無/低副作用的抗結(jié)核病藥物復(fù)方的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種無/低副作用的抗結(jié)核病的藥物組合物，其中包含藥學(xué)有效量的選自異煙堿酰胺、立復(fù)霉素、丙基硫異煙酰胺和乙酰胺醇中的一種或多種，以及藥學(xué)有效量的可降低抗結(jié)核病藥物副作用的物質(zhì)。
【專利說明】
無/低副作用的抗結(jié)核病藥物復(fù)方
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種無/低副作用的抗結(jié)核病藥物復(fù)方。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，全球大約有三分之一的人口感染肺結(jié)核，每年約有 八百萬新增病例；而臺灣新登記的肺結(jié)核病患人數(shù)最近幾年也不停爬升，每十萬人口有六 十多人感染肺結(jié)核，但其中只有大約四分之三的人接受完整治療;根據(jù)衛(wèi)生署的統(tǒng)計，臺灣 每天至少有4.2個人死于肺結(jié)核;在這么多接受肺結(jié)核藥物治療的病患中，臨床上最常見的 藥物副作用即為肝毒性和神經(jīng)系統(tǒng)病變(如：聽神經(jīng)和視神經(jīng)病變），其中又以肝毒性最為 常見。再加上臺灣又是B型及C型肝炎的盛行區(qū)，感染肺結(jié)核的肝炎患者也不在少數(shù)，假設(shè)每 年有14，000名新增的肺結(jié)核病患，粗略估計至少有2，000名到3，000名慢性肝病患者需接受 抗結(jié)核藥物治療，因此在這些病患身上所可能發(fā)生的肝毒性是吾人不可忽視的醫(yī)源性疾 病。
[0003] 多數(shù)的第一線抗結(jié)核藥物，例如:異煙堿酰胺(isoniazid，俗稱敵癆克星）、丙基硫 異煙酰胺(pyrazinamide，俗稱敵癆新邁)及立復(fù)霉素(rifampin)等都有導(dǎo)致肝毒性發(fā)生的 潛在不良反應(yīng);其中異煙堿酰胺(isoniazid)是目前最有效的單一抗結(jié)核藥物，也最容易引 起服用者產(chǎn)生肝毒性;在60年代末期陸續(xù)有異煙堿酰胺（isoniazid)造成肝毒性的報告;異 煙堿酰胺(isoniazid)所造成具有臨床癥狀的肝毒性約0.1-1 %，而在10-20%的病患中，則 可觀察到無癥狀的肝功能異常，這些肝功能異常通常于服藥后兩個月內(nèi)發(fā)生。
[0004] 如圖1所示，異煙堿酰胺（isoniazid)在肝臟中主要經(jīng)由氮-乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶0_ acety 1 transf erase，NAT )的幫助而乙?；?，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物乙?；悷焿A酰胺 (acetylisoniazid)迅速被水解成乙酰化聯(lián)胺(acetylhydrazine);乙?；?lián)胺可以再經(jīng)由 氮-乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶（N-acetyl transf erase )被乙?；蔁o毒性的雙乙?；?lián)胺 (diacetylhydrazine)，或者經(jīng)由細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP 450 2E1)氧化成具有肝毒性的分 子，其中包括乙酰化偶氮(acetyldiazene)、乙酰銨離子(acetylonium ion)、乙酰自由基 (acetylradical)、乙稀酮(ketene)等，另外在有氧及NADPH存在時，乙酰化聯(lián)胺會被細(xì)胞色 素 P450 2E1反應(yīng)生成自由基而造成氧化壓力，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；此外，異煙堿酰胺 (isoniazid)亦可經(jīng)由酰胺水解酶(amidase)直接水解成有毒性的聯(lián)胺(hydrazine )，或者 由上述乙酰化聯(lián)胺（acetylhydrazine)經(jīng)酰胺水解酶（ami dase)水解成有毒性的聯(lián)胺 (hydrazine)〇
[0005] 近來有研究顯示，聯(lián)胺(而非異煙堿酰胺或乙?；?lián)胺)是在兔及鼠體內(nèi)造成異煙 堿酰胺引起的肝毒性（INH-induced hepatotoxicity)最可能的主因，研究者認(rèn)為異煙堿酰 胺引起的肝毒性的嚴(yán)重性與血漿中聯(lián)胺的濃度成正相關(guān);1999年Sarich等人的報導(dǎo)則認(rèn)為 對硝基苯酸磷酸二酯(bis-p-nitrophenyl phosphate ,ΒΝΡΡ，為一種酰胺水解酶的抑制劑） 可預(yù)防異煙堿酰胺引起的肝毒性的傷害，其保護(hù)機(jī)制應(yīng)是通過抑制異煙堿酰胺產(chǎn)生聯(lián)胺。
[0006] 細(xì)胞色素 Ρ450 2E1(CYP2E1)在肝臟中會持續(xù)的表現(xiàn)，并負(fù)責(zé)許多異物質(zhì)（如:肝毒 素四氯化碳(CC14)以及乙酰氨酚(acetaminophen))的代謝生物反應(yīng);然而，CYP2E1在異煙 堿酰胺引起的肝毒性中所扮演的角色并不明確，異煙堿酰胺本身即為CYP2E1的一種誘導(dǎo) 物;有些研究認(rèn)為肝臟內(nèi)的CYP2E1與異煙堿酰胺引起的肝毒性的機(jī)制有關(guān)。在體外試驗(yàn)中， 雙硫侖(disulf iram，DSF)及其代謝物二乙基二硫代氨基甲酸（diethyldithiocarbamate) 均被確認(rèn)為老鼠及人類肝臟微粒體CYP2E1的選擇性抑制劑(selective mechanism-based inhibitors)，Brady等人的試驗(yàn)則顯示老鼠服用單一口服劑量的雙硫侖(DSF)后，會造成免 疫反應(yīng)肝容量（immunoreactive hepatic content)以及CYP2E1催化活性快速且完全的下 降。
[0007] Sodhi等人則在1997年的報導(dǎo)指出，氧化壓力是造成幼鼠體內(nèi)異煙堿酰胺及立復(fù) 霉素引起的肝毒性的因素之一。有許多的研究想要找出適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)記(biomarker)以評 估體內(nèi)氧化傷害的速率，目前可能適用的生物標(biāo)記可分為三類，分別為對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核 酸氧化傷害的標(biāo)記；8-異構(gòu)前列腺素？2<1(8-丨8〇11'08七381311(1；[11?2€[，8-丨80-?6?2€[)是一種 自由基引起花生四稀酸(arachidonic acid)發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn) 定，8-is0-PGF2a含量可作為判斷活體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的新指標(biāo)，該脂質(zhì)過氧化反映可能與體 內(nèi)自由基的產(chǎn)生、氧化性的傷害（oxidative damage)及抗氧化劑的缺乏（antioxidant deficiency)有關(guān)；目前有許多方法可用來測量8-is0-PGF2a含量，包括酵素免疫分析法 (enzyme immunoassay)、放射免疫分析法（radioimmunoassay)、氣相層析質(zhì)譜儀（gas-chromatography mass spectrometry)以及液相層析質(zhì)譜儀（1 iquid chromatography mass spectrometry)等;此外，人類尿液中的8_is0-PGF2a及其代謝物2，3-dinor-8_iso-PGF2a含量可利用C18固相萃取(C18 solid phase extraction,SPE)準(zhǔn)備樣品后，再以液相 層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀(LC/MS/MS)分析。
