專利名稱：干細(xì)胞靶向的制作方法
干細(xì)胞靶向
背景技術(shù)：
心血管病是心臟和/或血管疾病，是發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率和死亡率的主要原因。心血管病的主要病因之一是缺血性心臟病(IHD或心肌缺血)，其特征在于心肌接受減少的血液供給，這通常是冠狀動(dòng)脈疾病(諸如冠狀動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化)的結(jié)果。減少的向心肌的血液供給可以導(dǎo)致心肌損傷和肌細(xì)胞死亡，這又可以導(dǎo)致心力衰竭。心力衰竭也可以由慢性高血壓、病毒感染、心瓣膜異常和遺傳原因以及其它原因造成。根據(jù)嚴(yán)重性，可以用多種方案治療心力衰竭。在心力衰竭的早期，與藥理學(xué)干預(yù) (諸如ACE抑制劑和β-阻斷劑)一起推薦戒煙和體育活動(dòng)。對(duì)于具有更嚴(yán)重的征狀的那些，可以采用植入型除顫器或起搏器，且在極端情況下，可以推薦心臟移植(Jessup等人， 2009，ACFF/AHA指南)。盡管目前的治療會(huì)減少心肌梗塞(MI)以后的發(fā)病率和死亡率，即使根據(jù)目前的指南進(jìn)行治療，這些水平也保持較高。最近，已經(jīng)開始開發(fā)心臟組織工程和細(xì)胞移植以再生心肌的方案。許多這樣的方案涉及，經(jīng)由冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射或心肌內(nèi)注射，向心臟遞送干細(xì)胞(綜述參見，例如=Fazel等人Ann. Thorac. Surg. 2005 ；79 :S22238_47)。這些細(xì)胞(主要源自骨髓)能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞類型，包括心肌和血管細(xì)胞，從而使它們成為促進(jìn)損傷后心臟再生的有吸引力的工具。盡管動(dòng)物研究已經(jīng)證實(shí)了使用這些方案的一些效能，迄今為止幾乎沒有觀察到臨床益處。這些方案迄今為止幾乎沒有表現(xiàn)出心臟功能改善，存在許多原因。一個(gè)這樣的原因是，干細(xì)胞的無效尋靶(ineffective homing)和保留。實(shí)際上，許多研究已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)在心臟損傷以后將骨髓細(xì)胞注射進(jìn)心臟中時(shí)，這些細(xì)胞大部分將停止在其它器官中，包括肺、脾和肝。因而，需要改良的使干細(xì)胞靶向受損的肌肉的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于使干細(xì)胞靶向包括肌肉在內(nèi)的組織的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于使干細(xì)胞靶向心臟的組合物和方法。在一個(gè)方面，提供了一種構(gòu)建體，其包含結(jié)合干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子的第一種藥劑，和結(jié)合組織特異性的標(biāo)志物分子的第二種藥劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體是抗原-結(jié)合構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種藥劑和/或第二種藥劑是抗體，諸如單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種藥劑和/或第二種藥劑是表位-結(jié)合域，且結(jié)合標(biāo)志物分子上的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位-結(jié)合域是免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。所述構(gòu)建體可以包含其它藥劑或表位結(jié)合域，它們結(jié)合其它干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子或在這樣的干細(xì)胞特異性的分子上的表位、其它組織特異性的標(biāo)志物分子或在這樣的組織特異性的標(biāo)志物分子上的其它表位，或結(jié)合其它分子的藥劑或表位結(jié)合域。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了雙靶向構(gòu)建體，在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了多靶向構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子和/或所述組織特異性的分子是人分子。干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括，例如，⑶34、⑶44、CD45、CD133 和 CD117(c_Kit)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子是c-Kit。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合c-Kit的藥劑是抗體，諸如單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合 c-Kit的藥劑是根據(jù)本發(fā)明任意方面的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，諸如本文所述的那些。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種構(gòu)建體，其包含本文所述的c-Kit dAb和結(jié)合組織特異性的標(biāo)志物分子的藥劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織特異性的標(biāo)志物分子是肌肉特異性的標(biāo)志物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉特異性的分子選自肌球蛋白衍生的分子，諸如肌球蛋白輕鏈(MLC)或肌球蛋白重鏈，包括但不限于人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl (v-MLCl、 vMLC-1)；也稱作cMLC或MLC 3)、MLC 2或肌球蛋白重鏈6 (肌球蛋白重鏈、心肌α同種型)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉特異性的標(biāo)志物分子是心肌特異性的標(biāo)志物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述“心肌-特異性的分子”是這樣的分子其僅在受損的心肌中表達(dá)或暴露，且在健康的未受損的心肌中不表達(dá)或暴露。在缺血性損傷(諸如心肌梗塞)以后，發(fā)生肌細(xì)胞損傷和壞死，導(dǎo)致細(xì)胞的破裂和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白或心臟結(jié)構(gòu)蛋白暴露于環(huán)境中。 vMLCl(也稱作MLC 3)是這樣的分子的一個(gè)實(shí)例。其它心肌特異性的分子包括心臟肌鈣蛋白I或心臟肌鈣蛋白諸如心臟肌鈣蛋白T、在心肌損傷部位被向上調(diào)節(jié)的膜聯(lián)蛋白和分子 (諸如生腱蛋白C和肌酸激酶)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合肌肉特異性的標(biāo)志物分子的藥劑是抗-MLC抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-MLC抗體對(duì)人心臟肌球蛋白輕鏈具有高親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-MLC抗體是單克隆抗體?？?MLC抗體包括結(jié)合人心室肌球蛋白輕鏈1的抗體， 且在例如US 5，702，905中被描述為單克隆抗體39-15(可從ATCC HB 11709得到，或在商業(yè)上得到,例如MLM508 (Abeam))。在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面的構(gòu)建體中的抗-MLC抗體是本文所述的和根據(jù)本發(fā)明任意方面的人源化的抗-MLC抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-MLC抗體是抗-MLC免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域抗體。本文描述了用于制備特異性的單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域抗體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，其包含抗-MLC免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。這樣的構(gòu)建體可以是“dAb-dAb”構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與結(jié)合c-Kit的藥劑結(jié)合c-kit的親和力相比，所述結(jié)合肌肉特異性的標(biāo)志物分子的藥劑以更高的親和力進(jìn)行結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，其包含本文所述的抗-MLC單克隆抗體和抗-c-Kit單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，其包含與免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(dAb)結(jié)合的單克隆抗體(MAb)。這樣的構(gòu)建體被稱作“MAbdAb”(或“mAbdAb”、 “mAb-dAb”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體包含結(jié)合肌肉特異性的標(biāo)志物分子的藥劑，諸如單克隆抗-MLC抗體和抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，其包含單克隆抗-c-Kit抗體和抗-MLC免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域?？梢杂欣厥褂冒琩Ab的構(gòu)建體，因?yàn)閙Ab-dAb構(gòu)建體可以表達(dá)為單個(gè)分子。另外，使用dAb可以允許與受體的單價(jià)相互作用，從而減少受體活化的可能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體選自在表對(duì)中所述的任意構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含dAb，它是來自D0iC8h-94譜系的dAb。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種藥劑和/或所述第二種藥劑與來自另一個(gè)物種的干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子或肌肉特異性的標(biāo)志物分子交叉反應(yīng)，所述另一個(gè)物種例如小鼠、大鼠、狗、豬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物物種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子的第一種藥劑和所述結(jié)合肌肉特異性的標(biāo)志物分子的第二種藥劑連接到一起。合適的連接物包括化學(xué)連接劑諸如 SulfoSMCC和從諸如Pierce等生產(chǎn)商可得到的其它連接物。其它合適的連接物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。合適的連接物的其它實(shí)例包括這樣的氨基酸序列其長(zhǎng)度可以是1個(gè)氨基酸至約 150個(gè)氨基酸，或1個(gè)氨基酸至約140個(gè)氨基酸，例如，1個(gè)氨基酸至約130個(gè)氨基酸，或1 至約120個(gè)氨基酸，或1至約80個(gè)氨基酸，或1至約50個(gè)氨基酸，或1至約20個(gè)氨基酸， 或1至約10個(gè)氨基酸，或約5至約18個(gè)氨基酸。這樣的序列可以具有它們自己的三級(jí)結(jié)構(gòu)，例如，本發(fā)明的連接物可以包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接物的大小等于單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。合適的連接物的大小可以是約1至約20埃，例如小于約15埃、或小于約10埃、或小于約5埃。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用連接物，將至少一個(gè)表位結(jié)合域直接連接至Ig支架上，所述連接物包含1至約150個(gè)氨基酸，例如1至約20個(gè)氨基酸，例如1 至約10個(gè)氨基酸。這樣的連接物可以選自下述的任一種G4S連接物(GGGGS;SEQ ID NO 88) ；TVAAPS(SEQ ID NO 89) ；ASTKGPT(SEQ ID NO 90) ；ASTKGPS (SEQ ID NO 91)； EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO 92) ；ELQLEESCAEAQDGELDG(SEQ ID NO :93)，“AST”(SEQ ID NO 94), STGGGGGS(SEQ ID NO 95), STGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO :96)，STGPPPPPS(SEQ ID NO 97), STGPPPPPPPPPPS (SEQ ID N0:98)，‘STG，(絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸；SEQ ID NO: 99)、‘GSTG，(SEQ ID NO :100)或 ‘RS，(SEQ ID NO :101)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接物選自STG、GGGGS和PPPPPS(SEQ ID NO :483)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接物可以是這樣的連接物其由于空間限制，減少dAb和Fc結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的潛力，從而增加Fc區(qū)域參與它的正常相互作用的機(jī)會(huì)。在該實(shí)施方案中，所述連接物可以是來自諸如人糖蛋白 VI (GPVI)等蛋白的莖區(qū)域，例如STGSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTS PKESDSPAGPARQYYTKGNGSTG(SEQ ID NO :484)。在本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體中使用的連接物可以包含單獨(dú)的或與其它連接物組合的一個(gè)或更多個(gè)GS殘基集合，例如‘GSTVAAPS’ (SEQ ID NO 102)或 ‘TVAAPSGS，(SEQ ID NO :103)或 ‘GSTVAAPSGS，(SEQ ID NO :104)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在表位結(jié)合域(例如dAb和Ig支架)之間沒有連接物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表位結(jié)合域(例如dAb)通過連接物‘TVAAPS’ (SEQ ID NO 89)連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表位結(jié)合域(例如dAb)通過連接物‘TVAAPSGS’ (SEQ ID NO :103)連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表位結(jié)合域(例如dAb)通過連接物‘GS’ (SEQ ID NO 105)連接至Ig支架上。本文描述了適用于制備根據(jù)本發(fā)明的MAbdAb構(gòu)建體的方法。dAb連接至Mab上的不同位置，形成本發(fā)明該方面的實(shí)施方案。在圖15中，例證了這樣的dAb連接位置，且也包括dAb與MAb的可變結(jié)構(gòu)域的連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過在例如EP 1864998中描述的Fc區(qū)域或重鏈恒定區(qū)，可以連接包含dAb-dAb的構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種構(gòu)建體(其中靶向抗體之一是連接至Fc結(jié)構(gòu)域上的單克隆抗體或dAb)具有足以減小構(gòu)建體從血液中的清除速率的尺寸，即提供延長(zhǎng)的半衰期(與單獨(dú)的dAb相比)。延長(zhǎng)半衰期的其它方法和測(cè)定半衰期的方法，描述在例如WO 2008096158中。這樣的方法包括產(chǎn)生蛋白酶抗性，連接到血清蛋白(諸如血清白蛋白 AlbudAbs )上，等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含滅活的Fc或替代性的IgG同種型，其不會(huì)誘導(dǎo) ADCC。在另一個(gè)方面，提供了一種核苷酸序列，其編碼根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了結(jié)合肌球蛋白輕鏈(MLC)的抗原結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合MLC的抗原結(jié)合蛋白是這樣的抗原結(jié)合蛋白，其結(jié)合MLC的心臟同種型，例如心室MLC(vMLC、vMLC-l、MLC-3)或人心室MLC(HVMLC)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述抗原結(jié)合蛋白結(jié)合人心室肌球蛋白輕鏈1 (vMLCl)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明該方面的抗原結(jié)合蛋白是與小鼠單克隆抗體 39-15 (ATCC HB11709)有關(guān)的、結(jié)合vMLCl的抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗原結(jié)合蛋白其結(jié)合vMLCl，且其包含如SEQ ID N0:13或SEQ ID N0:17所述的 39-15的重鏈或輕鏈⑶R3序列，或其含有1、2或3個(gè)在⑶R3中的氨基酸置換的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，任意這樣的變體也結(jié)合vMLCl。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白包含下述的⑶R ⑶RHl (SEQ ID NO :18)CDRH2(SEQ ID NO :19)、CDRH3 (SEQ ID NO :20)、CDRLl (SEQ ID NO :14)、CDRL2 (SEQ ID NO :15)、CDRL3(SEQ ID NO :16)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白結(jié)合人vMLCl和另一種源自不同物種的 MLC1，所述不同物種諸如小鼠、狗或食蟹猴(cyno)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白結(jié)合小鼠和人vMLCl。在本發(fā)明的上下文中，在來自人和其它物種的vMLCl之間的這種交叉反應(yīng)性允許同一種抗體構(gòu)建體用于動(dòng)物疾病模型以及人類。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白是抗體，諸如人源化的或嵌合的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的MLC抗原結(jié)合蛋白包括39-15的非-鼠等效物，諸如本文所述的人源化形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、 diabody> triabody> tetrabody>itMi)l# (miniantibody)、^白勺 VH、^>|^白勺 VK dAb。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)可以與輕鏈可變區(qū)格式化(formatted)在一起， 以允許以常規(guī)免疫球蛋白方式(例如人IgG、IgA、IgM等)結(jié)合MLC，或以任意其它“抗體-樣”形式結(jié)合人MLC (例如單鏈FV、diabody Jandabs等(關(guān)于替代性的“抗體”形式的總結(jié)，參見 Holliger 和 Hudson，Nature Biotechnology, 2005, Vol. 23，No. 9，1126-1136)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID剛22、25、觀或 31 WVh結(jié)構(gòu)域，其與輕鏈可變區(qū)配對(duì)，形成結(jié)合MLC的抗原結(jié)合單位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0:34或37的Vk結(jié)構(gòu)域，其與重鏈可變
