專利名稱：一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPα的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可溶性蛋白，它是由人⑶47受體SIRP α的胞外段，與其氨基末端融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成的一種白血病干細(xì)胞革巴向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
信號調(diào)節(jié)蛋白ct (Signal-regulatory protein α , SIRP α ),又稱為 SHPS-1,SIRPA，p84及BIT，屬于免疫球蛋白超家族成員。它主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、神經(jīng)元、樹突細(xì)胞及中性粒細(xì)胞。這種跨膜蛋白包含胞外區(qū)的三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域及胞漿區(qū)的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其胞漿區(qū)在大鼠，小鼠和人之間高度保守，含有酪氨酸殘基并形成抑制性受體基于酪氨酸的抑制性基序ITIM，從而激活包含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-I及SHP-2。SHP-I主要表達(dá)在造血細(xì)胞及上皮細(xì)胞，可負(fù)性調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的許多功能，SHP-2表達(dá)廣泛，可通過調(diào)節(jié)小GTP結(jié)合蛋白Ras及Rho而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移及分化等正向調(diào)節(jié)功能。因此，SIRPa就作為一個船塢蛋白對細(xì)胞膜外的刺激產(chǎn)生反應(yīng)，并通過募集SHP-I或SHP-2而發(fā)揮它特殊的生物學(xué)功能。此外，SIRPa也可以連接Src激酶相關(guān)蛋白SCAP2 (也稱為SKAP55hom/R)以及Fyn連接蛋白FYB (也稱為SLAP-130)而引起明顯的抑制性信號。近年研究發(fā)現(xiàn)，SIRPa作為CD47的胞外受體，在巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的清除過程中發(fā)揮著重要作用。CD47,又稱整合素相關(guān)蛋白(integrin-associated protein , IAP),也屬于免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。最初從人胎盤與整合素α V β3共純化而為人們所認(rèn)識。它是一種廣泛表達(dá)的抗原，存在于所有組織的不同細(xì)胞上。這種跨膜蛋白包含V型I g樣胞外結(jié)構(gòu)域，高度疏水的五次跨膜區(qū)以及胞漿區(qū)。CD47最初是作為整合素依賴的白細(xì)胞，對細(xì)胞外基質(zhì)蛋白反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用。最經(jīng)典的確定CD47在調(diào)節(jié)吞噬作用的證據(jù)來源于將⑶47敲除紅細(xì)胞(RBCs)移植入正常小鼠體內(nèi)后很快被巨噬細(xì)胞從血液中清除，表明RBC表面的CD47與巨噬細(xì)胞表面的SIRPa結(jié)合可能在緩沖巨噬細(xì)胞對自身細(xì)胞清除中具有重要作用。巨噬細(xì)胞的吞噬作用是腫瘤免疫監(jiān)視的重要調(diào)節(jié)因素。最近的研究表明，在急性髓細(xì)胞白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)及非何杰金氏淋巴瘤(NHL)等惡性血液系統(tǒng)腫瘤病中，大量的白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞(LSC) CD47表達(dá)顯著上調(diào)，并可通過與SIRPa間的相互作用，阻止白血病細(xì)胞被宿主的先天免疫系統(tǒng)清除。這也是白血病耐藥、復(fù)發(fā)的重要原因之一。而通過靶向性的⑶47單克隆抗體阻斷⑶47-SIRPa間的作用，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對白血病細(xì)胞及LSC的吞噬作用，且不會減少正常的造血干細(xì)胞，對于白血病的治療有著重要的臨床意義。本發(fā)明基于⑶47-SIRPa在調(diào)節(jié)吞噬中的重要作用，表達(dá)了可溶性的SIRP α胞 外段蛋白，與巨噬細(xì)胞上的SIRPa競爭結(jié)合白血病細(xì)胞上⑶47，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，該蛋白可以結(jié)合于白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞表面，有效地增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對白血病干細(xì)胞的吞曬作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是它由人SIRPa蛋白胞外段和融合TrxHis的表達(dá)標(biāo)簽組成；其中hSIRP α蛋白胞外段是hSIRPa第26 370位氨基酸。所述的hSIRP α第26 370位氨基酸包含與⑶47結(jié)合的IgV樣結(jié)構(gòu)域；所述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列編碼。 Nol TrxHis-hSIRP α 的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnVsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No2 TrxHis-hSIRPa 的核酸序列 atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatc
ctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagetgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列編碼No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列
gvageeelqviqpdks vlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No4 :hSIRPa胞外段的核酸序列
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No5 =TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi0No6 TrxHis 的核酸序列 atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatc
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圖UhSIRPa胞外段蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式 圖2、目的基因(hSIRP a )的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳； 圖3、表達(dá)載體pET32a_hSIRPa的酶切鑒定 圖4、TrxHis-hSIRP α融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE蛋白電泳 圖5、TrxHis-hSIRP α融合蛋白純化后的電泳圖！Western blot定性檢測 圖6、人U937細(xì)胞的誘導(dǎo)分化；
圖7、TrxHis-hSIRP α融合蛋白與腫瘤細(xì)胞的親和力檢測；