[0008] 利用侵入式及非侵入式方法測試大鼠（rat)肝功能，以監(jiān)測肝損害的發(fā)展以及篩 選肝臟疾病，其中最常使用的方法包含測量血清中的天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶（aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶（alanine aminotransferase，ALT)以及喊性磷酸 酶(alkaline phosphatase)數(shù)值，以及測量肝細(xì)胞產(chǎn)物如：膽紅素（bilirubin)、白蛋白 (albumin)，以及利用量測前凝血素時間（prothrombin time)來檢測凝血因子 (coagulation factors)等;肝功能定量測試是根據(jù)幾乎只經(jīng)過肝臟代謝的受質(zhì)在血清中 的濃度而定，這些受質(zhì)的清除是依肝門靜脈、肝動脈血流量以及由肝細(xì)胞對這些受質(zhì)的作 用而定，肝臟血流量與提供給肝臟的受質(zhì)量有關(guān)，反之，該受質(zhì)的清除則決定于肝臟代謝的 能力。
[0009] 半乳糖(galactose)是一種具有高萃取率(extraction ratio)、90%在肝臟中代 謝的醣類，在肝臟中，半乳糖是由半乳糖激酶(galactokinase)經(jīng)過差向立體異構(gòu)化反應(yīng) (6口；[1]161^231：；[011)，將之轉(zhuǎn)換成1-磷酸葡萄糖(61110086-111108口1^七6) ;半乳糖激酶的作用 反應(yīng)為肝細(xì)胞中半乳糖代謝途徑的速率決定步驟(rate-1 imiting step)。半乳糖的高萃取 率使得依賴肝臟血流量及肝臟功能的半乳糖代謝作用成為檢測肝功能最主要的方式，目前 并無一定的規(guī)則來評估大鼠的殘余肝功能(residual liver function)，量測確切化合物 (如:半乳糖）的代謝能力，可推測肝臟中代謝作用的速率決定步驟，亦可能取得殘余肝功能 的代表數(shù)質(zhì)。
[0010] 以半乳糖清除能力（galactose elimination capacity，GEC)作為人類肝功能定 量測試已行之有年，然而，半乳糖清除能力測試需取得多個血液樣本以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在臨 床應(yīng)用上有其困難度，因此有許多研究使用半乳糖單點(diǎn)法(Galactose Single Point，GSP) 以評估人類肝功能;本發(fā)明發(fā)明人以半乳糖單點(diǎn)法測試慢性肝炎、肝硬化以及肝癌病患，結(jié) 果顯示半乳糖單點(diǎn)法可精確測出這些肝臟疾病;半乳糖單點(diǎn)法已被成功的應(yīng)用到測試肝病 患者排除如丙嗪(promazine)及抗生素頭孢酮(cefoperazone)等藥物的剩余肝功能。此外， 半乳糖單點(diǎn)法已在美國食品藥物管理局(FDA)所出版的指南(Guidance for Industry)中 成為建議采用測試肝功能的方法之一。
[0011]由此可見，上述現(xiàn)有抗結(jié)核藥物異煙堿酰胺(isoniazid)仍有諸多缺失，實(shí)非良好 的設(shè)計，而亟待加以改良。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的即在于提供一種無/低副作用的抗結(jié)核病藥物新復(fù)方藥物組合，內(nèi) 含藥學(xué)有效量的異煙堿酰胺（isoniazid，INH)，或再并用藥學(xué)有效量的立復(fù)霉素 (rifampin，RIF)，或再并用藥學(xué)有效量的丙基硫異煙酰胺(pyrazinamide，PZA)，或再并用 藥學(xué)有效量的乙酰胺醇(Ethambutol，EMB)，或再并用藥學(xué)有效量的其它復(fù)方藥物，合并使 用藥學(xué)有效量的細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑或酰胺水解酶(amidase)抑制劑，以降 低由異煙堿酰胺(INH)所引起的肝毒性等副作用。
[0013]可達(dá)成上述發(fā)明目的的無/低副作用的抗結(jié)核病藥物新復(fù)方，內(nèi)含藥學(xué)有效量的 異煙堿酰胺(isoniazid，INH)，或再并用藥學(xué)有效量的其它復(fù)方藥物，合并使用藥學(xué)有效量 的細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑或酰胺水解酶(amidase)抑制劑，其中CYP2E1抑制劑 或amidase抑制劑選自于下列化合物所組成群組：正二輕愈瘡酸(Nordihydroguaiaretic acid)、（-)_表兒茶素沒食子酸酯（（-)-Epigallocetechin-3-gallate)、茵陳色原酮 (Capillarisin)、山奈HKKaempferol)、根皮素(Phloretin)、橙皮素(Hesperetin)、6_姜辣 醇（6_6；[叫61'01)、沒食子酸（8311；[03(^(1)、異甘草素（180119111'；[1^8611；[11)、柚皮素 (Narigenin)、二氫化槲皮素（（ + )-Taxifolin)、漢黃苳素（Wongonin)、原兒茶酸 (Protocatechuic acid)、兒茶素（（ + )_Catechin)、β_奈黃酮（β-naphthoflavone)、恩貝素 (Embelin)、反式肉桂酸（trans-Cinnamic acid)、表兒茶酸（（-)-Epicatechin)、根皮苷 (Phloridzin)、鯨錯醇聚氧乙稀醚、聚氧乙稀硬脂酸酯、聚氧乙稀月桂醚、聚氧乙稀去乙水 山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、聚乙二 醇PEG 2000、聚乙二醇PEG 400、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLUR0NIC F-68、聚乙二醇PEG 4000、反式肉桂醛（1^3118-(^1111311^1(16117(16)、大豆甘元（03丨(126；[11)、異牡荊素 (Isovitexin)、β-香葉?。é?Myrcene)、懈皮素（Quercetin)、（ + )-梓檬?。ǎ?+ )-Limonene)、 楊梅素(Myricetin)、懈皮(Quercitrin)、木犀草素-7-葡萄糖苷(Luteolin-7-Glucoside)、 桑葉素(101"；[11)、新橙皮苷(此01168?61^(1；[11)、橙皮苷(!168?61^(1；[11)、（-)-表沒食子兒茶素 ((-)-Epigallocatechin)、木犀草素（Luteolin)、金絲桃苷(Hyperoside)、十四燒酸乙酯 (Ethyl Myristate)、怪柳素（Tamarixetin)、黃零素（Baicalein)、蕓香素（Rutin)、黃零 (Baicalin)、序菜素(Apigenin)、（ + )-表兒茶素（（ + )-Epicatechin)、（-)-表兒茶素沒食子 酸酯（（-)^^；^3七6(311；[11-3-83113七6)、水飛薊賓(5；[1713；[11)、牡荊素(>；^61；[11)、金雀異黃酮 (Genistein)、異鼠李素（Isorhamnetin)、香葉木素（Diosmin)、葛根素（Puerarin)、或傘形 花內(nèi)酯(Umbelliferone)、高良姜素(Galangin)、非瑟酮(fisetin)、聚氧乙稀蓖麻油、十二 烷基硫酸鈉、微晶纖維素、二水磷酸氫鈣、甘露醇Manni to 1、聚氧乙烯醚(40)氫化蓖麻油、蔗 糖素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸樹脂Eudragit S100、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、薄荷腦、鄰磺酰苯酰亞胺、羥丙基纖維素、預(yù)膠化淀粉、葡萄糖 結(jié)合劑、檸檬酸、氣相二氧化硅、聚乙二醇PEG 8000、山梨酸、檸檬油、羥丙基纖維素、苯甲酸 鈉、乙酰磺胺酸鉀、羥丙基甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、甲基纖維素、環(huán)己氨基磺酸鈉、 乳糖單水合物、麥芽糖糊精、甘油二十二烷酸酯、氧化鐵紅、單硬脂酸甘油酯、共聚維酮K28、 淀粉乙酸酯、硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、聚維酮K-30、苯甲醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基 苯甲酸丙酯、聚乙二醇硬脂酸酯15、丁基羥基茴香醚。