11區(qū)配對(duì)，形成結(jié)合MLC的抗原結(jié)合單位。本文例證了其它合適的配對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了這樣的抗原結(jié)合蛋白其包含選自SEQ ID而22、25、觀或31的￥11結(jié)構(gòu)域，和選自SEQ ID N0:34或37的Vk結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈具有SEQ ID NO :31所述的序列，且所述輕鏈具有SEQ ID N0:37所述的序列。在其它實(shí)施方案中，提供了本文所述的任意\結(jié)構(gòu)域或Vk結(jié)構(gòu)域與任意輕鏈或重鏈可變區(qū)的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述\結(jié)構(gòu)域或Vk結(jié)構(gòu)域是圖5所述的任意序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白會(huì)以高親和力結(jié)合人MLC，例如 MLC的人心臟同種型，諸如HVMLC和HVMLC-1，通過Biacore測(cè)得，所述親和力是在約0. IpM 至約ΙΟΟηΜ、例如約0. IpM至約IOOpM范圍內(nèi)。在另一個(gè)方面，提供了一種核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白或抗體。 還提供了用這樣的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)方面，提供了第一種載體和第二種載體，其中所述第一種載體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白或抗體的重鏈的核酸分子，所述所述第二種載體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的抗原或抗體的輕鏈的核酸分子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗-C-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)第一個(gè)方面的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是以在下述范圍內(nèi)的解離常數(shù)(Kd、KD、Kd)結(jié)合c-Kit的可變結(jié)構(gòu)域約IOpM至約10微摩爾，例如約IOOpM至約 10微摩爾、約IOnM至約1微摩爾、或約InM至約ΙΟΟηΜ。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其包含抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的多肽包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少約70%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列，且所述分離的多肽結(jié)合c-Kit。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的多肽包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與 SEQ ID NO :148-163,247-269,283-295. 301-305,477-482 中的任一個(gè)所述的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少70%同一性，且所述分離的多肽結(jié)合c-Kit。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的多肽包含與D0iC8h-94譜系氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。適當(dāng)?shù)?，分離的多肽包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與SEQ ID NO 302-305、457、458或482中的任一個(gè)所述的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少70%同一性。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其包含由具有SEQ ID NO =39-87, 224-246,270-282,297-300,383-384,383-384或476中的任一個(gè)所述序列的核酸編碼的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列與選自下述的核苷酸序列具有至少約60%同一性在圖6、16、17或20中所述的任一個(gè)核酸序列(SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384、383-384 或 476)，且所述分離的多肽結(jié)合c-Kit。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明任意方面的分離的多肽會(huì)結(jié)合人c-Kit。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽會(huì)結(jié)合人c-Kit和來自另一個(gè)物種(諸如小鼠、 狗或食蟹猴)的c-Kit。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽會(huì)結(jié)合人和小鼠c-Kit。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列具有至少約90%同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282,297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476所述的任意核酸序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗_c_Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與由鑒別為D0iC8h-5(SEQ ID NO 39)、D0M28h-43 (SEQ ID NO :51)、D0M28h_33 (SEQ ID NO :49)、D0M28h_94 (SEQ ID NO 65)、D0M28h-66 (SEQ ID NO :58)、D0M28h_110 (SEQ ID NO :70)、D0M28h_84 (SEQ ID NO 62)、D0M28m-23 (SEQ ID NO :81)、D0M28m_7 (SEQ ID NO :78)、D0M28m_52 (SEQ ID NO 84)、D0M28h-79 (SEQ ID NO :61)、D0M28h_7 (SEQ ID NO :41)、D0M28h_20 (SEQ ID NO :45)、 D0M28h-26 (SEQ ID NO :48)、D0M28h_78 (SEQ ID NO :60)、D0M28h_73 (SEQ ID NO :59)、 D0M28h-54 (SEQ ID NO :55)、D0M28h_113 (SEQ ID NO :72)、D0M28h_115 (SEQ ID NO :73)禾口 D0M28m-73 (SEQ ID NO :86)的任一個(gè)核酸序列編碼的氨基酸序列相同。在一個(gè)實(shí)施方案中， 根據(jù)本發(fā)明任意方面的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域會(huì)結(jié)合人c-Kit。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域會(huì)結(jié)合人c-Kit和來自另一個(gè)物種的c-Kit，所述另一個(gè)物種例如小鼠、狗或猴諸如食蟹猴(cyno)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域會(huì)結(jié)合人和小鼠c-Kit。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297_300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDR3序列所述CDR3序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列，且包含這樣的⑶R2序列所述⑶R2序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87中的任一個(gè)所述的序列，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297_300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的⑶R3 序列所述⑶R3序列與選自下述的⑶R3序列具有至少約50%同一性在由具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自下述的 CDR3 序列在由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383_384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列。在另一個(gè)方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含至少一個(gè)選自 CDR1、CDR2 和 CDR3 的 CDR，其中所述 CDRU CDR2 或 CDR3 與在由具有 SEQ ID NO 39-87、 224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的⑶R1、⑶R2或⑶R3序列相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)選自圖7所述CDR序列的CDR。在一個(gè)方面，提供了一種核酸分子，其包含根據(jù)本發(fā)明的編碼抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300,383-384或476中的任一個(gè)所述的核酸序列。在另一個(gè)方面，提供了一種配體，其具有對(duì)c-Kit的結(jié)合特異性，并抑制抗-c-Kit 免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，所述單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含由下述的核酸編碼的氨基酸序列，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。c-Kit的結(jié)構(gòu)以及通過干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合的信號(hào)傳遞，描述在例如， Ronnstrand ；Cellular and Molecular Life Sciences,61 (2004),2535-2548 禾口 Yuzawa等人Cell 13(K2007)，323-334。干細(xì)胞因子會(huì)結(jié)合c_Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致酪氨酸激酶活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域會(huì)以基本上不抑制SCF的c-Kit受體結(jié)合和/或活化的方式，結(jié)合c-Kit。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域會(huì)以基本上抑制SCF的c-Kit受體結(jié)合和/或活化的方式，結(jié)合c-Kit。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在本文所述的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)中，測(cè)定SCF與c-Kit的結(jié)合的抑制。用于測(cè)定c-Kit活化的其它試驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，且包括測(cè)量下游信號(hào)傳遞組分的試驗(yàn)，例如如上面提及的Rormstrand所述。其它合適的試驗(yàn)包括磷酸化試驗(yàn)，諸如由MSD提供的試驗(yàn)，目錄號(hào)K11119D-2。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合c-Kit， 且對(duì)于SCF結(jié)合而言不是競(jìng)爭(zhēng)性的。在該實(shí)施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域可以選自這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由D0iC8h-5(SEQ ID NO :39)、 D0M28h-33 (SEQ ID NO :49)、D0M28h_43 (SEQ ID NO :51)、D0M28h_66 (SEQ ID NO :58)、 D0M28h-84 (SEQ ID NO :62)、D0M28h_94 (SEQ ID NO :65)、D0M28h_110 (SEQ ID NO :70)、 D0M28m-7 (SEQ ID NO 78), D0M28m-23 (SEQ ID NO :81) ^P D0M28m-52 (SEQ ID NO :84)中的任一個(gè)所述的核酸序列編碼。本文例證了其它合適的非競(jìng)爭(zhēng)性的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合 c-Kit，且對(duì)于SCF結(jié)合而言是競(jìng)爭(zhēng)性的。在該實(shí)施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域可以選自這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由D0iC8h-7 (SEQ ID NO 41)、D0M28h-20(SEQ ID NO :45)、D0M28h_26 (SEQ ID NO :48)、D0M28h_54 (SEQ ID NO :55)、 D0M28h-73 (SEQ ID NO :59)、D0M28h_78 (SEQ ID NO :60)和D0M28h_79 (SEQ ID NO :61)中的任一個(gè)所述的核酸序列編碼。本文例證了其它合適的競(jìng)爭(zhēng)性的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出人c-Kit與來自另一個(gè)物種 (諸如小鼠、狗或食蟹猴)的c-Kit之間的交叉反應(yīng)性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出人和小鼠c-Kit之間的交叉反應(yīng)性。在該實(shí)施方案中，所述可變結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合人和小鼠c-Kit。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)人和小鼠c-Kit交叉反應(yīng)性的可變結(jié)構(gòu)域選自這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由D0iC8h-5(SEQ ID NO 39) ,D0M28h-94(SEQ ID NO :65)、D0M28m-7(SEQ ID NO :78)、D0M28m_23 (SEQ ID NO :81)和 D0M28m_52 (SEQ ID NO 84)中的任一個(gè)所述的核酸序列編碼。本文例證了其它交叉反應(yīng)性的可變結(jié)構(gòu)域。如上所述，交叉反應(yīng)性是特別有用的，因?yàn)樗幬镩_發(fā)通常需要在動(dòng)物系統(tǒng)(諸如小鼠模型)中測(cè)試先導(dǎo)藥物候選物，然后才能在人類中測(cè)試該藥物?？梢越Y(jié)合人蛋白以及物種同源物(諸如等效的小鼠蛋白)的藥物的提供，允許測(cè)試在這些系統(tǒng)中的結(jié)果，并使用相同的藥物，進(jìn)行數(shù)據(jù)的并行對(duì)比。這會(huì)避免需要發(fā)現(xiàn)對(duì)例如小鼠c-Kit起作用的藥物和對(duì)人c-Kit起作用的單獨(dú)藥物的復(fù)雜性，并避免了對(duì)使用非相同藥物或替代藥物對(duì)比在人和小鼠中的結(jié)果的需要。任選地，免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域?qū)χ辽傩∈骳-Kit的結(jié)合親和力和對(duì)人 c-Kit的結(jié)合親和力相差不超過約5、約10、約50或約100的倍數(shù)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體(例如，雙特異性的配體、多特異性的配體)、抗-MLC抗體或抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體的方法，所述方法包括在適合表達(dá)重組核酸的條件下，維持包含本發(fā)明的重組核酸的重組宿主細(xì)胞，由此表達(dá)重組核酸，并生產(chǎn)配體。在有些實(shí)施方案中，所述方法另外包括分離所述配體。關(guān)于適用于本發(fā)明實(shí)施方案的公開內(nèi)容的細(xì)節(jié)，參照W0200708515第161頁第M 行至第189頁第10行。