圖8、TrxHis-hSIRP α融合蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。圖9、TrxHis-hSIRP α融合蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。
具體實(shí)施例方式以下通過附圖結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳盡的說明。I、構(gòu)建表達(dá)載體。根據(jù)hSIRPa的序列設(shè)計(jì)引物Pl: 5’_GATATCATGGGAGTGGCGGGTGAGGAG-3’ ；P2: 5’ -GCTCGAGCCGTTCATTAGAT CCAGTGT-3’。以人淋巴結(jié) cDNA 為模板，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼hSIRP α胞外段氨基酸的多核苷酸序列(圖2)，I. 5%瓊脂糖電泳回收后與PMD18-T載體16°C連接2小時，熱休克轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10，擴(kuò)增后將目的片段亞克隆至表達(dá)載體pET32a(+)，構(gòu)建pET32a_hSIRPa (圖3)，限制性酶切(圖4)、測序鑒定。圖UhSIRPa胞外段蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式圖。圖2、目的基因(hSIRP a )的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，I道(M)是分子量標(biāo)志(DL2000)，箭頭所指為擴(kuò)增片段。圖3、為表達(dá)載體pET32a_hSIRPa的酶切鑒定圖；(質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV+XhoI及Sac I +Bgl II雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。M道是marker DL2000)。2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。將表達(dá)載體pET32a(+)、pET32a_hSIRPa分別以熱休克法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布含100μ g/ml氨芐青霉素LB平板，37°C培養(yǎng)12小時后隨機(jī)挑取單克隆接種到含100μ g/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，220rpm，37°C培養(yǎng)12h，以I %轉(zhuǎn)接到新鮮LB(+)培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng)至3h后，加入終濃度I. OmM的IPTG，200rpm，37°C培養(yǎng)5h。6500rpm離心IOmin收集細(xì)菌，200 μ I/ml培養(yǎng)基PBS重懸細(xì)菌，超聲裂菌，加入1% Triton-XlOO，混勻，4°C靜置30分鐘，4°C離心收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，TrxHis-hSIRPa蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中(圖4)。圖4、為TrxHis-hSIRP α融合蛋白表達(dá)的蛋白電泳圖。將質(zhì)粒pET32a (+)、pET32a-hSIRP α分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，加入IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。取全細(xì)菌裂解物、裂解上清(可溶性組分)和裂解沉淀(即包涵體)分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。1-3為Trx的細(xì)菌裂解物、上清和沉淀，4-6為TrxHis-hSIRP α的細(xì)菌裂解物、上清和沉淀，M是蛋白分子3、重組蛋白的純化。pET32a(+)空載體蛋白TrxHis從細(xì)菌裂解上清中純化，TrxHis-hSIRP α以鎳離子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)純化包涵體蛋白，所有純化步驟以ProBondTM純化手冊操作。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot,可見在TrxHis-hSIRP α可檢測到大小正確的蛋白條帶(圖5)。圖5、為TrxHis-hSIRP α融合蛋白的純化及Western blot檢測。M道是蛋白分子量標(biāo)志。下圖是空載體蛋白及融合蛋白Western blot檢測結(jié)果,一抗是抗His標(biāo)簽抗體。4、巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。將人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞以2X IO5/孔的密度接種于24孔板中，同時加入乙酸肉豆蘧佛波酯(PMA) 160nM誘導(dǎo)3_5天，細(xì)胞由圓形懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁弓形蟲樣改變(圖6)。圖6、相差顯微鏡下人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞誘導(dǎo)分化為人巨噬細(xì)胞。5、融合蛋白與腫瘤細(xì)胞的親和力檢測。將人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞與純化的TrxHis-hSIRP α蛋白(10 μ g/ml)在37°C條件下共孵育2小時，PBS、Trx蛋白以及hCD47蛋白(專利公開號CN102070719A)作為對照。流式檢測poly-Histidine陽性細(xì)胞所占的比例。一抗為 poly-Histidine, 二抗為 anti-mouse IgG-FITC (圖 7)。圖7、為流式細(xì)胞術(shù)檢測TrxHis-hSIRPa蛋白與腫瘤細(xì)胞親和力。6、蛋白功能測定將人U937細(xì)胞以2X IO5/孔的密度接種于24孔板中，給予PMA160nM誘導(dǎo)3_5天。之后將DiI標(biāo)記的Jurkat細(xì)胞以2 X IO4/孔的密度添加到預(yù)先接種有巨噬細(xì)胞的24孔板中，同時添加hSIRP α胞外段蛋白(10 μ g/ml), PBS、Trx蛋白以及h⑶47蛋白作為對照。處理組和對照組分別設(shè)三個復(fù)孔。蛋白作用2小時后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)吞噬有Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，分別計(jì)數(shù)十個視野，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(圖8、圖 9)
圖8、為熒光顯微鏡下觀察對照組與處理組巨噬細(xì)胞對Jurkat細(xì)胞的吞噬情況，箭頭所指為吞噬了 Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。圖9、為熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)吞入Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，分別計(jì)數(shù)十個視野，之后對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，Student’ s t檢驗(yàn)，*P〈0. 05，** P〈0. 01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由以上可制備本發(fā)明這種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，它是由人SIRPa蛋白胞外段和融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成；其中hSIRPa蛋白胞外段是hSIRPa第26 370位氨基酸。所述的hSIRP α第26 370位氨基酸包含與⑶47結(jié)合的IgV樣結(jié)構(gòu)域；所述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列編碼。Nol TrxHis-hSIRP α 的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp dlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No2 TrxHis-hSIRPa 的核酸序列