[0014] 更進(jìn)一步，本發(fā)明的無/低副作用的抗結(jié)核病藥物新復(fù)方包括藥學(xué)有效量的丙基 硫異煙酰胺(PZA)，或再并用藥學(xué)有效量的其它復(fù)方藥物，合并使用藥學(xué)有效量的酰胺水解 酶（amidase )抑制劑，其中amidase抑制劑選自于下列化合物所組成群組：懈皮素 (Quercetin)、高良姜素（Galangin)、桑葉素(Morin)、非瑟酮(fisetin)、異甘草素、楊梅素 (Myricetin)、木犀草素(Luteolin)、山奈酸(Kaempferol)、茵陳色原酮(Capillarisin)、聚 氧乙烯蓖麻油、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯去乙水山梨醇單月桂酸酯、鯨蠟醇聚氧乙烯醚， 以降低由丙基硫異煙酰胺(PZA)所引起的肝毒性等副作用。
[0015] 本發(fā)明所提供的無/低副作用的抗結(jié)核病藥物新復(fù)方，亦可加入藥學(xué)上可接受的 賦形劑至該復(fù)方，該賦形劑可為稀釋劑、填充劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑等，例如:聚氧乙烯 去乙水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸 酯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、聚氧乙烯月桂醚、鯨蠟醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLUR0NIC F-68、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLUR0NIC F-127、聚乙 二醇PEG 400、聚乙二醇PEG 2000、聚乙二醇PEG 4000、山梨醇酐單硬脂酸酯、山梨醇酐單油 酸酯、S-40聚氧乙烯(40)單硬脂酸酯、聚乙二醇PEG 8000、乙酰氨基磺酸鉀、氣相二氧化硅、 膠態(tài)二氧化硅、丁基羥基茴香醚、玉米淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、二 水磷酸氫鈣、乙二胺四乙酸二鈉、乳糖、乳糖單水合物、乳糖S.G、低取代羥丙基纖維素、麥芽 糖糊精、甘露醇Mannitol、薄荷腦、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、瓜 爾膠、黃原膠、預(yù)膠化淀粉、聚維酮K-30、羧甲基淀粉鈉、十二烷基硫酸鈉、蔗糖素、聚乙二醇 硬脂酸酯15、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯醚(40)氫化蓖麻油、環(huán)己氨基磺酸鈉、聚維酮K90F、 氧化鐵紅、羥丙基甲基纖維素、櫻桃、檸檬油、山梨酸、苯甲醇、甘草素、苯甲酸鈉、淀粉乙酸 酯、梓檬酸、山梨糖醇、膜衣Opadry white、葡萄糖結(jié)合劑、硬脂酸鎂、褐藻酸、丙稀酸樹脂 E90、丙烯酸樹脂E、甘油二十二烷酸酯、月桂酸聚乙二醇甘油酯、共聚維酮K-28、氫氯酸、羥 乙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、丙烯酸樹脂100、麥芽糖、丙烯酸樹脂S100、聚 乙二醇PEG 1450、共聚維酮K-90、磷酸85%、聚氧乙烯醚-40氫化蓖麻油(RH 40)、聚氧乙烯 (35)蓖麻油(EL 35)、磷酸二氫鈉、蔗糖素、枸櫞酸三乙酯、檸檬酸三鈉或其余列于美國Π)Α Generally Recognized as Safe(GRAS)中的常用成分。
[0016] 本發(fā)明發(fā)明人鑒于現(xiàn)有抗結(jié)核藥物異煙堿酰胺（isoniazid)所導(dǎo)致肝毒性等副作 用的缺點(diǎn)，以及承襲本實(shí)驗(yàn)室先前專利案(低副作用的INH新復(fù)方，案號096101545)及(含異 煙堿酰胺（Isoniazid，INH)的低副作用新復(fù)方(2)，案號097141522)的發(fā)明。另外，在本發(fā)明 發(fā)明人先前專利申請案，PCT申請案號PCT/CS2008/001353(低副作用的異煙堿酰胺新復(fù)方） 發(fā)明中，雖已揭示INH單方并用部分本實(shí)驗(yàn)室揭露的CYP2E1抑制劑的藥學(xué)組合物，可降低 INH所導(dǎo)致肝毒性等副作用，但后續(xù)發(fā)明人的研究，發(fā)現(xiàn)并不是任意的劑量組合都可以于體 內(nèi)達(dá)到去除INH肝毒性的效果，例如，在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠每日合并使用山奈酚 (1^611^^6仍1)3.781^/1^與1順/1?正50/10〇1^/1^腹腔注射持續(xù)3周，可顯著抑制1順?biāo)鶎?dǎo)致 的肝毒性，控制組（INH/RIF 50/100mg/kg)的相關(guān)肝功能指針GOT、GPT和GSP值為571 土 295U/L、364 ± 192U/L 和 866 ± 339mg/L，而并用山奈酚 3 · 78mg/kg 組的 GOT 值則為 89 ± 19U/L、 48 ± 211VL和245 ± 98mg/L，接近正常值，然而山奈酚使用劑量調(diào)整為1.89mg/kg后，各項(xiàng)相 關(guān)肝功能指針相較于控制組所下降的幅度均未達(dá)并用山奈酚3.78mg/kg所獲得的成效。由 以上動物試驗(yàn)結(jié)果可知當(dāng)合并使用CYP2E1抑制劑時，對INH所導(dǎo)致肝毒性確實(shí)具有改善效 果，但必須限定其使用劑量，因此基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明著重于抑制劑使用劑量的決定。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0018] 1.本發(fā)明所提供的含異煙堿酰胺（IS〇niazid，INH)的無/低副作用新復(fù)方，與單獨(dú) 使用異煙堿酰胺（INH)，異煙堿酰胺（INH)和/或立復(fù)霉素（rifampin，RIF)、異煙堿酰胺 (INH)和/或丙基硫異煙酰胺（pyrazinamide ,ΡΖΑ)的試驗(yàn)結(jié)果相互比較時，在生化分析 (ALT、AST值）、病理學(xué)分析、剩余肝功能的量測(GSP值、GEC值）以及氧化壓力的指標(biāo)(血漿中 8-is〇-PGF2a的濃度)等各方面的分析結(jié)果，都有明顯減少使用異煙堿酰胺(INH)所造成的肝 毒性副作用的功效。
[0019] 2.本發(fā)明所提供的含異煙堿酰胺（IS〇niazid，INH)的無/低副作用新復(fù)方，其中亦 提供可作為細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑或酰胺水解酶(amidase)抑制劑的中藥藥 弓丨，相較現(xiàn)有細(xì)胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制劑或酰胺水解酶(amidase)抑制劑，本發(fā)明所 提供者是從天然中藥藥引萃取，無生理、化學(xué)毒性，且對于人類肝臟的細(xì)胞色素 P450 2E1活 性有明顯的抑制活性。
【附圖說明】
[0020] 圖1為異煙堿酰胺(INH)在肝臟中的代謝途徑圖；
[0021] 圖2為對照組、INH組、BNPP-INH組、DSF-INH組以及BNPP-DSF-INH組大鼠，天門冬氨 酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性分析，數(shù)值的計算為mean±SD，*表示各試驗(yàn)組與 對照組比較后P〈〇. 05者；