其公開內(nèi)容特此通過引用并入本文，如同它明確地出現(xiàn)在本公開內(nèi)容的文本中，并涉及本發(fā)明的實(shí)施方案，并明確地支持公開內(nèi)容并入下面的權(quán)利要求中。這包括在W0200708515第161頁第M行至第189頁第10行中呈現(xiàn)的公開內(nèi)容，其提供了“基于免疫球蛋白的配體的制備”、“文庫(kù)載體系統(tǒng)”、“文庫(kù)構(gòu)建”、“組合單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”、“配體的表征”、“配體的結(jié)構(gòu)”、“骨架”、“蛋白支架”、“用于構(gòu)建配體的支架”、“規(guī)范序列的多樣化” 和“治療性和診斷性組合物和應(yīng)用”的細(xì)節(jié)、以及“可操作地連接”、“首次用于實(shí)驗(yàn)的”、“預(yù)防”、“抑制”、“治療”、“變態(tài)反應(yīng)性疾病”、“Th2-介導(dǎo)的疾病”、“治療有效劑量”和“有效”的定義。在一個(gè)方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體，其用于靶向c-Kit，用于治療與c-Kit受體活化有關(guān)的疾病或障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是這樣的可變結(jié)構(gòu)域其在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)中與SCF競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制SCF對(duì)c-Kit的活化。本文公開了合適的競(jìng)爭(zhēng)性的dAb。與c-Kit活性有關(guān)的疾病或障礙包括肥大細(xì)胞障礙和癌癥。具體地，已經(jīng)提示， c-Kit活性涉入腫瘤血管生成。因此，靶向c-Kit可以允許在抗癌治療中抑制腫瘤血管生成。另外，已經(jīng)在許多癌癥中鑒別出了 c-Kit和SCF自分泌環(huán)(其中腫瘤表達(dá)c-Kit 和SCF)，所述癌癥包括小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、婦科腫瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤(參見 Ronnstrand ；Cellular and Molecular Life Sciences,61(2004),2535-2548)。在另一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域多肽或配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體可以連接到裝置(諸如支架)上。在例如WO 03/065881中，描述了合適的這樣的裝置。 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體可以
16連接到支架的表面上，使得它可用于干細(xì)胞尋靶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在該實(shí)施方案中，所述c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是非競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合c-Kit的單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，即對(duì)于 C-Kit的SCF活化而言是非競(jìng)爭(zhēng)性的。在另一個(gè)方面，提供了用于使干細(xì)胞靶向靶組織的根據(jù)本發(fā)明的抗原-結(jié)合構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶組織會(huì)表達(dá)組織特異性的標(biāo)志物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述抗原-結(jié)合構(gòu)建體是用于將干細(xì)胞募集至靶組織，以便再生靶組織。因此，本發(fā)明的構(gòu)建體是用于治療患病的靶組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體是用于治療肌肉病。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療心臟病的根據(jù)本發(fā)明的抗原-結(jié)合構(gòu)建體。在另一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的抗原-結(jié)合構(gòu)建體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子療法可以用于動(dòng)員骨髓干細(xì)胞和祖細(xì)胞。細(xì)胞因子療法描述在例如，Kang 等人 Lancet (2004)，363 ；751-6。合適的細(xì)胞因子包括 SCF、G-CSF, SDF-U AMD3100 (商品名=Mozobil)、VEGF, FGF 和 DPP-IV 抑制劑。在另一個(gè)方面，提供了一種治療心臟病的方法，所述方法包括施用根據(jù)本發(fā)明的抗原-結(jié)合構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法另外包括施用細(xì)胞因子，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子選自SCF、G-CSF, SDF-I、AMD3100、VEGF, FGF和DPP-IV抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從要治療的患者提取骨髓細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中， 可以從患者的胸骨或髂嵴提取骨髓細(xì)胞，或者可以從血液分離出細(xì)胞。未分級(jí)的骨髓細(xì)胞可以用于隨后的全身/局部遞送，或者可以使用細(xì)胞分選技術(shù)(例如，F(xiàn)ACS或磁珠免疫選擇)，分離出特定的細(xì)胞群體。也可以在體外培養(yǎng)細(xì)胞，然后注射回患者，以促進(jìn)多種機(jī)制， 例如，通過用有絲分裂劑處理來增加細(xì)胞數(shù)目，用諸如VEGF等因子和他汀類藥物增強(qiáng)細(xì)胞功能，以增加存活、分化或生成血管能力。也可以遺傳地工程化細(xì)胞，以調(diào)節(jié)例如存活因子或促再生因子的基因表達(dá)。使用磁性細(xì)胞分選技術(shù)(例如，參見Losordo等人Circulation 2007 Jun 26 ；115(25) :3165-72)，基于對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的選擇，可以純化細(xì)胞。可以在體外制備細(xì)胞群集，諸如心臟球狀體(cardiospheres)(描述在，例如，Barile等人，Nature Clinical Practice，2007年2月，第4卷，增刊1)。根據(jù)本發(fā)明使用的其它細(xì)胞包括成血管細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于治療心臟病的方法，所述方法包括從患者提取骨髓細(xì)胞，在體外處理所述細(xì)胞，并使所述細(xì)胞返回患者，然后施用構(gòu)建體。使用靜脈內(nèi)施用，或者，例如，通過經(jīng)由導(dǎo)管的心肌內(nèi)施用或冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送，可以將細(xì)胞施用給患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在外科手術(shù)過程中，局部地施用細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體會(huì)將干細(xì)胞募集至靶組織，諸如肌肉。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體會(huì)將干細(xì)胞募集至心肌。在一個(gè)實(shí)施方案中，募集C-Kit+細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是可以產(chǎn)生成肌細(xì)胞或肌細(xì)胞的細(xì)胞，使得肌肉可以被修復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞可以產(chǎn)生血管細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)，其將修復(fù)受損的脈管系統(tǒng)，其本質(zhì)上會(huì)促進(jìn)肌肉的存活和從干細(xì)胞分化肌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞會(huì)修復(fù)心肌。具體地，本發(fā)明的分子所靶向的干細(xì)胞是可以分化成心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞可以產(chǎn)生成肌細(xì)胞或肌細(xì)胞，使得骨骼肌的損傷可以得到修復(fù)。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞是成年干細(xì)胞諸如造血干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。除了干細(xì)胞的分化成心血管細(xì)胞類型的作用以外，這些干細(xì)胞還具有以旁分泌方式起作用的能力，分泌出生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其它分子，它們可以作用于損傷部位，以促進(jìn)細(xì)胞存活、細(xì)胞修復(fù)、組織再生、血管生成和心肌再生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是造血干細(xì)胞。用于本發(fā)明中的干細(xì)胞可以源自患者自身(即自體的)，或者可以是同種異基因的(即源自別人)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述干細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞可以是任意哺乳動(dòng)物干細(xì)胞， 包括，例如，來自靈長(zhǎng)類動(dòng)物(諸如人)的干細(xì)胞，或來自嚙齒動(dòng)物、貓、豬、綿羊、狗、牛或馬的干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以遺傳地修飾干細(xì)胞，使得它們包括用于基因療法的轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種用于治療肌肉病或心臟病的方法，所述方法另外包括施用化合物來增強(qiáng)干細(xì)胞存活、分化或增殖。合適的化合物包括VEGF、FGF、他汀類藥物、SDF-I、CXCR4(描述在例如 Tan 等人，Cardiovascular Res.(于 2009 年 2 月 24 日公開的提前訪問版(Advance Access) ；doi :doi :10. 1093/cvr/cvp044))或 SDF-1 β P2G。這樣的化合物會(huì)提高這些細(xì)胞的促進(jìn)心臟再生的能力，并防止心肌損傷以后觀察到的長(zhǎng)期損傷，綜述參見，例如，Ballard 和 Edelberg，Circulation Research 2007,100(8) :1116_27。


圖1顯示了人和小鼠vMLCl-(6xHIS標(biāo)簽)的氨基酸和核酸序列。圖2顯示了人、小鼠、狗和食蟹猴c-Kit E⑶-hlgGl Fc融合體的氨基酸序列 (c-Kit E⑶(胞外結(jié)構(gòu)域)顯示為粗體)。圖3顯示了人和小鼠SCF_6xHIS標(biāo)簽的氨基酸。圖4顯示了抗-MLC抗體小鼠κ鏈(V κ基因顯示為粗體；⑶R序列標(biāo)有下劃線) 和抗-MLC抗體小鼠IgGl重鏈(Vh基因顯示為粗體；⑶R序列標(biāo)有下劃線)。圖5顯示了人源化的39_15mAb V基因(⑶R序列標(biāo)有下劃線)。圖6顯示了結(jié)合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖7顯示了從選擇的dAb的對(duì)應(yīng)氨基酸序列預(yù)測(cè)的⑶R序列。使用Kabat編號(hào)， CDR 測(cè)定如下(VH-CDR1 (30-35)、VH-CDR2 (50-56)、VH-CDR3 (94-102)、VK-CDRl (26-34)、 VK-CDR2(49-56)、VK-CDR3(89-97)。圖8顯示了非競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合人c-Kit的dAb的BIAcore結(jié)合跡線。在固定化在抗生蛋白鏈菌素芯片上的生物素化的人c-Kit (His-標(biāo)記的)上，評(píng)估dAb結(jié)合。跡線允許視覺地對(duì)比dAb的相對(duì)解離速率和結(jié)合速率，使用動(dòng)力學(xué)模型來擬合曲線，允許計(jì)算dAb的親和常數(shù)。圖9和10顯示了競(jìng)爭(zhēng)性受體結(jié)合試驗(yàn)(RBA)的結(jié)果。在該試驗(yàn)中，評(píng)估dAb，以確定它們是否可以抑制人c-Kit和人干細(xì)胞因子(SCF)之間的相互作用。與SCF競(jìng)爭(zhēng)的那些dAb會(huì)抑制相互作用，隨著dAb濃度增加而減小信號(hào)，而與SCF不競(jìng)爭(zhēng)的那些dAb沒有影響，因此隨著dAb濃度增加，信號(hào)保持恒定。圖Ila和lib顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)的非競(jìng)爭(zhēng)性的dAb與KU812細(xì)胞的結(jié)合。該試驗(yàn)測(cè)定dAb是否可以特異性地結(jié)合在細(xì)胞表面上展示的c-Kit，其中觀察與KU812 細(xì)胞系的結(jié)合，所述KU812細(xì)胞系已經(jīng)被證實(shí)是c-Kit+ve的。在圖Ila中顯示了 2點(diǎn)曲線 (2pt curve) (100_500nM)，在圖 lib 中顯示了 2 點(diǎn)曲線(80_400nM)。圖1 和12b顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)的非競(jìng)爭(zhēng)性的dAb與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合。該試驗(yàn)測(cè)定dAb是否可以特異性地或非特異性地結(jié)合細(xì)胞，其中觀察與Jurkat細(xì)胞系的結(jié)合，所述Jurkat細(xì)胞系已經(jīng)被證實(shí)是c-Kit-ve的。在圖12a中顯示了 2點(diǎn)曲線 (100-500nM)，在圖 12b 中顯示了 2 點(diǎn)曲線(80_400nM)。圖13顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)的競(jìng)爭(zhēng)性的dAb與KU812的結(jié)合。該試驗(yàn)測(cè)定 dAb是否可以特異性地結(jié)合在細(xì)胞表面上展示的c-Kit，其中觀察與KU812細(xì)胞系的結(jié)合， 所述KU812細(xì)胞系已經(jīng)被證實(shí)是c-Kit+ve的。顯示了 3點(diǎn)曲線^)0nM-2uM_10uM)。圖14顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)的競(jìng)爭(zhēng)性的dAb與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合。該試驗(yàn)測(cè)定dAb是否可以特異性地或非特異性地結(jié)合細(xì)胞，其中觀察與Jurkat細(xì)胞系的結(jié)合，所述Jurkat細(xì)胞系已經(jīng)被證實(shí)是c-Kit-ve的。顯示了 3點(diǎn)曲線G00nM-2uM_10uM)。圖15顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)的dAb集合與c-Kit+ve門控的小鼠骨髓細(xì)胞的結(jié)合。該試驗(yàn)測(cè)定dAb是否可以結(jié)合鼠骨髓細(xì)胞，所述鼠骨髓細(xì)胞已經(jīng)在是cKIT+ve的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩分。顯示了 2點(diǎn)曲線(5uM-10uM)。圖16顯示了結(jié)合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖17顯示了結(jié)合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖18顯示了在細(xì)胞中有活性且與mAbdAb相容的13種dAb的BIAcore結(jié)果。圖19顯示了通過序列-結(jié)構(gòu)對(duì)比得出的表位作圖。圖20顯示了結(jié)合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖21顯示的示意解了不同的抗體形式。圖22顯示的示意解了 mAbdAb重鏈(上圖)或mAbdAb輕鏈(下圖)的構(gòu)建。圖23顯示了在實(shí)施例5中所述的mAb-dAb的示意圖。圖M顯示的示意解了假的mAb-cKIT dAb mAb-dAb的克隆。圖25顯示了在實(shí)施例5中所述的構(gòu)建體的核酸和氨基酸序列。圖沈顯示了 c-Kit dAb的表位分析。圖27顯示了典型的BIAcore表位作圖實(shí)驗(yàn)的BIAcore實(shí)施例，其中商業(yè)抗體2B8 禾口 4552(D0iC8m-107，在假的框架Mab中)的表位沒有重疊。圖28顯示了典型的BIAcore表位作圖實(shí)驗(yàn)的BIAcore實(shí)施例，其中假的框架Mab 4505 (D0M28m-7)和 4503 (D0iC8h_94)的表位部分地重疊。圖四顯示了在10%小鼠血清中的雙特異性的mAb-dAb、對(duì)照分子和D0iC8h_94親和力成熟的克隆的對(duì)比。圖30例證了細(xì)胞表面染色、細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)染色以及細(xì)胞內(nèi)染色模式。圖31顯示了在本文中鑒別出的序列表的列表。
