專利名稱：結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核ctl表位肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核病治療性多肽疫苗，尤其是涉及利用結(jié)核桿菌自身耐藥相關(guān)抗原篩選出的具有治療活性的抗結(jié)核CTL表位肽，本發(fā)明還涉及該肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
耐藥結(jié)核分枝桿菌數(shù)量的日益增加是造成近年來(lái)結(jié)核病死灰復(fù)燃、卷土重來(lái)的重要原因。結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制主要分天然耐藥機(jī)制和獲得性耐藥機(jī)制。獲得性耐藥主要是由于耐藥相關(guān)基因的點(diǎn)突變，而天然耐藥機(jī)制主要由于細(xì)胞壁的通透性障礙和活躍外排泵系統(tǒng)。因此，藥物外排系統(tǒng)可以成為重要的耐藥結(jié)核治療靶點(diǎn)。近年來(lái)在動(dòng)物模型及臨床研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+ CTL在抗結(jié)核感染保護(hù)性應(yīng)答中起著重要和獨(dú)特的作用，CD8+ CTL對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，必須能識(shí)別靶細(xì)胞表面與相應(yīng)MHC-I類分子結(jié)合的特異性抗原表位，即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位。 目前研究的CD8+CTL蛋白抗原表位，主要集中在結(jié)核菌特異的分泌蛋白上，如ESAT-6、CFP-10、 CFP-21、MPT64、Ag85復(fù)合物等，而對(duì)于膜蛋白尤其是藥物外排蛋白CD8+CTL表位報(bào)道很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源的抗結(jié)核CTL表位肽，本發(fā)明還提供該類肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽為九肽，所述九肽的氨基酸序列為
P5 Tyr-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Pro-Val 或 P6 Tyr-IIe-Val-Gly-Phe-Cys-Leu-Leu-Val 或 P7 Thr-Leu-Thr-Trp-Leu-Phe-Ala-Phe-Val 或 P8 =Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val 或 P9 :Ala-Leu-Gly-Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu 或 PlO :Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu-Pro-Cys-Leu 或 Pll Leu-Leu-Cys-Ala-IIe-Phe-Ala-Glu-Val 或 P12 :Arg-Leu-Trp-Pro-Thr-Val-Gly-Cys_Leu0本發(fā)明所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明是根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用SYFPEITHI、BIMAS 和NetCTL 1. 2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)核耐藥相關(guān)蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，篩選獲得表位肽。然后通過(guò)體外ELISP0T實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)表位肽進(jìn)行鑒定。本發(fā)明采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法初步鑒定出能夠體外誘導(dǎo)CTL的表位肽，鑒定的九肽未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為研制基于耐藥相關(guān)蛋白抗原的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ)，并為設(shè)計(jì)基于混合T細(xì)胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息。


圖1-8是本發(fā)明表位肽的質(zhì)譜分析圖譜。圖9-16是本發(fā)明表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN- γ的能力。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的本發(fā)明所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽為九肽，所述九肽的氨基酸序列為
Ρ5 =Tyr-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Pro-Val (YLGGTTGPV )分子量864. 6 (理論值 863. 44)
或 P6 =Tyr-Ile-Val-Gly-Phe-Cys-Leu-Leu-Val (YIVGFCLLV)分子量1026. 7 (理論值:1025. 86)
或 P7 =Thr-Leu-Thr-Trp-Leu-Phe-Ala-Phe-Val (TLTffLFAFV)分子量1097. 7 (理論值:1097. 32)
或 P8 =Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val 值=786. 7)
或 P9 :Ala-Leu-Gly-Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu 值:857.81)
或 PlO :Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu-Pro-Cys-Leu 值930. 24)
或 Pll Leu-Leu-Cys-Ala-IIe-Phe-Ala-Glu-Val 值=977. 52)
或 P12 Arg-Leu-Trp-Pro-Thr-Val-Gly-Cys-Leu 值:1043. 56)。本發(fā)明主要采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方法，根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL 1. 2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)耐藥相關(guān)外排蛋白的HLA_A*0201 限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，篩選獲得表位肽采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC 純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。各肽質(zhì)譜鑒定圖見(jiàn)圖1-8。本發(fā)明表位肽的合成及制備采用固相合成法合成CTL表位肽?；玖鞒倘缦率紫葘⒁粋€(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹(shù)脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的第二個(gè)氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，最后切割得到目的肽。經(jīng)HPLC 純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。(參見(jiàn)①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學(xué)出版社，1985年。②.N.休厄德、H. D.賈庫(kù)布克著，劉克良等譯，肽化學(xué)與生物學(xué)，科學(xué)出版社，2005年。)
(GLVAGLSAV)分子量786. 7 (理論 (ALGMLIAGL)分子量858. 7 (理論 (MLIAGLPCL)分子量930. 6 (理論 (LLCAIFAEV)分子量978. 6 (理論 (RLWPTVGCL)分子量1044. 6 (理論人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離與ELISP0T實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