[0022]圖3為對照組（圖3A及C)與INH組（圖3B及D)大鼠肝臟切片：圖3A，對照組相對正常 肝組織的型態(tài)(HE染色，400X);圖3B，INH組在周圍中央靜脈(V)的肝細(xì)胞呈現(xiàn)碎裂及空泡化 (HE染色，400X);圖3C，以電子顯微鏡檢視對照組大鼠肝切片，Nu:細(xì)胞核(9,000X);圖3D，以 電子顯微鏡檢視INH組大鼠肝切片，相較于圖3C對照組的肝細(xì)胞切片，INH組大鼠肝細(xì)胞的 粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rER)明顯增加，Nu:細(xì)胞核(9,000X);
[0023] 圖4為8-is〇-PGF2a-d4(A)與8-is〇-PGF2a(B)的分子結(jié)構(gòu)以及子離子光譜；
[0024]圖5為含有250pg 8-is〇-PGF2a-d4(A)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、含有 100pg 8-is〇-PGF2a(B) 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與空白樣本(C)，在多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)偵測下的液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀 (LC/MS/MS)色譜，質(zhì)荷比(m/z)357/197以及質(zhì)荷比(m/z)353/193的離子偶（ion pairs)分 別被用來監(jiān)測8-is〇-PGF2a-d4(A)(作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品）以及8-is〇-PGF 2a(B)(作為標(biāo)準(zhǔn)品）；波峰 1:空白血漿;波峰2:注入標(biāo)準(zhǔn)品的空白血漿；
[0025] 圖6為對照組、INH組、BNPP-INH組、DSF-INH組以及BNPP-DSF-INH組大鼠血漿中8-is〇-PGF 2a的濃度，數(shù)值的計算為mean 土 SD，*表示試驗(yàn)組與對照組比較后P〈0.001者;#表示 各試驗(yàn)組與INH組比較后P〈0.05者。
[0026] 圖7為對照組、INH組、BNPP-INH組、DSF-INH組以及BNPP-DSF-INH組大鼠半乳糖單 點(diǎn)法(GSP)值，數(shù)值的計算為mean 土 SD，*表示試驗(yàn)組與對照組比較后P〈0.001者;#表示各試 驗(yàn)組與INH組比較后P〈0.001者嚴(yán)表示各試驗(yàn)組與INH組比較后P〈0.005者；
[0027] 圖8為對照組、INH組、BNPP-INH組、DSF-INH組以及BNPP-DSF-INH組大鼠半乳糖清 除能力(GEC)值，數(shù)值的計算為mean土SD，*表示試驗(yàn)組與對照組比較后P〈0.001者; #表示各 試驗(yàn)組與INH組比較后P〈0.005者嚴(yán)表示各試驗(yàn)組與INH組比較后P〈0.05者；
[0028] 圖9為對照組、INH組、BNPP-INH組、DSF-INH組以及BNPP-DSF-INH組各組半乳糖單 點(diǎn)法(GSP)值與血漿中8-is〇-PGF 2a的濃度具有高度相關(guān)的統(tǒng)計圖；
[0029] 圖10為對照組、INH組、BNPP-INH組、DSF-INH組以及BNPP-DSF-INH組各組半乳糖單 點(diǎn)法(GSP)值與半乳糖清除能力(GEC)值具有高度相關(guān)的統(tǒng)計圖；
[0030] 圖11為對照組、PZA組、BNPP-PZA組及BNPP組大鼠，天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨 酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性分析，數(shù)值的計算為mean土SD，*表示各試驗(yàn)組與對照組比較后P〈0.05 者；
[0031] 圖12為對照組（圖12A)與PZA組（圖12B)大鼠肝臟切片：圖12A，對照組相對正常肝 組織的型態(tài)(HE染色，400X);圖12B，PZA組在周圍中央靜脈(V)的肝細(xì)胞呈現(xiàn)碎裂及空泡化 (Η E染色，400X);
[0032]圖13為PZA組、BNPP-PZA組大鼠半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值，數(shù)值的計算為mean 土 SD;
[0033] 圖 14 為對照組、INH-RIF 組、INH-RIF-PZA 組、Kaempferol-INH-RIF 組、Quercetin-INH-RIF組、Kaempferol-INH-RIF-PZA組及Quercetin-INH-RIF-PZA組小鼠，天門冬氨酸轉(zhuǎn) 胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性分析，數(shù)值的計算為mean 土 SD;
[0034] 圖 15 為對照組、INH-RIF 組、INH-RIF-PZA 組、Kaempferol-INH-RIF 組、Quercetin-INH-RIF 組、Kaempferol-INH-RIF-PZA組及Quercetin-INH-RIF-PZA組小鼠半乳糖單點(diǎn)法 (GSP)值，數(shù)值的計算為mean ± SD;
[0035] 圖 16 為空白對照組(A)、INH-RIF-PZA 控制組（B)、Quercetin-INH-RIF-PZA 組（C)、 Kaempf erol-INH-RIF-PZA組(D)，于實(shí)驗(yàn)3周小鼠肝臟切片；
[0036] 圖 17 為空白對照組（A)、INH-RIF 控制組（B)、Quercetin-INH-RIF 組（C)、 Kaempferol-INH-RIF組(D)，于實(shí)驗(yàn)3周小鼠肝臟切片；
[0037] 圖 18 為對照組(A)、INH-RIF 組(B)、MH-INH-RIF 組（C)、MM-INH-RIF(D)組及 ML-INH-RIF組(E)，于實(shí)驗(yàn)3周小鼠肝臟切片；
[0038] 圖 19為Chiorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone 于健康受試者血中濃度圖；實(shí)心方塊為Rifamate控制組，給予Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate(INH/RIF 150/300mg);空心圓形為 HUCHE033 實(shí)驗(yàn)組，給予 Chlorzoxazone(500mg) +Rifamate(INH/RIF 150/300mg)+甘露醇Mannitol lOOrng;
[0039] 圖20為Chiorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone 于健康受試者血中濃度圖；實(shí)心方塊為Rif amate控制組，給予Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate(INH/RIF 150/300mg);空心圓形為 HUCHE033 實(shí)驗(yàn)組，給予 Chlorzoxazone(500mg) +Rifamate(INH/RIF 150/300mg)+甘露醇Mannitol lOOmg。
【具體實(shí)施方式】
[0040]本發(fā)明將就下列實(shí)施例作進(jìn)一步說明，然該等實(shí)施例僅為例示說明之用，而不應(yīng) 被解釋為實(shí)施本發(fā)明的限制。
[0041 ] 實(shí)施例1異煙堿酰胺（INH)合并使用CYP2E1抑制劑雙硫侖(DSF)及/或硝基苯酚磷 酸二酯(BNPP)的動物試驗(yàn) [0042] 一、材料與方法 [0043] 1.試驗(yàn)材料
[0044] 所有的有機(jī)溶劑均為HPLC等級，購自Tedia有限公司（Fairfield，OH，USA)，INH， 8陬？，03?以及玉米油則購自3丨8!11&化學(xué)公司（3七丄〇11丨8，10 1^六），8-丨8〇-?6?2〇1以及放射線標(biāo) 定的8-is〇-PGF2a-d4則得自Cayman化學(xué)公司(Ann Arbor，MI，USA)，半乳糖注射溶液由南光 化學(xué)制藥股份有限公司制備，是將400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有適當(dāng)緩沖溶液系統(tǒng) 以及等張鹽類的蒸餾水中，供作注射使用。