具體實(shí)施例方式在本說明書中已經(jīng)參照實(shí)施方案描述了本發(fā)明，描述方式使得本說明書能夠既清楚又簡(jiǎn)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的情況下，可以對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行各種組合或分開。除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語都具有本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué))普通技術(shù)人員公知的相同含義。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、遺傳和生化方法(一般參見Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第 4 版，John ffiley&Sons, Inc.，所述文獻(xiàn)通過引用并入本文)和化學(xué)方法。命名法和縮寫本文使用的命名法和縮寫包括單克隆抗體(MAb，mAb)；單克隆抗體(mAbs)；結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)；結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)；重鏈(H鏈)；輕鏈(L鏈)；重鏈可變區(qū) (Vh)；輕鏈可變區(qū)(Vl) ； κ輕鏈可變區(qū)(Vk) ;A IgGl重鏈恒定區(qū)I(CHl)；人IgGl重鏈恒定區(qū)2(CH2)；人IgGl重鏈恒定區(qū)3 (CH3)；輕鏈/κ輕鏈恒定區(qū)(CL/CK)；和互補(bǔ)性決定區(qū) (CDR)；重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRH)；輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRL)；互補(bǔ)性決定區(qū)的區(qū)域 1、2、3(CDR1、CDR2、CDR3)。靶組織和組織特異性的標(biāo)志物分子合適的靶組織包括肌肉組織，包括心肌和骨骼肌、上皮組織、皮膚、結(jié)締組織、肝組織、神經(jīng)元組織、心臟或心臟組織和關(guān)節(jié)組織。每種這樣的組織的組織特異性的標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織特異性的標(biāo)志物包括炎癥標(biāo)志物，瘢痕組織的組分，或?qū)M織特異性的標(biāo)志物，所述組織諸如肌肉組織(包括心肌)上皮組織、皮膚、結(jié)締組織、肝組織、神經(jīng)元組織、心臟組織和關(guān)節(jié)組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于使干細(xì)胞靶向心臟組織的組合物和方法，所述心臟組織包括心肌組織、成纖維細(xì)胞、冠狀脈管系統(tǒng)、和在間質(zhì)間隙或基膜中的蛋白。肌肉特異性的標(biāo)志物分子肌球蛋白肌球蛋白是一個(gè)大動(dòng)力蛋白家族，它們存在于肌肉肌節(jié)中，且負(fù)責(zé)基于肌動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)性。肌球蛋白分子在三維結(jié)構(gòu)中由互連的重鏈和輕鏈組成。已經(jīng)描述了肌細(xì)胞中的輕鏈分子的細(xì)胞溶質(zhì)前體庫(kù)，且認(rèn)為它們?cè)诶缧募p傷以后泄漏進(jìn)循環(huán)中(描述在，例如US 5，702，905)。在肌肉中，肌球蛋白分子中的肌球蛋白輕鏈(MLC)成對(duì)出現(xiàn)。心臟和骨骼MLC在免疫學(xué)上是不同的。心臟MLC存在于心肌和心肌梗塞中(描述在，例如，Lyn等人Wiysiol. Genomics 2000 ；2 :93-100 ；Mair 等人 Clin Chim Acta 1994 ；229 :153-159 和 Khaw 等人 J Clin. Invest. 1976 ；58 :439-446)。當(dāng)組織膜在心肌梗塞中受損時(shí)，它們變得可被抗-MLC 抗體接近。肌球蛋白輕鏈包括MLC-I、MLC-2、MYL、MYL-2/3、人心室肌球蛋白輕鏈(vMLC)、 vMLC-l(Uniftx)tKB/Swiss-Prot 入口 P08590)。US 5，702，905 描述了人心室肌球蛋白輕鏈的小鼠單克隆抗體，其具有對(duì)肌球蛋白輕鏈的心臟同種型的高親和力。在心肌、骨骼肌、 血管平滑肌、臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，以及在腎、結(jié)腸、輸卵管、直腸、精囊、前列腺、皮膚、腸內(nèi)皮、胰腺、脂肪組織、視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和膀胱上皮的肌肉組織中，表達(dá)vMLC(也稱作MLC-I， MLC-3)。參見，例如，Bicer 和 Reiser, J Muscle Res Cell Motil. 2004 ；25 (8) :623_33。本文使用的“MLC”也包括MLC的一部分或片段。MLC包括天然存在的或內(nèi)源的哺乳動(dòng)物MLC蛋白，以及其氨基酸序列與天然存在的或內(nèi)源的對(duì)應(yīng)哺乳動(dòng)物MLC蛋白相同的蛋白(例如，重組蛋白、合成蛋白(即，使用合成有機(jī)化學(xué)方法生產(chǎn)))。因此，如本文定義的，該術(shù)語包括成熟的MLC蛋白、多形變體或等位變體、MLC的其它同種型以及前述物質(zhì)的修飾的或未修飾的形式(例如，脂質(zhì)化、糖基化)。
干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子包括在干細(xì)胞上表達(dá)的那些分子。這樣的分子包括⑶30、巢蛋白、Stro-1、PSA-NCam、p75、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、⑶；34、 Sca-UABCG2,CD133 和 c_Kit。c_Kit (也稱作 CDl 17 和 SCFR(干細(xì)胞因子受體)；人 c-Kit 描述在UniProtKB/Swiss-Prot記錄P10721))是細(xì)胞和膜結(jié)合的酪氨酸激酶受體。干細(xì)胞因子(SCF)是通過結(jié)合c-Kit來發(fā)信號(hào)的糖蛋白，該信號(hào)傳遞途徑在血細(xì)胞生成中起關(guān)鍵作用，作為正調(diào)節(jié)物負(fù)調(diào)節(jié)物起作用，經(jīng)常與其它細(xì)胞因子協(xié)同地起作用?？扇苄缘拿撀涞?c-Kit受體可以在調(diào)節(jié)SCF中起作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子的藥劑可以是受體結(jié)合蛋白或生長(zhǎng)因子諸如SCF。c_Kit(也稱作c-Kit、cKIT、c_Kit、ckit、cKit)在多能造血干細(xì)胞上表達(dá)，所述多能造血干細(xì)胞是屬于淋巴譜系和紅細(xì)胞譜系的成熟細(xì)胞的前體。c-Kit在來自骨髓的干細(xì)胞和祖細(xì)胞上以及在心臟干細(xì)胞上的表達(dá)，以及這些細(xì)胞在心肌修復(fù)中的作用，描述在例如，F(xiàn)azel 等人 Journal of Clinical Investigation，116 (2006)，7，1865-1876。c-Kit M 一種早期干細(xì)胞標(biāo)志物，其存在于大部分干細(xì)胞群體上，由大約的循環(huán)白血細(xì)胞表達(dá)。 已經(jīng)證實(shí)，表達(dá)c-Kit的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生心肌細(xì)胞和血管細(xì)胞類型。另外，c-Kit在動(dòng)物模型中的缺失會(huì)導(dǎo)致心肌梗塞后心臟修復(fù)的損害，提示這些細(xì)胞在心血管再生中起關(guān)鍵作用。 c-Kit+細(xì)胞存在于骨髓中，并隨后在損傷或施用動(dòng)員劑以后，運(yùn)動(dòng)至血流中(綜述參見，例如，Bearzi 等人 PNAS (2007) 104 ；35 ；14068-14073)。本文使用的“c-Kit”也包括c-Kit的一部分或片段。c-Kit包括天然存在的或內(nèi)源的哺乳動(dòng)物c-Kit蛋白，以及其氨基酸序列與天然存在的或內(nèi)源的對(duì)應(yīng)哺乳動(dòng)物c-Kit 蛋白相同的蛋白(例如，重組蛋白、合成蛋白(即，使用合成有機(jī)化學(xué)方法生產(chǎn)))。因此，如本文定義的，該術(shù)語包括成熟的c-Kit蛋白、多形變體或等位變體、c-Kit的其它同種型以及前述物質(zhì)的修飾的或未修飾的形式(例如，脂質(zhì)化、糖基化)。使用的哺乳動(dòng)物c-Kit包括大鼠 c-Kit (也稱作 rc-Kit、rcKIT、re-Kit)和小鼠 / 鼠 c_Kit(也稱作 mcKIT、mc-Kit、 mc-Kit)ο免疫球蛋白本文使用的“免疫球蛋白”表示這樣的多肽家族其保留抗體分子的免疫球蛋白折疊特征，含有兩個(gè)β折疊，通常還含有保守的二硫鍵。結(jié)構(gòu)域本文使用的“結(jié)構(gòu)域”表示這樣的折疊的蛋白結(jié)構(gòu)它保留了獨(dú)立于蛋白的其余部分的三級(jí)結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的離散的功能性質(zhì)，并且在許多情況下可以添加、去除或轉(zhuǎn)移給其它蛋白，而不喪失該蛋白和/或該結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能。免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域短語“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”或單個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域表示這樣的抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH、VHH、^或結(jié)合域其獨(dú)立于不同的或其它的V區(qū)或結(jié)構(gòu)域而特異性地結(jié)合抗原或表位。這樣的“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”是折疊的多肽結(jié)構(gòu)域，其包含抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列。因此，它包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié)構(gòu)域(例如，其中一個(gè)或更多個(gè)環(huán)已經(jīng)被不是抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列所置換)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及至少部分保留全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域可以以含有其它可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域的形式(例如，同源多聚體或異源多聚體)存在，其中其它區(qū)域或結(jié)構(gòu)域不是單個(gè)免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合所必需的(即其中免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域與抗原的結(jié)合獨(dú)立于另外的可變結(jié)構(gòu)域)。“結(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”與本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”同義?！皢蝹€(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域”或“抗體單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”與本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”同義。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但是也包括來自其它物種的單個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域，諸如嚙齒動(dòng)物(例如，如在WO 00/29004中所公開的，其內(nèi)容通過引用整體并入本文)、鉸口鯊和駱駝科(Camelid) Vhh dAb。駱駝科Vra是這樣的免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域多肽其源自包括駱駝、美洲駝羊、羊駝、單峰駱駝和原駝在內(nèi)的物種，且生產(chǎn)天然地缺少輕鏈的重鏈抗體。 所述Vhh可以是人源化的。在本發(fā)明的所有方面，所述或每個(gè)免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自抗體重鏈和輕鏈單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，例如VH、Vl和V,抗體本文使用的“抗體”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、 F (ab’)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構(gòu)象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、 diabody)，無論是源自天然地產(chǎn)生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術(shù)制備；無論分離自例如下列哪種樣品血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌。抗體形式在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以任意抗體形式提供根據(jù)本發(fā)明的抗體、免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體。本文使用的“抗體形式”表示任意合適的多肽結(jié)構(gòu)，其中可以摻入一個(gè)或更多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域，從而賦予該結(jié)構(gòu)對(duì)抗原的結(jié)合特異性。多種合適的抗體形式是本領(lǐng)域已知的，例如，嵌合的抗體、人源化的抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性的抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同源二聚體和異源二聚體、任意前述物質(zhì)的抗原-結(jié)合片段(例如，F(xiàn)v片段(例如，單鏈Fv(SCFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab 片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、單個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如，dAb、VH、Vffin Vj和任意前述物質(zhì)的修飾形式(例如，通過共價(jià)連接聚乙二醇或其它合適的聚合物或人源化的Vhh進(jìn)行修飾)。在一個(gè)實(shí)施方案中，替代性的抗體形式包括替代性的支架，其中根據(jù)本發(fā)明的任意分子的⑶R可以被移植到合適的蛋白支架或骨架上，諸如親和體(affibody)、SpA支架、LDL 受體A類結(jié)構(gòu)域、avimer (參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2005/0053973、2005/0089932、 2005/0164301)或EGF結(jié)構(gòu)域。此外，所述配體可以是本文所述的二價(jià)的(異二價(jià)的)或多價(jià)(異多價(jià)的)。在其它實(shí)施方案中，可以使用“通用框架”，其中“通用框架”表示這樣的單個(gè)抗體框架序列其與 Kabat ( “Sequences of Proteins of Immunological Interest，，， 美國(guó)衛(wèi)生和人類服務(wù)部)所定義的序列中保守的抗體區(qū)域相對(duì)應(yīng)，或與Chothia和Lesk， (1987) J. Mol. Biol. 196 :910-917所定義的人種系免疫球蛋白所有組分或結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明提供了單個(gè)框架或一組這樣的框架的應(yīng)用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過僅高變區(qū)中的變化，允許衍生出基本上任意的結(jié)合特異性。如果需要的話，“抗體”可以另外包含一個(gè)或更多個(gè)額外的部分，所述部分可以各自獨(dú)立地是肽、多肽或蛋白部分或非肽部分(例如，聚亞烷基二醇、脂質(zhì)、碳水化合物)。例如，所述配體可以另外包含半衰期延長(zhǎng)部分(例如，聚亞烷基二醇部分，包含白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的部分，包含轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白片段或轉(zhuǎn)鐵蛋白變體的部分，結(jié)合白蛋白的部分，結(jié)合新生的Fc受體的部分)。合適的半衰期延長(zhǎng)部分描述在， 例如，W02008096158。另一個(gè)方案是，包括額外的結(jié)合部分，諸如結(jié)合肽、多肽或蛋白部分(諸如血清白蛋白)的抗體或免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其描述在，例如EP1517921、 W003002609、W004003019、W02008096158、W004058821 和 W02007080392。合適的結(jié)合血清白蛋白的路馬它科VHH包括在WO 2004041862 (Ablynx N. V.)和W02007080392中公開的那些。提及免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽、配體、融合蛋白等時(shí)，“抗-MLC”或 “抗-c-Kit”是指識(shí)別和結(jié)合MLC或c-Kit的部分。具體地，“抗-MLC”包括結(jié)合任意MLC 變體(包括vMLC-1等)的部分。表位“表位”是被免疫球蛋白VH/\對(duì)常規(guī)地結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元。表位限定了抗體的最小結(jié)合位點(diǎn)，因此代表抗體特異性的靶標(biāo)。在單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體的情況下，表位代表與分離的可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元。表位結(jié)合域術(shù)語“表位-結(jié)合域”表示這樣的結(jié)構(gòu)域其獨(dú)立于不同的V區(qū)或結(jié)構(gòu)域而特異性地結(jié)合抗原或表位，這可以是結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)，例如人、駱駝科或鯊魚免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，或它可以是作為選自下述的支架的衍生物的結(jié)構(gòu)域 CTLA-4(Evibody)；脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；蛋白A衍生出的分子諸如蛋白A的Z-結(jié)構(gòu)域(親和體、SpA)、A-結(jié)構(gòu)域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白諸如GroEl和GroES ；轉(zhuǎn)鐵蛋白 (trans-body)；錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結(jié)構(gòu)域(四連接素)；人 Y -晶體蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ結(jié)構(gòu)域；人蛋白酶抑制劑的全蝎toxinkunitz型結(jié)構(gòu)域；和纖連蛋白(adnectin)；其已經(jīng)進(jìn)行蛋白工程化，以便實(shí)現(xiàn)與除了天然配體以外的配體的結(jié)合。