抽取健康供者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細(xì)胞介素2 (IL-2， Peprotech公司)和人β 2微球蛋白誘導(dǎo)分化CTL細(xì)胞，進(jìn)一步在體外ELISP0T實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法如下
1. PBMCs的分離與誘導(dǎo)(1)以40ml PBS (PH 7. 2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ； (2)離心管中加入細(xì)1 Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司)；(3)加8ml步驟(1)中稀釋后的外周血于4ml Lymphoprep分離液液面上；(4) 20°C離心(2000rmpX20min) ； (5)離心后，分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs); (6)吸出的白膜層用PBS CpH 7. 2)離心洗滌兩次；(7)用M孔板鋪板，細(xì)胞的濃度為IX 10 6/ml，每孔 Iml ； (8)第二天每孔加入3 PgAi^2微球蛋白和10 μ g表位肽，同時(shí)設(shè)立PBS組(以PBS 替代表位肽)作為陰性對(duì)照組；(9)第三天每孔加入50u IL-2;每2 3天換液，于七天后進(jìn)行第二輪荷肽(即每孔補(bǔ)加50u IL-2U0 PgAi^2微球蛋白和10 yg表位肽/PBS)， 十四天后進(jìn)行第三輪荷肽。第三輪荷肽后3天，得到效應(yīng)細(xì)胞CTL，然后進(jìn)行ELISP0T實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFN-Y釋放。2. ELISP0T實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(1)封閉取出所需板條，用含5% FCS RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)基封閉，200 μ L /孔，室溫下(25°C)靜置5 10 min后將其扣出(FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng))；(2)細(xì)胞上板誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞(IX IO5/孔)，荷肽的T2A2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(IX IO5/孔)鋪板。100 μ L/孔。細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(加入細(xì)胞之后，不要再震動(dòng)或者拍擊ELISP0T板)；·正對(duì)照細(xì)胞濃度為IX IO5/孔、加入10 UL ΡΗΑ，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌；·背景負(fù)對(duì)照加入100 μ L的含5%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基；(3)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入0)2培養(yǎng)箱，37 °C培養(yǎng)18h; (4)裂解細(xì)胞傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，200 μ L/孔加入冰冷的去離子水，4 ！冰浴反應(yīng)10 min(低滲法裂解細(xì)胞)；(5)洗滌傾倒孔內(nèi)的液體，IX的Washing Buff er，200 μ L/孔，洗滌5 7次，每次停留30 60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(6)加入檢測(cè)抗體孵育每孔加入100 μ L稀釋好的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，37 °C孵育Ih ； (7)洗滌傾倒孔內(nèi)的液體，1 X的Washing Buffer, 200 μ L/孔，洗滌5次，每次停留時(shí)間為3(T60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(8)酶聯(lián)親和素孵育將稀釋好的酶聯(lián)親和素工作液加入到實(shí)驗(yàn)孔，100 μ L/孔，37 °C孵育Ih; (9)洗滌傾倒孔內(nèi)的液體， IX的Washing Buffer，200uL/孔，洗滌5次，每次停留時(shí)間為30 60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(10)顯色解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 PL的顯色液，室溫靜置 15-45min (在20 -25° C，顯色25min較合適)，注意避光；(11)終止顯色傾倒孔內(nèi)液體， 揭開(kāi)板底座，以去離子水洗滌3飛遍，終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干；用ELISP0T圖象分析儀計(jì)數(shù)96孔板中每孔形成的斑點(diǎn)數(shù)。體外ELISP0T實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示候選肽均能夠在健康供者的外周血中誘導(dǎo)獲得 CTLs,且獲得的CTLs經(jīng)刺激后與陽(yáng)性肽相比較均有較高量的IFN- γ分泌(如圖9_16所示)。本發(fā)明利用結(jié)核桿菌自身的耐藥相關(guān)外排蛋白抗原篩選出具有抗結(jié)核的治療性活性肽，為研制基于抗原表位的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ)，并為設(shè)計(jì)基于混合T細(xì)胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽，其特征在于所述表位肽為九肽，所述九肽的氨基酸序列為P5 Tyr-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Pro-Val 或 P6 Tyr-IIe-Val-Gly-Phe-Cys-Leu-Leu-Val 或 P7 Thr-Leu-Thr-Trp-Leu-Phe-Ala-Phe-Val 或 P8 :Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val 或 P9 :Ala-Leu-Gly-Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu 或 PlO :Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu-Pro-Cys-Leu 或 Pll Leu-Leu-Cys-Ala-IIe-Phe-Ala-Glu-Val 或 P12 :Arg-Leu-Trp-Pro-Thr-Val-Gly-Cys_Leu0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽為九肽，所述九肽的氨基酸序列為P5YLGGTTGPV，或P6YIVGFCLLV，或P7TLTWLFAFV，或P8GLVAGLSAV，或P9ALGMLIAGL，或P10MLIAGLPCL，或P11LLCAIFAEV，或P12RLWPTVGCL。本發(fā)明根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu),采用免疫信息學(xué)手段,運(yùn)用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL1.2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)核耐藥相關(guān)蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，篩選獲得表位肽，鑒定的九肽未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。通過(guò)體外ELISPOT實(shí)驗(yàn)對(duì)表位肽進(jìn)行鑒定，其結(jié)果為研制基于耐藥相關(guān)蛋白抗原的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ),并為設(shè)計(jì)基于混合T細(xì)胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息。
文檔編號(hào)A61K39/04GK102212113SQ20111013864
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者吳亞紅, 朱宇皇, 祁元明, 陳艷平, 陳飛, 韓艷林, 高艷鋒 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)