[0045] 2.試驗(yàn)動物
[0046] 體重為320-350公克的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠購自國家實(shí)驗(yàn)動物中心（臺 灣），動物實(shí)驗(yàn)是遵照國衛(wèi)院動物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行，所有的大鼠均置于空氣/濕度調(diào)節(jié)環(huán)境下， 光照與黑暗各12小時，水及飼料的供給不限，在試驗(yàn)期間大鼠體重均持續(xù)監(jiān)測，所有的大鼠 均以使用50毫克/公斤體重劑量的戊巴比妥鈉 （sodium pentobarbital)進(jìn)行腹腔麻醉 (in trap eritoneal ly anesthetized)，將聚乙稀導(dǎo)管置于大鼠右頸內(nèi)靜脈（internal jugular vein)內(nèi)以施打半乳糖，導(dǎo)管以切入穿刺(cut-down technique)插入，該導(dǎo)管的末 端置于大鼠頸后切口的皮膚下方，手術(shù)完成后，恢復(fù)期間使大鼠禁食一夜(約16小時），但水 分照常供給。
[0047] 3.試驗(yàn)處理
[0048] 試驗(yàn)動物隨機(jī)分成5組，每組包括3種處理，第一種處理為注射25mg/kg BNPP或 BNPP的基劑(vehicle，VEHl，即食鹽水），BNPP溶于加熱至60°C的食鹽水(0.9%NaCl)，冷卻 后以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至大鼠體內(nèi)；第二種處理為則注射100mg/kg DSF或DSF 的基劑(VEH2,即玉米油），DSF溶于玉米油中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至大鼠體內(nèi)； 第三種處理為注射150mg/kg INH或INH的基劑（VEH3,即食鹽水），INH溶于食鹽水（0.9% NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至大鼠體內(nèi)；第一組(BNPP或VEH1)較第三組（INH 或VEH3)早30分鐘處理，第二組(DSF或VEH2)比第三組（INH或VEH3)早15分鐘處理。
[0049] 上述5組試驗(yàn)共包含：
[0050] (1)對照組（normal control group,NC，n = 12):正常的大鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2以及VEH3 (施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0051 ] (2)INH組（INH，η = 7):正常的大鼠每天注射1次INH、VEH1以及VEH2(施行腹腔內(nèi)注 射)共21天；
[0052] (3)ΒΝΡΡ-ΙΝΗ 組（ΒΝΡΡ-ΙΝΗ，η = 7):正常的大鼠每天注射 1 次 ΒΝΡΡ、ΙΝΗ 以及 VEH2(施 行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0053] (4)DSF-INH組(DSF-INH，n = 7):正常的大鼠每天注射1次DSF、INH以及VEH1 (施行 腹腔內(nèi)注射)共21天；以及
[0054] (5)BNPP-DSF-INH組（BNPP-DSF-INH，η = 7):正常的大鼠每天注射 1 次BNPP、DSF以 及ΙΝΗ(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0055] 半乳糖單點(diǎn)法于第21天處理后16小時進(jìn)行測試。
[0056] 4.血液樣本
[0057] 處理完畢后，大鼠以乙醚麻醉犧牲，血液由大鼠背部主動脈抽取，置于含有EDTA的 試管中，血漿（plasma)以13,000g于4°C離心15分鐘，分離后的血漿分裝到微量小管 (Eppendorf tube)中并置于_80°C中儲存。
[0058] 5.生化分析
[0059] 肝細(xì)胞損傷以量測血漿中天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性以 進(jìn)行定量，AST與ALT活性是肝臟毒性常用的指標(biāo)，以Synchron LXi 725系統(tǒng)來量測 (Beckman Instruments，美國）。
[0000] 6.光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡
[0061] 大鼠犧牲后肝臟隨即進(jìn)行組織學(xué)分析;肝臟樣本以10%磷酸緩沖液配制的福爾馬 林(phosphate-buffered formalin)固定，隨后脫水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片樣本以蘇木精（hematoxylin)與伊紅（eosin)染色，并進(jìn)行肝糖染色試驗(yàn) (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察；另外，肝臟切 片以二甲胂緩沖液（〇&(3 〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化鋨水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小時，以酒精連續(xù)脫水后包埋于Spurr樹脂（Spurr resin)中，并以鉆石刀切取超薄切片，以醋酸鈾酰（uranyl acetate)及梓檬酸鉛（lead citrate)作雙重染色，并以穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）觀察。
[0062] 7.8-is〇-PGF2a 的萃取與量測
[0063]所有PGF2cc的同分異構(gòu)物（isomers)均以適當(dāng)體積的酒精溶解或稀釋以制備原液， 并分裝于小管中儲存于-70°C，取0.5ml血衆(zhòng)至玻璃管中，加入10ng內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品（internal standard,即8-is〇-PGF2a-cU)，混勾后的血衆(zhòng)以C18固相萃取管柱（Solid-Phase Extraction cartridge,J.T.Baker，MA,美國）純化，樣本流洗液以氮?dú)庹舭l(fā)干燥后，以50μ1 乙睛:水(&〇6切11丨廿丨16 :冊七6115:85￥八)溶液回溶并震蕩30秒，取1(^1回溶后的萃取物注 射至LC/MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。
[0064] 8.液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀(LC/MS/MS)分析