結(jié)合用解離常數(shù)(Kd)來指示結(jié)合。通過合適的試驗(yàn)，可以測(cè)定抗原-結(jié)合蛋白與抗原或表位的特異性結(jié)合，所述試驗(yàn)包括，例如，Scatchard分析和/或競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)， 諸如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶免疫測(cè)定諸如ELISA和夾心競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定和它們的不同變體。結(jié)合親和力任選地，使用表面等離子體共振(SPR)和Biacore (Karlsson等人， 1991)，使用Biacore系統(tǒng)(Uppsala，Sweden)，測(cè)定結(jié)合親和力。Biacorc系統(tǒng)使用表面等離子體共振(SPR, Welford K. 1991，Opt. Quant. Elect. 23 :1 ；Morton 禾口 Myszka，1998，Methods in Enzymology四5 J68)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物分子相互作用，并使用表面等離子體共振來檢測(cè)在玻璃支持物上的薄金膜的表面處的光共振角的變化(由離開最多300nm的表面的折光指數(shù)的變化引起)。Biacore分析會(huì)方便地產(chǎn)生結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)、平衡解離常數(shù)和親和常數(shù)。通過使用Biacore表面等離子體共振系統(tǒng)(Biacore，Inc.)來評(píng)估結(jié)合和解離速率常數(shù)，得到結(jié)合親和力。根據(jù)生產(chǎn)商的(Biacore)說明書，活化生物傳感器芯片，用于共價(jià)偶聯(lián)靶物。然后稀釋靶物，并注射到芯片上，以得到固定化的物質(zhì)的響應(yīng)單位中的信號(hào)。由于共振單位(RU)中的信號(hào)與固定化的物質(zhì)的質(zhì)量成比例，這代表基質(zhì)上的固定化的靶物密度范圍。將解離數(shù)據(jù)擬合至單位點(diǎn)模型，得到k。ff+/-S. d.(測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差)。計(jì)算每條結(jié)合曲線的假一階速率常數(shù)(Kd’s)，并繪制為蛋白濃度的函數(shù)，以得到k。n+/-s. e.(擬合的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。從sra測(cè)量結(jié)果計(jì)算結(jié)合的平衡解離常數(shù)，Kd' S = k0ff/k0nOCDR 本文所述的抗原結(jié)合蛋白、抗體和免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(dAbs)含有互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR1、CDR2 和 CDR3)。Kabat 等人(Kabat，E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國(guó)衛(wèi)生和人類服務(wù)部，美國(guó)政府印刷局(1991))已經(jīng)定義了 CDR區(qū)和框架(FR)區(qū)的位置和編號(hào)系統(tǒng)?；诒娝苤腒abat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)和CDR的定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地明白本文公開的Vh(CDRH1等)和VJCDRL1等) (VJdAb的⑶R(⑶Rl、⑶R2、⑶R3)的氨基酸序列。根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)，即最常用的基于序列差異性的方法，重鏈CDR-H3具有變化的長(zhǎng)度，用字母編號(hào)在殘基HlOO和HlOl之間的插入物，直到K (即H100，H100A…H100K，H101)?；蛘?，可以使用Chothia系統(tǒng)(基于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域白勺位置)(Chothia等人，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ；Nature 342, p877_883)，測(cè)定 CDR，根據(jù) AbM(在 Kabat 和 Chothia 之間的折中)， 或根據(jù)如下的Contact方法(基于晶體結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)與抗原的接觸殘基)。關(guān)于適用于測(cè)定 CDR 的方法,參見 http //www. bioinf. org. uk/abs八已經(jīng)將一個(gè)殘基編號(hào)以后，然后可以應(yīng)用下述的⑶R定義Kabat CDR Hl :31_35/35A/35BCDR H2 :50-65CDR H3 :95-102CDR Ll :24-34CDR L2 :50-56CDR L3 :89-97Chothia CDR Hl 26—32CDR H2 52-56CDR H3 :95-102CDR Ll 24—34CDR L2 50-56CDR L3 89—97AbM (使用Kabat編號(hào))(使用Chothia編號(hào))CDR Hl :26_33/33A/33B 26-33CDR H2 :50-58-CDR H3 :95-102-CDR Ll :24-34-CDR L2 :50-56-CDR L3 :89-97-Contact(使用Kabat編號(hào))(使用Chothia編號(hào))CDR Hl :30_35/35A/35B 30-35CDR H2 :47-58-CDR H3 :93-101-CDR Ll :30-36-CDR L2 :46-55-CDR L3 :89-96-(“- “是指與Kabat相同的編號(hào))競(jìng)爭(zhēng)本文提到的術(shù)語“競(jìng)爭(zhēng)”是指，在有對(duì)同源靶物特異性的第二結(jié)合域(例如， 免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域)存在下，第一靶物(例如，c-Kit)與它的所述同源靶物結(jié)合域(例如，免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合受到抑制。例如，可以空間地抑制結(jié)合，例如，通過物理地阻斷結(jié)合域，或通過改變結(jié)構(gòu)或結(jié)合域的環(huán)境，使得它對(duì)靶物的的親和力或親合力減小。關(guān)于如何進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA和競(jìng)爭(zhēng)BIACore實(shí)驗(yàn)來測(cè)定第一結(jié)合域和第二結(jié)合域之間的競(jìng)爭(zhēng)的細(xì)節(jié)，參見W02006038027，它的細(xì)節(jié)通過引用并入本文，以提供用于本發(fā)明中的明確公開內(nèi)容。使dAb連接至IgG:用于本發(fā)明中的結(jié)構(gòu)域抗體可以連接在常規(guī)IgG的重鏈和/或輕鏈的C-端末端。另外，有些dAb可以連接至常規(guī)抗體的重鏈和輕鏈的C-端末端。在將dAb的N-端與抗體恒定結(jié)構(gòu)域((^或仏)融合的構(gòu)建體中，肽連接物可以幫助dAb結(jié)合抗原。實(shí)際上，dAb的N-端末端的位置緊密靠近參與抗原-結(jié)合活性的互補(bǔ)性-決定區(qū)(CDR)。因而，短的肽連接物會(huì)起蛋白支架的表位-結(jié)合域和恒定結(jié)構(gòu)域之間的隔離物的作用，這可以允許dAb CDR更容易地到達(dá)抗原，其因此可以以高親和力進(jìn)行結(jié)合。使dAb連接至IgG上的環(huán)境隨它們所融合的抗體鏈而異當(dāng)融合在IgG支架的抗體輕鏈的C-端末端處時(shí)，預(yù)期每個(gè)dAb位于抗體鉸鏈和Fc 部分附近。這樣的dAb的位置可能彼此遠(yuǎn)離。在常規(guī)抗體中，F(xiàn)ab片段之間的角度以及每個(gè)Fab片段和Fc部分之間的角度可以存在非常顯著的差異。對(duì)于mAbdAb，F(xiàn)ab片段之間的角度可能不存在很大差異，同時(shí)關(guān)于每個(gè)Fab片段和Fc部分之間的角度，也可以觀察到一些角度限制。當(dāng)融合在IgG支架的抗體重鏈的C-端末端處時(shí)，預(yù)期每個(gè)dAb位于Fc部分的CH3 結(jié)構(gòu)域附近。預(yù)期這不會(huì)影響Fc對(duì)Fc受體(例如Fc y RI,II> III, FcRn)的結(jié)合性質(zhì)，因?yàn)檫@些受體會(huì)與Ch2結(jié)構(gòu)域(對(duì)于Fc γ RI、II和III類受體)嚙合，或與CH2和CH3結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈(例如Fcfoi受體)嚙合。這樣的抗原-結(jié)合構(gòu)建體的另一個(gè)特征是，預(yù)期兩種 dAb在空間上彼此靠近，條件是，通過提供適當(dāng)?shù)倪B接物來提供柔性，這些dAb甚至可以形成同型二聚體物質(zhì)，因此產(chǎn)生Fc部分的‘拉鏈樣’四級(jí)結(jié)構(gòu)，這可以增強(qiáng)構(gòu)建體的穩(wěn)定性。這樣的結(jié)構(gòu)考慮可以輔助選擇最合適的位置，以將表位-結(jié)合域(例如dAb)連接到蛋白支架(例如抗體)上。連接物通過使用連接物，可以將本發(fā)明的蛋白支架連接到表位-結(jié)合域上。合適的連接物的實(shí)例包括長(zhǎng)度在下述范圍內(nèi)的氨基酸序列1個(gè)氨基酸至150個(gè)氨基酸，或1個(gè)氨基酸至140個(gè)氨基酸，例如，1個(gè)氨基酸至130個(gè)氨基酸，或1-120個(gè)氨基酸，或1_80個(gè)氨基酸，或1-50個(gè)氨基酸，或1-20個(gè)氨基酸，或1-10個(gè)氨基酸，或5-18個(gè)氨基酸。這樣的序列可以具有它們自己的三級(jí)結(jié)構(gòu)，例如，本發(fā)明的連接物可以包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接物的大小等于單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。合適的連接物的大小可以是1-20埃，例如小于15埃、或小于10埃、或小于5埃。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)表位結(jié)合域通過連接物直接連接至Ig支架上，所述連接物包含1-150個(gè)氨基酸，例如1-20個(gè)氨基酸，例如1-10個(gè)氨基酸。這樣的連接物可以選自SEQ ID NO :3-8所述的那些中的任一個(gè)，例如所述連接物可以是‘TVAAPS’，或者所述連接物可以是‘GGGGS’或多個(gè)這樣的連接物。在本發(fā)明的抗原-結(jié)合蛋白中使用的連接物可以包含單獨(dú)的或與其它連接物組合的一個(gè)或更多個(gè) GS 殘基集合，例如 iGSTVAAPS' (SEQ ID NO :102)或 ‘TVAAPSGS，(SEQ ID NO :103)或 ‘GSTVAAPSGS，(SEQ ID NO 104)或多個(gè)這樣的連接物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘ (PAQn(GS)m'連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘ (GGGGS)n(GQm’連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘ (TVAAPS) n (GS) m’連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘ (GS) ffl (TVAAPSGS) n’連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘ (GS)m(TVAAPQp(GS)m，連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘(PAVPPP)n(GQm’連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘(TVSDVP) n (GS) m’連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘(TGLDSP)n(GS)n/連接至Ig支架上。在所有這樣的實(shí)施方案中，η = l_10，m = 0-4, 且ρ = 2-10。
這樣的連接物的實(shí)例包括= (PAS)n(GS)m，其中η = 1，且m= 1，(PAS)n(GS)m，其中η =2，且111= 1，(PAS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m= 1，(PAS)n(GS) m，其中 η = 4，且 m = 1，(PAS) n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(PAS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0，(PAS)n(GS)m，其中 η = 4， 且 m = 0。
這樣的連接物的實(shí)例包括(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 1，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m, 其中 η = 2，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 4，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0，(GGGGS) n(GS)m，其中η = 4，且m = 0。這樣的連接物的實(shí)例包括(GS)m(TVAAPS)p，其中ρ = 1，且 m = 1, (GS)m(TVAAPS)p，其中 ρ = 2，且 m = 1，(GS)m(TVAAPS)p，其中 ρ = 3，且 m = 1，(GS) m(TVAAPS)p，其中 ρ = 4，且 m= 1)，(GS)m (TVAAPS)p，其中 ρ = 5，且 m= 1，或(GS)m(TVAAPS) ρ,其中 P = 6，且 m = 1。
這樣的連接物的實(shí)例包括(TVAAPQn (GQm，其中η = 1，且m = 1，(TVAAPS)n(GS) m，其中 η = 2，且 m = 1，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 1，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 4，且 m = 1，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0， (TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 4，且m = 0。
這樣的連接物的實(shí)例包括(GS)m(TVAAPSGS)n,其中η = 1，且m = 1，(GS) m (TVAAPSGS)n,其中 n = 2，且 m=l，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n = 3，且 m=l，或(GS) m (TVAAPSGS)n,其中 n = 4，且 m=l，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n = 5，且 m=l，(GS) m (TVAAPSGS)n,其中 n = 6，且 m=l，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n=l，且 m = 0，(GS) m (TVAAPSGS) n，其中 η = 2，且 m = 10，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n = 3，且 m = 0，或(GS) m(TVAAPSGS)n，其中 η = 0。
這樣的連接物的實(shí)例包括(TVAAPSGS)p(GS)m，其中ρ = 2，且m = 1，(TVAAPSGS) ρ(Gs)m，其中 ρ = 3，且 m = 1，(Tvaapsgs)p(GS)m，其中 ρ = 4，且 m = 1，(Tvaapsgs)p(GS)m, 其中 P = 2，且 m = 0，(TVAAPSGS)p(GS)m，其中 P = 3，且 m = 0，(TVAAPSGS)p (GS)m，其中 ρ = 4，且 m = 0。
這樣的連接物的實(shí)例包括(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 1，且 m = 1，(PAVPPP)n(GS) m，其中 η = 2，且 m = 1(SEQ ID NO :65)，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 1，(PAVPPP) n(GS)m，其中 n = 4，且 m= 1，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 4，且 m = 0。
這樣的連接物的實(shí)例包括(TVSDVP)n(GQm，其中η = 1，且m= 1(SEQ ID NO :67)，26(TVSDVP) n (GS) m，其中 η = 2，且 m=l，(TVSDVP) n (GS) m，其中 n = 3，且 m=l，(TVSDVP) n (GS) m，其中 η = 4，且 m = 1，(TVSDVP)n(GQm，其中 η = 2，且 m = 0，(TVSDVP)n(GQm，其中 η = 3，且 m = 0，(TVSDVP)n(GQm，其中 η = 4，且 m = 0。
這樣的連接物的實(shí)例包括(TGLDSP)n (GQm，其中η = 1，且m = 1，(TGLDSP)n(GS) m，其中 η = 2，且 m = 1，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 3，且 m = 1，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 4，且 m = 1，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 2，且 m = 0，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 3，且 m = 0， (TGLDSP)n(GS)m，其中 η = 4，且m = 0。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在表位結(jié)合域和Ig支架之間沒有連接物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘TVAAPS’ (SEQ ID NO 89)連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘TVAAPSGS’ (SEQ ID NO 103)連接至Ig支架上。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘GS’ (SEQ ID NO :10 連接至Ig支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位結(jié)合域通過連接物‘ASTKGPT’ (SEQ ID NO 91)連接至 Ig支架上。