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No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列
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aataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo所述氨基末端融合TrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列編碼
No5 =TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi0No6 TrxHis 的核酸序列 atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc
tcgtcga tttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatc0所述白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa是在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hSIRP a蛋白。本發(fā)明的特點(diǎn)是TrxHis-hSIRP α在體外可以通過基因工程進(jìn)行大量生產(chǎn)，應(yīng)用于體內(nèi)時可與白血病細(xì)胞及LSC上高表達(dá)的⑶47結(jié)合，阻止巨噬細(xì)胞上抑制性受體SIRP a與CD47結(jié)合，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對白血病細(xì)胞及LSC的吞噬作用，對于白血病的靶向治療以及清除微小殘留病變有著重要意義。序列表
Nol :TrxHis_hSIRP α的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanIsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No2 TrxHis-hSIRPa 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagetgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgagga cgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggoNo3 :hSIRPa胞外段的氨基酸序列
gvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No4 :hSIRPa胞外段的核酸序列
ggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagctgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcag caaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggNo5 TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi0No6 TrxHis 的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatc。
權(quán)利要求
1.一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是它由人SIRPa蛋白胞外段和融合TrxHis的表達(dá)標(biāo)簽組成；其中hSIRP a蛋白胞外段是hSIRP a第26 370位氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述的hSIRP a第26 370位氨基酸包含與CD47結(jié)合的IgV樣結(jié)構(gòu)域；所述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列編碼； Nol :TrxHis_hSIRP a的氨基酸序列Msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkyg irgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfpr vttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner ； No2 :TrxHis_hSIRP α 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagetgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列編碼No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列Gvageeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner ； No4 hSIRPa胞外段的核酸序列g(shù)gagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagctgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述氨基末端融合TrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列編碼 No5 =TrxHis的氨基酸序列MsdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamad ； No6 TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatc0
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hSIRP a蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可溶性蛋白，它是由人CD47受體SIRPα的胞外段，與其氨基末端融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成的一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPα，其特征是它由人SIRPα蛋白胞外段和融合TrxHis的表達(dá)標(biāo)簽組成；其中hSIRPα蛋白胞外段是hSIRPα第26~370位氨基酸。所述的hSIRPα第26~370位氨基酸包含與CD47結(jié)合的IgV樣結(jié)構(gòu)域；所述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性蛋白的氨基末端。TrxHis-hSIRPα在體外可以通過基因工程進(jìn)行大量生產(chǎn)，應(yīng)用于體內(nèi)時可與白血病細(xì)胞及LSC上高表達(dá)的CD47結(jié)合，阻止巨噬細(xì)胞上抑制性受體SIRPα與CD47結(jié)合，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對白血病細(xì)胞及LSC的吞噬作用，對于白血病的靶向治療以及清除微小殘留病變有著重要意義。
文檔編號C07K19/00GK102643347SQ20121008722
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者林燕, 梁英民, 江遜, 韓驊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)