[0065] HPLC系統(tǒng)包括2個島津LC-10ADvP栗（Shimadzu LC-10ADvP pumps)、l個島津系統(tǒng) 控制器（Shimadzu system control)以及 1 個島津自動樣本機(jī)（Shimadzu autosampler)(島 津科學(xué)儀器，日本），以C18管柱(顆粒大小5-μπι，內(nèi)徑50X2.1mm)進(jìn)行HPLC分離，并使用含有 2mM醋酸銨（ammonium acetate)及乙睛（acetonitrile，ACN)之梯度流洗液（t = 0min，15% ACN; t = 6min，70%ACN; t = 7min，90%ACN; t = 8min，90%ACN; t = 8 · 5min，15%ACN)流洗， LC/MS/MS的流速均維持在200μ1/π?η，整個HPLC進(jìn)行時間為13.5分鐘;該HPLC系統(tǒng)與一三層 四極質(zhì)譜儀（triple stage quadrupo 1 e mass spectrometer,AP13000,Applied Biosystem,Foster City,CA,美國）介接，配備有TurboIonSpray離子源（TurboIonSpray ionization source)，并使用負(fù)電電噴霧（negative electrospray)作為電離 (ionization)的方法；該質(zhì)譜儀通過擴(kuò)散200 ng/ml 8-is〇-PGF2a或8-is〇-PGF2a-d4標(biāo)準(zhǔn) 液以多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進(jìn)行最佳化，m/z 353/193 以及m/z 357/197離子偶（ion pair)則個別用來監(jiān)測8-is〇-PGF2a以及8-is〇-PGF2a-d4;測 量后，計算6個8_iso_PGF2a濃度(C)的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線（linear calibration curve)對8-iso_PGF2a 比 8-is〇-PGF2a-cU比值的區(qū)域（Y)，得到相關(guān)系數(shù)（r, correlation coeff icient)值為0.999;血漿中8-is〇-PGF2a的線性范圍在〇. 1-2.5ng/ml之間，其回歸方 程式(regression equation)為Y = -〇 .0517C+0.823ng/ml;所測得的結(jié)果均對照重氫化8-iso_PGF2a(deuterated 8-iso_PGF2a)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品計算，標(biāo)準(zhǔn)曲線的批間精密度以及準(zhǔn)確度 是以標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品分別測試6次后，經(jīng)由反向計算法(Back-Calculation)來評估，其相對誤 差(relative errors)范圍在-5.06%至3.13%之間。
[0066] 9.肝功能的定量測試
[0067]所有的大鼠均進(jìn)行半乳糖單點(diǎn)法(GSP)及半乳糖清除能力(GEC)測試，大鼠接受在 30秒內(nèi)的快速靜脈注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后5、10、15、30、45以 及60分鐘各采血一次，血液樣本取自尾部靜脈；以半乳糖脫氫酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量測半乳糖含量，測試濃度范圍為50至1，000μg/ml，每個濃度 的日內(nèi)差異(within-day variation)由標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation)以及變異系數(shù) (coefficient of variation,CV)百分比計算，最大容許的變異系數(shù)為10%CV;日間差異 (day-to-day variation)則由比較校正曲線（calibration curves)的斜率及截距來檢驗(yàn)； 半乳糖清除能力(GEC)由下列公式計算，該公式是由Tygstrup's方程式修改而來：
[0069] 其中D為半乳糖注射量;Tc=o為半乳糖濃度達(dá)到0所需要的時間，是由注射(通常為 2.22mmol/l)后20至60分鐘的血液濃度-時間曲線的線性回歸推得;7為依經(jīng)驗(yàn)法則修正體 內(nèi)不均勻分布的校正值;半乳糖單點(diǎn)法(GSP)則為30秒注射停止后60分鐘時血液中半乳糖 濃度。
[0070] 10.統(tǒng)計分析
[0071] 所有的數(shù)據(jù)皆以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)表示，試驗(yàn)結(jié)果以單因子變異數(shù)分析 (AN0VA)測試法來計算是否具有統(tǒng)計上的顯著差異，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)軟件包來計算；隨后使用事后比較 (post hoc test)最小差異顯著性（least significant difference)方法做多重比較，以 確認(rèn)族群間的顯著差異;族群平均的顯著差異為P〈〇. 05。
[0072] 二、結(jié)果
[0073] 1.生化分析結(jié)果
[0074]試驗(yàn)結(jié)束時，測量試驗(yàn)動物的體重及相對肝重量，與對照組動物相較之下并無顯 著差異;生化分析結(jié)果如圖2所示，只有INH組血漿中的天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn) 胺酶(ALT)活性明顯高于對照組(對照組血漿中的AST活性為116 ± 11IU/L; INH組血漿中的 AST活性為129±1011]/1，？〈0.05;對照組血漿中的厶1^活性為44±611]/1;1順組血漿中的八1^ 活性為52±3IU/L，p〈0.05)，顯示INH組產(chǎn)生生化上的肝損傷;對照組、BNPP-INH、DSF-INH以 及BNPP-DSF-INH組血清中轉(zhuǎn)胺酶濃度則為正常。
[0075] 2.組織病理學(xué)
[0076]經(jīng)過為期三周施行腹腔注射150mg/kg/day INH的大鼠，其體內(nèi)成功的產(chǎn)生肝毒 性;相對的，在對照組大鼠體內(nèi)的肝結(jié)構(gòu)則較正常，如圖3A所示，對照組大鼠肝實(shí)質(zhì)（liver parenchyma)內(nèi)的肝細(xì)胞系排列于自肝小葉中央靜脈輻射排列的網(wǎng)狀平板內(nèi)，肝血竇 (hepatic sinusoids)則在兩肝板(anastomosing plates)之間被發(fā)現(xiàn)；INH組大鼠的組織 切片則如圖3B所示，INH組大鼠中央靜脈周圍的肝細(xì)胞則呈現(xiàn)碎裂及空泡化，然而并無看到 肝細(xì)胞壞死(necrosis)的征兆；以電子顯微鏡觀察的結(jié)果顯示，相較于對照組（如圖3C所 示），INH組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)的粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（rER)明顯增加(如圖3D所示）。根據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)，INH是一 個強(qiáng)效的細(xì)胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)的誘導(dǎo)物，而CYP2E1會導(dǎo)致超氧基（superoxide)以及 氫氧自由基(hydroxyl radicals)的產(chǎn)生，并且會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的增加，因此本試驗(yàn)的結(jié)果與 先前研究相符。而其它試驗(yàn)組:BNPP-INH組、DSF-INH組、BNPP-DSF-INH組大鼠的肝損害程度 與對照組相較，并無明顯區(qū)別（未顯示結(jié)果）。
[0077] 3 ·血液樣本中8-i so_PGF2a的量測