同源性與本文公開的序列具有相似性或同源性(例如，至少約70%序列同一性)的序列也是本發(fā)明的一部分。在有些實(shí)施方案中，在氨基酸水平的序列同一性可以是約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在核酸水平，序列同一性可以是約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94^^95%,96^^97%,98^^99%或更高?；蛘撸?dāng)核酸區(qū)段在所選雜交條件(例如極高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件)下與鏈的互補(bǔ)體雜交時(shí)，存在相當(dāng)大的同一性。核酸可以存在于完整細(xì)胞中，存在于細(xì)胞裂解物中，或者呈部分純化或基本上純的形式。
本文所用的術(shù)語“低嚴(yán)謹(jǐn)性”、“中等嚴(yán)謹(jǐn)性”、“高嚴(yán)謹(jǐn)性”或“極高嚴(yán)謹(jǐn)性”條件描述了核酸雜交和洗滌的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指南，可以參見Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6，所述文獻(xiàn)通過引用全部并入本文。該參考文獻(xiàn)中描述了含水方法和無水方法，都可以采用。本文提及的具體雜交條件如下(1)低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45°C，再在0.2X SSC、0. 1%SDS中在至少50°C (對(duì)于低嚴(yán)謹(jǐn)性條件，洗滌溫度可升高至55°C)洗滌兩次；(2) 中等嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件在6X SSC中在約45°C，再在0. 2X SSC、0. 1 % SDS中在60V洗滌一次或更多次；(3)高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件在6X SSC中在約45°C，再在0. 2X SSC、0. SDS中在65°C洗滌一次或更多次；和優(yōu)選地，(4)極高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件是0. 5M磷酸鈉、7% SDS在 650C，再在0. 2X SSC、1 % SDS中在65°C洗滌一次或更多次。
如下進(jìn)行兩個(gè)序列之間的“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(這些術(shù)語在本文可互換使用)的計(jì)算。為了最佳比較目的，比對(duì)序列(例如對(duì)于最佳比對(duì)，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)中引入缺口，為了比較目的，非同源序列可以忽略不計(jì))。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了比較目的所比對(duì)的參照序列的長(zhǎng)度是參照序列長(zhǎng)度的至少約30%、任選至少約40%、任選至少約50%、任選至少約60%和任選至少約70%、80%、 90%或100%。然后，比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械哪硞€(gè)位置被與第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，那么分子在該位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。兩個(gè)序列之間的同一性百分比隨考慮缺口數(shù)和各缺口長(zhǎng)度后的序列共享的相同位置數(shù)而變化，需要弓I入這些缺口以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。
使用采用默認(rèn)參數(shù)的算法BLAST 2Sequences (Tatusova，Τ. Α.等人，F(xiàn)EMS Microbiol Lett, 174 :187-188 (1999)，可以任選地準(zhǔn)備和測(cè)定氨基酸和核苷酸序列比對(duì)以及如本文定義的同源性、相似性或同一性?；蛘撸捎肂LAST算法版)進(jìn)行序列比對(duì)，參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值。BLAST(基本局部比對(duì)檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool))是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的探索式檢索算法；這些程序都采用 Karlin 和 Altschul，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6) :2264-8 的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法給它們的發(fā)現(xiàn)結(jié)果確定顯著性。
核酸分子、載體、宿主細(xì)胞和構(gòu)建體的蛋白表達(dá)本發(fā)明也提供了分離的和/或重組的核酸分子，其編碼本文所述的配體(單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、融合蛋白、多肽、雙特異性的配體和多特異性的配體)。
本發(fā)明也提供了一種載體，其包含本發(fā)明的重組核酸分子。在某些實(shí)施方案中，所述載體是含有一個(gè)或更多個(gè)與本發(fā)明的重組核酸可操作地連接的表達(dá)控制元件或序列的表達(dá)載體。本發(fā)明也提供了一種重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的重組核酸分子或載體。合適的載體(例如質(zhì)粒、噬粒)、表達(dá)控制元件、宿主細(xì)胞和生產(chǎn)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞的方法，是本領(lǐng)域眾所周知的。
通過用包含本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，可以生產(chǎn)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體。通過將抗原結(jié)合構(gòu)建體的這些編碼序列置于與常規(guī)的調(diào)節(jié)控制序列的可操作關(guān)聯(lián)下，生產(chǎn)表達(dá)載體或重組質(zhì)粒，所述調(diào)節(jié)控制序列能夠控制在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)和/或從宿主細(xì)胞的分泌。調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列，例如CMV啟動(dòng)子和信號(hào)序列，其可以源自其它已知的抗體。類似地，可以產(chǎn)生具有DNA序列的第二表達(dá)載體，所述DNA序列編碼互補(bǔ)的抗原結(jié)合構(gòu)建體輕鏈或重鏈。在某些實(shí)施方案中，除了所涉及的編碼序列和選擇標(biāo)記之外，這種第二表達(dá)載體與第一表達(dá)載體相同，以確保盡可能地有功能地表達(dá)每條多肽鏈?；蛘?，抗原結(jié)合構(gòu)建體的重鏈和輕鏈編碼序列可以存在于單個(gè)載體上，例如在相同載體的2個(gè)表達(dá)盒中。
通過常規(guī)技術(shù)，用第一載體和第二載體共轉(zhuǎn)染選定的宿主細(xì)胞(或僅用單個(gè)載體轉(zhuǎn)染)，以創(chuàng)建包含重組的或合成的輕鏈和重鏈的本發(fā)明的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。然后通過常規(guī)技術(shù)，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以生產(chǎn)本發(fā)明的工程化的抗原結(jié)合構(gòu)建體。通過合適的試驗(yàn)，例如 ELISA或RIA，從培養(yǎng)物篩選包括重組重鏈和/或輕鏈的結(jié)合體的抗原結(jié)合構(gòu)建體?？梢圆捎孟嗨频某Ｒ?guī)技術(shù)，構(gòu)建其它抗原結(jié)合構(gòu)建體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適用于在本發(fā)明的方法和組合物構(gòu)建中采用的克隆和亞克隆步驟的載體。例如，可以使用常規(guī)的PUC克隆載體系列。一種載體pUC19可從供應(yīng)點(diǎn)商業(yè)獲得，例如 Amersham (Buckinghamshire，United Kingdom)或 Pharmacia (Uppsala， Sweden) 0另外，能夠容易地復(fù)制的、具有豐富的克隆位點(diǎn)和選擇基因(例如，抗生素抗性) 并且易于操作的任何載體，可以用于克隆。因而，克隆載體的選擇不是本發(fā)明的限制因素。
通過適用于放大異源DNA序列的表達(dá)的基因，例如，哺乳動(dòng)物二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，也可以表征表達(dá)載體。其它載體序列包括聚腺苷酸(poly Α)信號(hào)序列，例如來自牛生長(zhǎng)激素(BGH)的，以及β珠蛋白啟動(dòng)子序列(betaglopro)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，可以合成在本文中有用的表達(dá)載體。
這些載體的組件，例如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、信號(hào)序列等，可以從商業(yè)來源或天然來源獲得，或通過已知的方法合成，用于指導(dǎo)重組DNA的產(chǎn)物在選定的宿主中的表達(dá)和/或分泌。為了這個(gè)目的，也可以選擇其它合適的表達(dá)載體，其中許多類型在本領(lǐng)域已知用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲、酵母和真菌表達(dá)。
本發(fā)明還包括用含有本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的編碼序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。對(duì)于這些克隆載體的克隆和其它操作而言有用的宿主細(xì)胞也是常規(guī)的。然而，來自各種大腸桿菌菌株的細(xì)胞可以用于克隆載體的復(fù)制和本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的構(gòu)建中的其它步驟。
用于表達(dá)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞,諸如 NSO、Sp2/0、CHO(例如，ATCC 登記號(hào) CRL-9096，CHO DG44(Urlaub, G.和 Chasin， LA.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77 (7) :4216-4220 (1980))))、COS 諸如 C0S-1(ATCC 登記號(hào) CRL-1650)和 C0S-7 (ATCC 登記號(hào) CRL-1651)、HEK、293(ATCC 登記號(hào) CRL-1573)、 HeLa(ATCC 登記號(hào) CCL-2)、CVl (ATCC 登記號(hào) CCL-70)、WOP(Dailey, L.，等人，J. Virol.， 54 :739-749(1985)、3T3、293T (Pear，W. S.,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 90 8392-8396 (1993))NSO細(xì)胞、SP2/0、HuT 78細(xì)胞等，或植物(例如，煙草)(參見，例如， Ausubel, F. M.等人，編· Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates和John ffiley&Sons Inc. (1993))，成纖維細(xì)胞(例如，3T3)和骨髓瘤細(xì)胞?？梢允褂萌思?xì)胞，因而允許分子用人糖基化模式來修飾?；蛘撸梢圆捎闷渌婧思?xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇，以及用于轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)物生產(chǎn)和純化的方法， 是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，以上引述的Sambrook等人。
可以證明，細(xì)菌細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞，其適合表達(dá)本發(fā)明的重組Fab或其它實(shí)施方案(參見，例如，PlUckthun，A. , Immunol. Rev.，130 151-188 (1992))。但是，由于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白傾向于未折疊的形式或不正確地折疊的形式或非糖基化形式，必須篩選在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)的任何重組Fab，以保留抗原結(jié)合能力。如果細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的分子以適當(dāng)?shù)卣郫B的形式產(chǎn)生，該細(xì)菌細(xì)胞將是期望的宿主，或者，在替代性的實(shí)施方案中，可以在細(xì)菌宿主中表達(dá)分子，然后進(jìn)行重新折疊。例如，用于表達(dá)的各種大腸桿菌菌株，是生物技術(shù)領(lǐng)域中公知的宿主細(xì)胞?？莶菅挎邨U菌、鏈霉菌屬、其它芽孢桿菌屬等的各種菌株，也可以用于該方法中。
當(dāng)希望時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的真菌或酵母細(xì)胞的菌株也可用作宿主細(xì)胞(例如，巴氏畢赤酵母、曲霉菌屬、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、粗糙鏈孢霉)，以及昆蟲細(xì)胞(例如果蠅和鱗翅目昆蟲)和病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如，Drosophila Schnieder S2細(xì)胞、Sf9昆蟲細(xì)胞 (W0 94/26087(0' Connor))。參見，例如，Miller 等人，Genetic Engineering, 8 :277-298, Plenum Press (1986)和其中引用的參考文獻(xiàn)。
可以構(gòu)建載體的一般方法、生產(chǎn)本發(fā)明的宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)染方法、從這些宿主細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體所必需的培養(yǎng)方法，都可以是常規(guī)技術(shù)。通常，本發(fā)明的培養(yǎng)方法是無血清培養(yǎng)方法，通常通過在懸浮液中無血清地培養(yǎng)細(xì)胞。同樣地，生產(chǎn)以后， 可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，從細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)容物純化本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體，所述方法包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱色譜法、凝膠電泳等。這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域技能，不會(huì)限制本發(fā)明。例如，在WO 99/58679和WO 96/16990中描述了改變的抗體的制備。
表達(dá)抗原結(jié)合構(gòu)建體的又一個(gè)方法可以利用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)，例如如美國(guó)專利號(hào)4，873，316所述。這涉及利用動(dòng)物的酪蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)其被轉(zhuǎn)基因地?fù)饺氩溉閯?dòng)物中時(shí)，允許雌性動(dòng)物在它的奶中產(chǎn)生希望的重組蛋白。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括下述步驟培養(yǎng)用編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈和/或重鏈的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，并回收由此生產(chǎn)的抗體。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的方法，所述方法包括下述步驟
(a)提供編碼抗原結(jié)合構(gòu)建體的重鏈的第一載體；
(b)提供編碼抗原結(jié)合構(gòu)建體的輕鏈的第二載體；
(c)用所述第一載體和第二載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(例如，CH0)；
(d)在有助于所述抗原結(jié)合構(gòu)建體從所述宿主細(xì)胞分泌到所述培養(yǎng)基中的條件下，培養(yǎng)步驟(c)的宿主細(xì)胞；
(e)回收步驟(d)的分泌的抗原結(jié)合構(gòu)建體。
通過希望的方法表達(dá)以后，然后使用合適的試驗(yàn)，檢查抗原結(jié)合構(gòu)建體的體外活性。采用當(dāng)前常規(guī)的ELISA試驗(yàn)形式或BIAcore來評(píng)估抗原結(jié)合構(gòu)建體與它的靶物的定性和定量結(jié)合。另外，也可以使用其它體外試驗(yàn)來證實(shí)中和效力，然后進(jìn)行人類臨床研究，以評(píng)價(jià)抗原結(jié)合構(gòu)建體在體內(nèi)的持久性，盡管有一般的清除機(jī)制。
有利地，本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體可以在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為單個(gè)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，在抗原結(jié)合構(gòu)建體是形成mAbdAb分子的雙靶向構(gòu)建體的情況下，將mAb的重鏈表達(dá)為包含dAb的單個(gè)分子。例如，在根據(jù)本發(fā)明的MAbdAb構(gòu)建體是結(jié)合與抗-c-Kit 免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域相連的MLC的單克隆抗體的情況下，將抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域表達(dá)為抗-MLC抗體重鏈的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域表達(dá)為抗-MLC抗體輕鏈的一部分。
