毒感染及免疫應(yīng)答等。miRNA作為調(diào)控細(xì) 胞功能的關(guān)鍵因子，其與人體疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)生物體體內(nèi)Dicer酶缺失或不 足時，內(nèi)源性miRNA無法正常生成，從而導(dǎo)致干細(xì)胞的丟失和細(xì)胞周期的改變、早期胚胎 體致死和器官發(fā)育異常。因此，miRNA可作為疾病早期診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物，亦可作為 藥物干預(yù)的新祀點和新途徑。
[0003] 由于miRNA不僅在基因位置上保守，序列上也呈現(xiàn)出高度的同源性。一些植物內(nèi) 源性的核巧酸類物質(zhì)通過日常飲食吸收進入體內(nèi)后，可被體內(nèi)的Dicer酶剪切，產(chǎn)生一類 類似于miRNA的核巧酸類物質(zhì)，進而影響人體mRNA的表達(dá)。近年來，植物miRNA被證實是 一類新的藥效物質(zhì)，可跨界調(diào)控人體基因大豆、玉米(根、葉及種子)、大要中的一些miRNA均 可W通過日常飲食吸收進入血內(nèi)，并具有一定的組織分布選擇性。牛奶中也含有大量的具 有免疫調(diào)控功能的miRNA。相對于動物來源的miRNA,植物來源的miRNA由于其基因編碼末 端本身是2-0-甲基化修飾的，其化學(xué)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，即使采用高艦酸鋼、福爾馬林等強氧 化劑、強腐蝕劑進行處理，其結(jié)構(gòu)亦不產(chǎn)生影響；即使經(jīng)過了高溫蒸煮、消化系統(tǒng)的代謝等 過程，植物來源miRNA的結(jié)構(gòu)依然沒有發(fā)生變化，不被降解，仍然可W在血液中檢出，在種 間的"穿梭"仍能保持穩(wěn)定的狀態(tài)，表明了植物miRNA結(jié)構(gòu)的高度穩(wěn)定性。
[0004] 由此我們推測，miRNA也可能是中藥的活性成分之一，并且不同于W往中藥或中藥 活性成分進入人體調(diào)節(jié)其他分子的作用機制，中藥miRNA可W直接調(diào)節(jié)人體mRNA表達(dá)。因 此，利用miRNA技術(shù)多個視角探討研究中醫(yī)藥具有廣闊的前景。為了驗證該些檢測到的植 物miRNA序列的確來源于植物，對人/小鼠血清的totalRNA進行高艦酸鋼處理，對人/小 鼠血清中檢測到的幾個植物miRNA進行miRNA測序和qPCR鑒定。由于高艦酸鋼為強氧化 劑，能夠氧化動物來源的miRNA的2'、3'位自由哲基，導(dǎo)致動物來源的miRNA在進行miRNA 測序和qPCR時不被檢測到或者檢測豐極低。植物來源的miRNA由于其末端本身是2-0-甲 基化修飾的，高艦酸鋼處理對對其結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生影響，所W在進行miRNA測序和qPCR時其檢 測表達(dá)量幾乎不產(chǎn)生變化。從而證明幾個miRNA的確來源于植物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供9種來源于植物的治療腫 瘤和非酒精性脂肪肝疾病的microRNA及其應(yīng)用的技術(shù)方案。
[0006] 所述的用于制備治療腫瘤和非酒精性脂肪肝疾病的藥物，其特征在于包含9種 植物microRNA的任一種，所述的9種植物microRNA分別為csi-miR3952、csi-miR48化、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、 cca-miR167。
[0007] 所述的用于制備治療腫瘤、非酒精性脂肪肝疾病的藥物，其特征在于9種植 物microRNA的RNA包含如下序列；csi-miR3952核巧酸序列如SEQIDN0;1所示， csi-miR48化核巧酸序列如SEQIDN0;2所示，gma-miR393a核巧酸序列如SEQIDN0;3所 示，csi-miR482c核巧酸序列如SEQIDNO;4所示，gma-miR396a核巧酸序列如SEQIDNO; 5所示，gma-miR159a核巧酸序列如SEQIDNO;6所示，csi-miR172a核巧酸序列如SEQID NO;7所示，csi-mi貼30a核巧酸序列如SEQIDNO;8所示，cca-miR167核巧酸序列如SEQ IDNO;9 所示。
[0008] 所述的用于制備治療腫瘤、非酒精性脂肪肝疾病的藥物，其特征在于9種植物 microRNA的前體RNA包含如下序列；csi-miR3952前體核巧酸序列如SEQIDN0;10所示， csi-miR48化前體核巧酸序列如SEQIDNO;11所示，gma-miR393a前體核巧酸序列如SEQ IDNO;12所示，csi-miR482c前體核巧酸序列如SEQIDNO;13所示，gma-miR396a前體 核巧酸序列如SEQIDN0;14所示，gma-miR159a前體核巧酸序列如SEQIDN0;15所示， csi-miR172a前體核巧酸序列如SEQID^;16所示，〇31-1111貼3〇3前體核巧酸序列如569 IDNO;17所示，cca-miR167前體核巧酸序列如SEQIDNO;18所示。