[0078] 在負(fù)電電噴霧模式下，8_iso_PGF2a最大量的分子離子為質(zhì)荷比(m/z)353的離子， 8-is〇-PGF2a-d4最大量的分子離子為質(zhì)荷比(m/z)357的離子，這些負(fù)電荷分子離子經(jīng)過大 量碰撞誘導(dǎo)而產(chǎn)生游離，這兩個目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)生的離子光譜如圖4所示;除 了 8_i s〇-PGF2a_d4的子離子(daughter ions)恒較8_i so_PGF2a的子離子高四個單位之外，8-iso_PGF2a以及8_is〇-PGF2a_d4兩者的碎裂模式（fragmentation patterns)很相似，這顯示 大多數(shù)穩(wěn)定的子離子是由A鏈產(chǎn)生而來，該A鏈上標(biāo)示有4個氖原子(deuterium atoms) ;8_ is〇-PGF2a最密集的子離子為質(zhì)荷比(m/z)193的離子，8-is〇-PGF2a-d4最密集的子離子為質(zhì) 荷比（m/z)197之離子。圖5所示為在多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)偵測下，含有100pg 8-iso-PGF2a與250pg/ml 8-is〇-PGF2a-d4的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及血液樣本的典型LC/MS/MS色譜，在注入 lng 8-is〇-PGF2a-d4作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品后，該標(biāo)準(zhǔn)溶液與該血液樣本均經(jīng)過相同的固相萃取 (SPE)純化，并以前述LC/MS/MS規(guī)程分析。
[0079] 4.血漿中 8-i so-PGF2a的濃度
[0080] 血衆(zhòng)中的8-is〇-PGF2a是一種氧化壓力(oxidative stress)的指標(biāo)，如圖6所示，相 較于對照組，INH組大鼠血漿中8-i s〇-PGF2a的濃度明顯增加（INH組大鼠血漿中8-i s〇-PGF2a 的濃度為151±26pg/ml;對照組大鼠血漿中8-is〇-PGF2a的濃度為110±15pg/ml，p〈0.001); 與INH組相較，BNPP-INH組、DSF-INH組、BNPP-DSF-INH組三組則明顯降低由INH引起肝臟的 8-is〇-PGF2a 產(chǎn)生（BNPP-INH 組大鼠血漿中 8-is〇-PGF2c^濃度為 128±29pg/ml;DSF-INH 組 大鼠血漿中8-is〇-PGF2a的濃度為126±2(^8/1111;8陬？-〇5?-1順組大鼠血漿中8-丨8〇-?6卩2〇 1 的濃度為 123±17pg/ml;INH 組大鼠血漿中 8-is〇-PGF2a 的濃度為 151±26pg/ml，p〈0.005); 值得注意的是，對照組、BNPP-INH組、DSF-INH組、BNPP-DSF-INH組四組之間，大鼠血漿中8-is〇-PGF 2a的濃度無顯著差異，與BNPP-INH組及DSF-INH組相較，INH合并施用BNPP與DSF并不 會進(jìn)一步減少血漿中8-is〇-PGF 24^濃度。
[0081 ] 5.剩余肝功能的量測
[0082]如圖7所示，對照組與INH組大鼠的半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值具有高度的顯著差異(對 照組大鼠的GSP值為384 ± 69μg/ml; INH組大鼠的GSP值為565 ± 87μg/ml，p〈0 · 001)，此外， BNPP-INH 組、DSF-INH 組、BNPP-DSF-INH 組大鼠之 GSP 值各為 401 ± 70μg/ml、449 ± 45μg/ml、 388 ± 53μg/ml，與INH組相較，BNPP-INH組、DSF-INH組、BNPP-DSF-INH組大鼠的GSP值各與 INH組大鼠具有高度的顯著差異(其p值各為p〈0.001，p〈0.005，and p〈0.001);單獨(dú)施用INH 的大鼠的GSP值明顯增加;然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP與DSF的大鼠則可抵抗這 種改變;另一方面，與DSF-INH組相較，INH合并施用BNPP與DSF顯示可以降低INH引起的肝毒 性，雖然兩者之間的差異未達(dá)到統(tǒng)計上的差異(p = 〇. 1)，而對照組、BNPP-INH組、DSF-INH 組、BNPP-DSF-INH組四組之間大鼠的GSP值無顯著差異存在。
[0083]相似的結(jié)果在使用半乳糖清除能力(GEC)方法上也可觀察的到，如圖8所示，與對 照組相較，INH組大鼠的GEC值明顯減少（INH組大鼠的GEC值為3.4±0.6mg/min.kg;對照組 大鼠的GEC值為4 · 9 ± 0 · 8mg/min · kg，p〈0 · 001)，此外，BNPP-INH組、DSF-INH組、BNPP-DSF-INH 組大鼠的 GEC 值各為4 · 5 ± 0 · 6mg/min.kg、4.3±0.4mg/min · kg、4 · 7 ± 0 · 5mg/min · kg;與 INH組相較，BNPP-INH組、DSF-INH組、BNPP-DSF-INH組大鼠的GEC值各與INH組大鼠具有高度 的顯著差異(其P值各為p〈〇. 005，p〈0.05，and p〈0.005);單獨(dú)施用INH的大鼠之GEC值明顯 減少;然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP與DSF的大鼠則可恢復(fù)這種改變;與DSF-INH組 相較，INH合并施用BNPP與DSF者有增加 GEC值的傾向（DSF-INH組與BNPP-DSF-INH組大鼠的 GEC值各為4 · 3 ± 0 · 4mg/min · kg、4 · 7 ± 0 · 5mg/min · kg，p = 0 · 29);此外，對照組、BNPP-INH組、 DSF-INH組、BNPP-DSF-INH組四組之間大鼠的GEC值無顯著差異存在。
[0084] 為了確定AST、ALT、血漿中8-is〇-PGF2a的濃度，以及定量肝功能測試(如:GSP以及 GEC)是否相關(guān)，以數(shù)種相關(guān)分析計算后，發(fā)現(xiàn)GSP值與血漿中8-is〇-PGF2a的濃度具有高度相 關(guān)（如圖9所示），相關(guān)系數(shù)為0.836;GSP值與GEC值具有高度相關(guān)(如圖10所示）（p〈0.001)， 相關(guān)系數(shù)為-0.822;GEC值也與血漿中8-i SO-PGF2α的濃度具有高度相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為-0.743，p〈0.001，如表l所示）；而GSP值、GEC值以及血漿中8-iso-PGF 2α的濃度則與AST及ALT 均無明顯相關(guān)(如表1所示）。
[0085] 表1、GSP、GEC以及8-is〇-PGF2a與生化測試的相關(guān)性
[0086]
[0087] 以皮爾森氏相關(guān)系數(shù)(Pearson's correlation coefficient)作為統(tǒng)計計算，*p〈 0.001
[0088] 實(shí)施例2細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選-
[0089] cDNA合成微粒體細(xì)胞色素 P450 2E1。
[0090] 一、材料與方法
[0091] 1.試驗(yàn)材料
[0092] 本實(shí)施例是使用細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選套組（CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit,BD Bioscience,美國）針對22種中藥藥引及 10種 賦形劑進(jìn)行細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選;該CYP2E1抑制劑的篩選套組的作用 原理為：在含有細(xì)胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)以及其熒旋旋光性受質(zhì)1?以7,6認(rèn)(^7-4-trifluoromethyl coumarin)的環(huán)境下加入測試樣品作用后，再偵測CYP2E1代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 HFC(7-Hydroxy-4_trifluoromethyl coumarin)的生成量，并以對照組（(3〇11奸〇1)的耶〇生 成量為基準(zhǔn)，計算測試樣品的CYP 2E1抑制率。
[0093] 各測試樣品均溶于乙腈(acentoitrile)，測試不同濃度的中藥藥引（66μΜ，33μΜ， 16.5μM)及賦形劑(0.167%，0.08%，0.042%，w/v)對CYP2El的抑制率，所測試的中藥藥引 及結(jié)果如表3所列，所測試的賦形劑及結(jié)果如表4所列。