有利地，與其中使用化學(xué)連接物連接2個(gè)抗原結(jié)合組分的分子相比，可以更有效地生產(chǎn)這樣的表達(dá)構(gòu)建體。這是因?yàn)?，?dāng)使用化學(xué)連接物時(shí)，得到的終產(chǎn)物會(huì)包含代表不完全的化學(xué)連接反應(yīng)的分子的混合群體。也就是說，在將結(jié)合組分A與結(jié)合組分B相混合并加入連接劑χ來確?；瘜W(xué)交聯(lián)的情況下，連接反應(yīng)后得到的反應(yīng)混合物將包含A、B、χ、A-x 和B-x以及希望的化合物A-x-B。因此，在生產(chǎn)過程中使用該方法，會(huì)需要純化步驟來去除所有部分地反應(yīng)的組分，并得到正確的希望的化合物A-x-B。
用于表達(dá)雙靶向構(gòu)建體的體外表達(dá)系統(tǒng)會(huì)提供一種生產(chǎn)系統(tǒng)，因?yàn)橛纱说玫降乃蟹肿佣际窍Ｍ幕衔?。這樣的系統(tǒng)會(huì)提供一種簡(jiǎn)化的生產(chǎn)方法(其提供更均一的產(chǎn)物群體)，并提供一種更常規(guī)的生產(chǎn)方法(其可以滿足安全性要求)。
治療治療的劑量和持續(xù)時(shí)間與本發(fā)明的分子在人循環(huán)中的相對(duì)持續(xù)時(shí)間有關(guān)， 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)要治療的病癥和患者的一般健康來調(diào)整。預(yù)見到，可能需要在延長(zhǎng)的時(shí)間段(例如，四到六個(gè)月)內(nèi)的重復(fù)給藥(例如，每3天一次、每周一次或每2周一次)來實(shí)現(xiàn)最大治療效果。理想的給藥是，在心肌梗塞以后(即心肌梗塞后)第一個(gè)周內(nèi)單次給藥。
本發(fā)明的治療劑的給藥模式可以是向宿主遞送藥劑的任何適合的途徑。本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體、免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和藥物組合物特別適用于腸胃外施用，即，皮下地(s. c.)、鞘內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、肌肉內(nèi)地(i.m.)、靜脈內(nèi)地(i.v.)或鼻內(nèi)地，或在外科手術(shù)過程中。
本發(fā)明的治療劑可以制備成藥物組合物，其含有在藥學(xué)上可接受的載體中的有效量的本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體或免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域作為活性成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的預(yù)防藥劑是水混懸液或溶液，其含有準(zhǔn)備好給藥的形式的抗原結(jié)合構(gòu)建體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混懸液或溶液在生理PH下緩沖。用于腸胃外施用的組合物包含溶于藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體或其混合物的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是水性載體?？梢允褂枚喾N水性載體，例如，0.9%鹽水、0.3%甘氨酸等。這些溶液可以制成無菌的，一般沒有顆粒物質(zhì)。通過常規(guī)的公知的滅菌技術(shù)(例如，過濾)，可以將這些溶液滅菌。組合物可以含有接近生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如PH 調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體在這種藥物制劑中的濃度可以廣泛地變化， 即，從低于約0. 5%、通常在或至少約到多達(dá)約15或約20% (按重量計(jì)算)，主要根據(jù)液體體積、粘度等，根據(jù)選定的特定給藥模式，進(jìn)行選擇。
因而，用于肌肉內(nèi)注射的本發(fā)明的藥物組合物可以制備成含有約ImL無菌緩沖水，和約Ing至約IOOmg(例如，約50ng至約30mg，或約5mg至約25mg)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體。類似地，用于靜脈內(nèi)輸注的本發(fā)明的藥物組合物可以制備成含有約250ml無菌林格氏溶液，和約1至約30或約5mg至約25mg本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體/ml林格氏溶液。用于制備腸胃外施用的組合物的實(shí)際方法是公知的，或者對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，更詳細(xì)地描述在，例如，Remington' s Pharmaceutical Science, 第 15 片反，Mack Publishing Company, Easton, PermsylvEiniEi0內(nèi) HM 的* 發(fā)明抗原結(jié)合構(gòu)建體制劑的制備，參見Lasmar U和Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci. Tech. today,第 129-137 β , M 3 ^ (2000 年 4 月 3 日)；Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int.J.Pharm 185(1999) 129-188 ；Stability of Protein Pharmaceuticals A 部禾口 B 部，Ahern Τ. J. , Manning Μ. C.編，New York, NY Plenum Press(1992) ；Akers, Μ. J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002)2283-2300 ；Imamura, K φ A"Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92(2003)266-274 ;Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze—drying，，，J Pharm. Pharmacol, 54(2002) 1033-1039 ；Johnson,R,"Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization，，，J. Pharm. Sci，91 (2002)914-922 ；和 Ha，E Wang W, Wang Y. J. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability",J. Pharm Sci, 91,2252-2264, (2002)，它們的所有內(nèi)容通過引用并入本文，并向讀者特別地提及。
在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在藥物制品中時(shí)，本發(fā)明的治療劑以單位劑量形式存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適的治療有效劑量。根據(jù)患者的體重，可以為患者計(jì)算合適的劑量，例如合適的劑量可以是在下述范圍內(nèi)約0. 01至約20mg/kg，例如約0. 1至約 20mg/kg,例如約1至約20mg/kg，例如約10至約20mg/kg，或例如約1至約15mg/kg，例如約10至約15mg/kg。為了有效地治療本發(fā)明適用的人類病癥，合適的劑量可以是在下述范圍內(nèi)的本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體約0. 01至約lOOOmg，例如約0. 1至約lOOOmg，例如約0. 1 至約500mg,例如約500mg,例如約0. 1至約IOOmg,或約0. 1至約80mg,或約0. 1至約60mg, 或約0. 1至約40mg，或例如約1至約lOOmg，或約1至約50mg，其可以腸胃外地(例如皮下地、靜脈內(nèi)地或肌肉內(nèi)地)施用。如果必要，可以按照醫(yī)師酌情選擇的合適時(shí)間間隔，重復(fù)這種劑量。
可以低壓凍干本文所述的抗原結(jié)合構(gòu)建體進(jìn)行保存，并在使用前在適合的載體中重構(gòu)。已經(jīng)證實(shí)，這種技術(shù)對(duì)于常規(guī)的免疫球蛋白是有效的，且可以采用本領(lǐng)域已知的低壓凍干法和重構(gòu)技術(shù)。
疾病本發(fā)明的藥物組合物可以治療的疾病包括這樣的疾病，其中，心肌、骨骼肌、 血管平滑肌、臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和腎、結(jié)腸、輸卵管、直腸、精囊、皮膚、視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞或膀胱上皮中的肌肉組織受損。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以治療的疾病包括心血管??；心肌梗塞、慢性心力衰竭、缺血性心臟病、慢性缺血性或非缺血性心肌病、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、 糖尿病性心臟病、出血性中風(fēng)、血栓性中風(fēng)、栓性中風(fēng)、肢缺血、外周血管病或其中組織已經(jīng)缺血的另一種疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以治療脊髓損傷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以治療肌疾病或肌肉障礙。肌疾病/肌肉障礙包括例如少肌癥、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、脊髓性肌萎縮。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是心肌梗塞，尤其是急性心肌梗塞(AMI)。在心肌梗塞中，由血液供給不足導(dǎo)致的氧缺乏，會(huì)損傷心肌的肌細(xì)胞。
通過心臟功能參數(shù)的改善，可以測(cè)量成功的治療，所述參數(shù)包括射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、左心室收縮末期容積和舒張末期容積和局部室壁活動(dòng)、或心臟形態(tài)學(xué)測(cè)量諸如梗塞面積的減少。通過超聲心動(dòng)描記術(shù)或MRI、核成像，可以測(cè)量這些參數(shù)。另外，通過不利事件的減少和生活質(zhì)量和運(yùn)動(dòng)耐量的提高，可以測(cè)量成功，所述不利事件包括住院、隨后的心肌梗塞和死亡。
僅僅為了例證目的，在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1 蛋白的克隆和表達(dá)
1.重組小鼠和人vMLC-1的克隆和表達(dá)
使用PCR，合成了心室肌球蛋白輕鏈1 (vMLCl)的基因(UniProt登錄號(hào) P08590 (人)、P09542 (小鼠))，還摻入了 C-端 GlySer (His) 6 標(biāo)簽。
使用下述的PCR引物
權(quán)利要求
1.一種抗原-結(jié)合構(gòu)建體，其包含結(jié)合干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子的第一種藥劑，和結(jié)合組織特異性的標(biāo)志物分子的第二種藥劑。
2.如在權(quán)利要求1中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述組織特異性的標(biāo)志物是肌肉特異性的標(biāo)志物分子。
3.如在權(quán)利要求2中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述組織特異性的標(biāo)志物是心肌-特異性的標(biāo)志物分子。
4.如在權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述第一種藥劑或所述第二種藥劑是單克隆抗體。
5.如在權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述第一種藥劑或所述第二種藥劑是表位-結(jié)合域。
6.如在權(quán)利要求5中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述表位-結(jié)合域是免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。
7.如在權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子和所述組織特異性的標(biāo)志物分子是人的。
8.如在權(quán)利要求1-7中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子是c-Kit。
9.如在權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述肌肉-特異性的標(biāo)志物分子選自肌球蛋白-衍生的分子諸如肌球蛋白輕鏈(MLC)、心臟肌球蛋白、人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl)、MLC UMLC 2和MLC 3、心臟肌鈣蛋白I、心臟肌鈣蛋白、生腱蛋白C或肌酸激酶。
10.如在權(quán)利要求9中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述結(jié)合肌肉特異性的標(biāo)志物分子的藥劑是抗-MLC抗體。
11.如在權(quán)利要求10中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述抗-MLC抗體是可從ATCCHB 11709得到的單克隆抗體。
12.如在前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述第一種藥劑是抗-c-Kit單克隆抗體，所述第二種藥劑是抗-MLC單克隆抗體。
13.如在權(quán)利要求1-12中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，它是MAbdAb。
14.如在權(quán)利要求13中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述第一種藥劑是抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，所述第二種藥劑是單克隆抗-MLC抗體。
15.如在權(quán)利要求1-11、13或14中的任一項(xiàng)中所述的構(gòu)建體，其中所述結(jié)合c-Kit的表位結(jié)合域是如在權(quán)利要求30-52、56-61中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或多肽、或如在權(quán)利要求陽中要求保護(hù)的配體。
16.如在權(quán)利要求1-11、13-15中的任一項(xiàng)中所述的構(gòu)建體，其中所述結(jié)合c-Kit的表位結(jié)合域是具有SEQ ID N0:302-305、457、458或482中的任一個(gè)所述的氨基酸的免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或多肽。
17.如在前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述抗-MLC抗體是如在權(quán)利要求22- 中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的、結(jié)合人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl)的抗原結(jié)合蛋白或抗體。
18.如在前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述第一種藥劑和所述第二種藥劑連在一起。
19.如在權(quán)利要求15或16中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述連接物選自下述任一種 G4S 連接物(GGGGQ ；TVAAPS ；ASTKGPT ；ASTKGPS ；EPKSCDKTHTCPPCP ；ELQLEESCAEAQDGELDG, AST, STGGGGGS,STGGGGGSGGGGS, STGPPPPPS, STGPPPPPPPPPPS, STG，PPPPPS，STGSRDPYLffSAP SDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGNGS TG, iSTG'(絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸)、iGSTG'或‘RS，。
20.如在權(quán)利要求13中要求保護(hù)的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體選自在表M中所述的構(gòu)建體中的任一種。
21.一種核酸分子，其編碼如在權(quán)利要求1-19中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體。
22.—種抗原結(jié)合蛋白，其結(jié)合人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl)，且其包含SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 17的⑶R3，或它們的含有⑶R3中的1、2或3個(gè)氨基酸置換的變體。
23.如在權(quán)利要求22中要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含下述的 CDR CDRHl(SEQ ID NO 18)、CDRH2(SEQ ID NO :19)、CDRH3(SEQ ID NO 20)、CDRLl(SEQ ID NO :14)、CDRL2(SEQ ID NO15)、CDRL3(SEQ ID NO :16)。
24.如在權(quán)利要求22或23中要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白，其會(huì)結(jié)合小鼠和人vMLCl。
25.如在權(quán)利要求22-24中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白是抗體。
26.如在權(quán)利要求25中要求保護(hù)的抗體，其中所述抗體是人源化的或嵌合的抗體。
27.如在權(quán)利要求2216中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白或抗體，其包含選自 SEQ ID NO :22、25、28 或 31 的 VH 結(jié)構(gòu)域，和選自 SEQ ID NO :34、37 或 440 的 V κ 結(jié)構(gòu)域。
28.如在權(quán)利要求27中要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白或抗體，其包含具有在SEQID NO 31中所述的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和具有在SEQ ID NO 37中所述的序列的Vk結(jié)構(gòu)域。