[0009] 所述的9種植物microRNA中任一種或幾種在制備治療腫瘤、非酒精性脂肪肝 疾病的藥物中的應(yīng)用，所述的9種植物microRNA分別為csi-miR3952、csi-miR482b、 gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、 cca-miR167。
[0010] 所述的應(yīng)用，其特征在于9種植物microRNA的RNA包含如下序列；csi-miR3952 核巧酸序列如SEQIDNO; 1所示，csi-miR482b核巧酸序列如SEQIDNO;2所示， gma-miR393a核巧酸序列如SEQIDN0;3所示，csi-miR482c核巧酸序列如SEQIDN0;4所 示，gma-miR396a核巧酸序列如SEQIDN0;5所示，gma-miR159a核巧酸序列如SEQIDNO; 6所示，csi-miR172a核巧酸序列如SEQIDNO;7所示，csi-mi貼30a核巧酸序列如SEQID NO;8所示，cca-miR167核巧酸序列如SEQIDNO;9所示。
[0011] 所述的應(yīng)用，其特征在于9種植物microRNA的前體RNA包含如下序列； csi-miR3952前體核巧酸序列如SEQIDN0;10所示，csi-miR48化前體核巧酸序列如SEQ IDNO;11所示，gma-miR393a前體核巧酸序列如SEQIDNO;12所示，csi-miR482c前體 核巧酸序列如SEQIDN0;13所示，gma-miR396a前體核巧酸序列如SEQIDN0;14所示， gma-miR159a前體核巧酸序列如SEQIDN0;15所示，csi-miR172a前體核巧酸序列如SEQ 10側(cè)；16所示，。31-1111貼3〇3前體核巧酸序列如569 10側(cè)；17所示，。。3-11111?167前體核巧 酸序列如SEQIDNO; 18所示。
[0012] 本發(fā)明一方面提供了一種治療腫瘤和非酒精性脂肪肝疾病的藥物，該藥物具有抗 腫瘤細(xì)胞增殖，改善肝臟脂肪積聚，本發(fā)明另一方面確定了一種治療腫瘤和非酒精性脂肪 肝疾病的藥物的應(yīng)用，其可作為治療肺癌、結(jié)腸癌、非酒精性脂肪肝炎。
【附圖說明】
[0013] 圖1miRNA抑制化pG2細(xì)胞脂肪變性。
【具體實施方式】
[0014] W下結(jié)合實施例來進一步說明本發(fā)明。
[0015] 實施例1 ;miRNA的篩選及鑒定 選擇新鮮或陰干的枯皮，分別用于喂食小鼠和miRNA測序（3個生物學(xué)重復(fù))。兩組ICR小鼠（18~20g)，共計6只，分別禁食8h后，對照組禁食不禁水，實驗組灌食枯皮勻漿液。 于給藥2h后采集相應(yīng)小鼠血液，分離血漿，分別提取totalRNA。質(zhì)檢合格后制備文庫，采 用IlluminaHiseq2000進行樣本測序分析。根據(jù)測序結(jié)果，選擇在枯皮miRNA測序中發(fā)現(xiàn) 并有較高表達(dá)豐度，在喂食小鼠飼料的小鼠血漿miRNA測序中未發(fā)現(xiàn)，在灌食枯皮組的小 鼠血漿miRNA測序中發(fā)現(xiàn)并有較高表達(dá)豐度的miRNA,該些miRNA作為植物來源的miRNA在 小鼠體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能的可能性很大。對于該些植物來源的miRNA(選擇10-15個表達(dá) 豐度相對高的)，通過qPCR分別在小鼠灌食枯皮的血漿miRNA和枯皮miRNA進行鑒定。最終 選擇csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、 csi-miR172a、csi-mi貼30a、cca-miR167為枯皮中存在的，并可吸收入血的miRNA。比較其 表達(dá)量在喂食枯皮小鼠血漿中隨著時間變化的趨勢，基本判定該些miRNA是來自于枯皮。
[0016] 實施例2;抗腫瘤藥效試驗 1.體外抗腫瘤實驗 1.1對腫瘤細(xì)胞增殖的影響 取培養(yǎng)3~4d處于指數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞一瓶，加入適量的0. 25%T巧psin-邸TA液， 使貼壁細(xì)胞脫落，用10%胚牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成1X104個細(xì)胞/ml懸液。取96 孔平板，每孔加細(xì)胞懸液100yL置371：、5%C02及100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2化后，每孔加入 不同濃度的通過化學(xué)方法合成的csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、 gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-mi貼30a、cca-miR167 (csi_miR3952 核巧 酸序列如SEQIDNO;1所示，csi-miR48化核巧酸序列如SEQIDNO;2所示，gma-miR393a 核巧