29.如在權(quán)利要求22-28中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白或抗體，其中所述抗原結(jié)合蛋白包括 Fab、Fab，、F (ab，)2、Fv、diabody、triabody、tetrabody、微型抗體、分離的 VH、分離的VK或dAb。
30.一種核酸分子，其編碼如在權(quán)利要求22-29中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白或抗體。
31.一種用第一種載體和第二種載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其中所述第一種載體包含編碼根據(jù)權(quán)利要求22-29中的任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合蛋白或抗體的重鏈的核酸分子，且所述第二種載體包含編碼根據(jù)權(quán)利要求22-29中的任一項(xiàng)所述的抗原或抗體的輕鏈的核酸分子。
32.—種抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。
33.如在權(quán)利要求30中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其以在下述范圍內(nèi)的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合c-Kit IOpM至10微摩爾，在一個(gè)實(shí)施方案中，IOOpM至10微摩爾，或0. 1微摩爾至1微摩爾。
34.一種分離的多肽，其包含抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。
35.如在權(quán)利要求34中要求保護(hù)的分離的多肽，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少70%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列，且所述分離的多肽結(jié)合c-Kit。
36.一種分離的多肽，其包含由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼的氨基酸序列。
37.一種分離的多肽，其由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列與在圖6、SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384或476中所述的任一個(gè)核酸序列具有至少60% 同一性，且所述分離的多肽結(jié)合c-Kit。
38.如在權(quán)利要求32-35中要求保護(hù)的分離的多肽，其結(jié)合人c-Kit。
39.如在權(quán)利要求34-38中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的分離的多肽，其結(jié)合人和小鼠 c-Kit。
40.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列具有至少90%同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300,383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。
41.如在權(quán)利要求40中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由 SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300,383-384 或476所述的任意核酸序列編碼。
42.如在權(quán)利要求41中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與由鑒別為D0iC8h-5(SEQ ID NO :39)、D0M28h-43 (SEQ ID NO 51)、D0M28h-33 (SEQ ID NO :49)、D0M28h_94 (SEQ ID NO :65)、D0M28h_66 (SEQ ID NO 58)、D0M28h-110(SEQ ID NO :70)、D0M28h_84 (SEQ ID NO :62)、D0M28m_23 (SEQ ID NO 81)、D0M28m-7 (SEQ ID NO :78)、D0M28m_52 (SEQ ID NO :84)、D0M28h_79 (SEQ ID NO 61)、D0M28h-7 (SEQ ID NO :41)、D0M28h_20 (SEQ ID NO :45)、D0M28h_26 (SEQ ID NO :48)、 D0M28h-78 (SEQ ID NO :60)、D0M28h_73 (SEQ ID NO :59)或D0M29h_54 (SEQ ID NO :55)的任一個(gè)核酸序列編碼的氨基酸序列相同。
43.如在權(quán)利要求40-42中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合人c-Kit。
44.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶Rl序列所述⑶Rl序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDRl序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。
45.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶R2序列所述⑶R2序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR2序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。
46.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。
47.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個(gè)氨基酸位置處被修飾， 且包含這樣的⑶Rl序列所述⑶Rl序列與由下述核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的⑶Rl 序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO 39-87、2對(duì)_246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列，且包含這樣的⑶R2序列所述⑶R2序列與由下述核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的⑶R2序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。
48.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶Rl序列所述⑶Rl序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDRl序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。
49.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個(gè)氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個(gè)所述的序列。
50.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含在不超過 25 個(gè)氨基酸位置處被修飾的 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或476的氨基酸序列，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的⑶Rl序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、 224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個(gè)所述的序列，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR2序列具有至少50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。
51.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含與下述任一個(gè)所述的序列具有至少50%同一性的⑶R3序列在由具有SEQ ID NO =39-87, 224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列。
52.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自下述的 CDR3 序列在由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383_384 或 476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的CDR3序列。
53.如在權(quán)利要求32中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含至少一個(gè)選自CDR1、CDR2和CDR3的CDR，其中所述CDRU CDR2或CDR3與在由具有SEQ ID NO 39-87,224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個(gè)所述的序列的核酸編碼的任一個(gè)氨基酸序列中的⑶Rl、⑶R2或⑶R3序列相同。
54.如在權(quán)利要求40-53中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含至少一個(gè)選自圖7所述⑶R序列的⑶R。
55.一種核酸分子，其包含編碼如在權(quán)利要求32-54中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的多肽或抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
56.一種核酸分子，其包含 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個(gè)所述的核酸序列。
57.一種配體，其具有對(duì)c-Kit的結(jié)合特異性，并抑制抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，所述單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含由下述的核酸編碼的氨基酸序列，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個(gè)所述的序列。
58.如在權(quán)利要求32-57中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體，其以基本上不抑制SCF的c-Kit受體結(jié)合和/或活化的方式，結(jié)合c-Kit。
59.如在權(quán)利要求58中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體，其包含選自下述的氨基酸序列由D0M28h-5 (SEQ ID NO :39)、D0M28h-33 (SEQ ID NO 49)、D0M28h-43 (SEQ ID NO :51)、D0M28h_66 (SEQ ID NO :58)、D0M28h_84 (SEQ ID NO 62)、D0M28h-94 (SEQ ID NO :65)、D0M28h_110 (SEQ ID NO :70)、D0M28m_7 (SEQ ID NO :78)、 D0M28m-23 (SEQ ID NO :81)或 D0iC8m_52 (SEQ ID NO :84)中的任一個(gè)所述的核酸序列編碼的氨基酸序列。
60.如在權(quán)利要求32-57中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體，其以基本上抑制SCF的c-Kit受體結(jié)合和/或活化的方式，結(jié)合c-Kit。
61.如在權(quán)利要求60中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自下述的氨基酸序列由 D0iC8h-7(SEQ ID NO :41)、D0M28h_20 (SEQ ID NO :45)、 D0M28h-26 (SEQ ID NO :48)、D0M28h_54 (SEQ ID NO :55)、D0M28h_73 (SEQ ID NO :59)、 D0M28h-78 (SEQ ID NO :60)或 D0iC8h_79 (SEQ ID NO :61)中的任一個(gè)所述的核酸序列編碼的氨基酸序列。
62.如在權(quán)利要求32-61中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體，其顯示出人和小鼠c-Kit之間的交叉反應(yīng)性。
63.如在權(quán)利要求62中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體，其包含選自下述的氨基酸序列由D0iC8h-5(SEQ ID NO 39), D0M28h-94 (SEQ ID NO: 65)、D0M28m-7 (SEQ ID NO 78), D0M28m-23 (SEQ ID NO :81) ^P D0M28m-52 (SEQ ID NO :84) 中的任一個(gè)所述的核酸序列編碼的氨基酸序列。
64.一種用于生產(chǎn)如任一項(xiàng)前述權(quán)利要求要求保護(hù)的抗原結(jié)合構(gòu)建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或配體的方法，所述方法包括在適合表達(dá)重組核酸的條件下，維持包含重組核酸的重組宿主細(xì)胞，所述重組核酸編碼所述抗原結(jié)合構(gòu)建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或配體，由此表達(dá)重組核酸，生產(chǎn)抗原結(jié)合構(gòu)建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或配體。
65.如在權(quán)利要求64中要求保護(hù)的方法，所述方法另外包括分離所述抗原結(jié)合構(gòu)建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或配體。
66.如在權(quán)利要求32-M或57-63中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、多肽或配體，其用于靶向c-Kit，用于治療與c-Kit受體活化有關(guān)的疾病或障礙。
67.如在權(quán)利要求66中要求保護(hù)的抗-c-Kit免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所述疾病或障礙是肥大細(xì)胞障礙或癌癥，包括小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、婦科腫瘤或神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
68.一種藥物組合物，其包含如在權(quán)利要求32-M或57-63中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域多肽或配體。
69.一種裝置，其包含如在權(quán)利要求32-M或57-63中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域多肽或配體，其中所述免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域連接在所述裝置的表面上。
70.如在權(quán)利要求69中要求保護(hù)的裝置，其中所述裝置是支架。
71.如在權(quán)利要求1-19中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗原-結(jié)合構(gòu)建體，其用于治療心臟病。
72.如在權(quán)利要求1-19中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗原-結(jié)合構(gòu)建體，其用于治療肌肉病。
73.一種藥物組合物，其包含如在權(quán)利要求1-19中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的構(gòu)建體。
74.如在權(quán)利要求73中要求保護(hù)的藥物組合物，其另外包含細(xì)胞因子。
75.如在權(quán)利要求74中要求保護(hù)的藥物組合物，其中所述細(xì)胞因子選自SCF、G-CSF, SDF-I、AMD3100、VEGF, FGF 和 DPP-IV 抑制劑。
76.一種治療心臟病的方法，所述方法包括施用如在權(quán)利要求1-19中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的抗原-結(jié)合構(gòu)建體。
77.如在權(quán)利要求76中要求保護(hù)的方法，所述方法另外包括施用細(xì)胞因子。
78.如在權(quán)利要求77中要求保護(hù)的方法，其中所述細(xì)胞因子選自SCF、G-CSF、SDF-I、 AMD3100、VEGF, FGF 和 DPP-IV 抑制劑。
79.如在權(quán)利要求76-78中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的治療心臟病的方法，所述方法包括 從患者提取骨髓細(xì)胞，在體外處理所述細(xì)胞，并使所述細(xì)胞返回患者，然后施用構(gòu)建體。
80.如在權(quán)利要求76-78中的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的治療心臟病的方法，所述方法另外包括施用化合物，以增強(qiáng)干細(xì)胞存活、分化或增殖。
81.如在權(quán)利要求80中要求保護(hù)的方法，其中所述化合物選自VEGF、FGF、他汀類藥物、 SDF-I、CXCR4 或 SDF-I β P2G。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種抗原-結(jié)合構(gòu)建體，其包含結(jié)合干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物分子的第一種藥劑，和結(jié)合組織特異性的標(biāo)志物分子的第二種藥劑。具體地，本發(fā)明描述了一種構(gòu)建體，其中所述組織特異性的標(biāo)志物是肌肉特異性的標(biāo)志物分子。這樣的構(gòu)建體可以用于藥物組合物中，所述藥物組合物用于肌肉再生或心臟病。
文檔編號(hào)A61K38/19GK102481340SQ201080025008
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月28日
發(fā)明者C·埃內(nèi)弗, E·庫(kù)爾斯托克, E·德安格利斯, J·埃德爾伯格, S·霍爾姆斯, T·D·巴圖萬加拉, V·巴拉德, Z·賈瓦德-阿拉米 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司