[0094] 另外，本實(shí)施例使用的細(xì)胞色素 Ρ450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選套組（CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit，BD Bioscience，美國）所需的藥劑如下：
[0095] (1)CYP2E1+P450 Reductase+Cytochrome b5：100 mM potassium phosphate(pH 7.4)含有1.3醒〇1?450以及口-附奸〇口11611〇1水解酶。
[0096] (2)Control Protein: 15 mg/mL Control Protein溶于 100 mM Potassium Phosphate(pH 7.4)中。
[0097] (3)Buffer Solution：0.5M Potassium Phosphate(pH 7.4)〇
[0098] (4)Stop Solution:0.5M Tris Base。
[0099] (5)Cofactors:含有1.3mM NADP+、66mM MgCl2以及66mM Glucose 6_Phosphate〇
[0100] (6)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase:40 units/ml溶于5mM Sodium Citrate Buffer(pH 7.5)〇
[0101] (7)MFC(7-Methoxy-4_trifluoromethyl coumar in ):焚旋旋光性受質(zhì) (fluorescence substrate)，50mM MFC溶于乙臆(acetonitrile) 〇
[0102] (8)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid):CYP2E1選擇性抑制劑（陽性對照組）， 20mM DDTC溶于乙臆(acentoitrile)。
[0103] (9)HFC(7-Hydroxy-4-trifluoromethy 1 coumarin): CYP2E1代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 (metabolite standard)，。.25 mM HFC溶于0.1M Tris(pH 9.0)。
[0104] (10)NADPH_Cofactor Mix:于 14 · 56ml無菌水中加入187 · 5μ1 Cofactors、150μ1 G6PDH(Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及 100μ1 Control Protein〇
[0105] (ll)Cofactor/acetonitrile mix:于9.93ml NADPH-Cofactor Mix中加入66μ1 Acetonitrile〇
[0106] (12)Enzyme/Substrate Mix:于4ml Buffer Soultion中加入5.94ml無菌水、50μ1 HTS-706 (CYP2E1 ,2μΜ P450 content)以及28μ1 50 mM MFC ( 7-Me thoxy-4-trif luoromethyl coumarin，焚方定方定光性受質(zhì)）。
[0107] 2.細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選
[0108] 使用細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選套組（CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit，BD Bioscience，美國）進(jìn)行中藥藥引及賦形劑的篩選，實(shí)驗(yàn)步 驟如下所述：
[0109] (1)制備對照組：
[0110] a.于96孔盤上第 1 孔井(well)內(nèi)加入 149μ1 NADPH-Cofactor Mix以及ΙμL 20mM DDTC并混合均勻；
[0111] b.于該96孔盤上第2至 12孔井內(nèi)各加入100μΙ Cofactor/acetonitrile mix，第 1 至8孔井為陽性對照組(positive control);第9與第10孔井為對照組(control);第11與第 12孔井為空白對照組(blank);
[0112] c.于該第1至8孔井內(nèi)做連續(xù)稀釋動作：自第1孔井內(nèi)取50μ1液體加入第2孔井內(nèi)混 勻，再自第2孔井內(nèi)取50μ1液體加入第3孔井內(nèi)混勻，以此類推，至第8孔井時去除多余的50μ 1 液體，以得到連續(xù)稀釋濃度66·6、22·2、7·4、2·47、0·82、0·27、0·091、0·03μΜ。
[0113] (2)制備試驗(yàn)組：
[0114] a.于96孔盤上第1行的第1及第2孔井內(nèi)各加入149μ1 NADPH-Cofactor Mix，以及1 μL 20mM中藥藥引測試樣品或ΙμL 25%(w/v)賦形劑測試樣品，并混合均勻；
[0115] b.再自該第1行的第1及第2孔井內(nèi)各取50μ1液體加入第3孔井內(nèi)混勻（即每一測試 樣品均為三重復(fù)）；
[0116] (3)反應(yīng)起始與終止：
[0117] a.將上述對照組與試驗(yàn)組置于37 °C靜置10分鐘；
[0118] b.除了該空白對照組之外，其它孔井內(nèi)均加入100μΙ Enzyme/Substrate Mix混 勻；
[0119] c.將所有對照組與試驗(yàn)組置于37 °C靜置40分鐘；
[0120] d.所有的孔井內(nèi)均加入75μ1 Stop Solution混勻；
[0121 ] e.緊接著于該空白對照組內(nèi)加入100μΙ Enzyme/Substrate Mix混勾；
[0122] f.將所有對照組與試驗(yàn)組以螢冷光儀(Fluoroskan Ascent FL,Thermo Electron Corporation，芬蘭）讀取結(jié)果，所使用的激發(fā)光（excitation)波長為405 nm，發(fā)散光 (emission)波長為538 nm〇
[0123] (4)結(jié)果分析：測得的熒光訊號數(shù)值換算成為CYP2E1代謝物標(biāo)準(zhǔn)品HFC生成量 (pmol)后，以對照組(control)為基準(zhǔn)，即對照組的CYP 2E1抑制率為0%，以下列公式計算 各陽性對照組及試驗(yàn)組的CYP 2E1抑制率：
[0125] 二、結(jié)果
[0126] 1.陽性對照組
[0127] 陽性對照組(DDTC)所測出的CYP 2E1抑制率如表2所示，由表2可知當(dāng)DDTC的濃度 為66.6μΜ(即為0.167%，w/v)時，CYP 2E1抑制率可達(dá)97.55%，是以66.6μΜ作為中藥藥引最 高測試濃度，以0.167% (w/v)作為賦形劑最高測試濃度。
[0128] 表2陽性對照組的CYP 2E1抑制率
[0129]
[0130] 2.試驗(yàn)組CYP 2E1抑制率
[0131] 中藥藥引所測出的CYP 2E1抑制率如表3所示，由結(jié)果可知各中藥藥引于不同濃度 (66μΜ，33μΜ，16.5μΜ)的條件下，對細(xì)胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μ Μ正二輕愈瘡酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果最佳(97·99±0·66% ) 〇
[0132] 表3中藥藥引的CYP 2Ε1抑制率
[0134]
[0135] *最小有效劑量:最低篩選濃度(mg/L)X人肝腸體積(3L)
[0136] 賦形劑所測出的CYP 2E1抑制率如表4所示，由結(jié)果可知各賦形劑于不同濃度 (0.167 %，0.08 %，0.042 %，w/v)的條件下，對細(xì)胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效 果，其中以0.167%鯨蠟醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳(97.75±0.66 %)。
[0137] 表4賦形劑的CYP 2E1抑制率
[0138]
[0139] *最小有效劑量:最低篩選濃度(mg/L)X人肝腸體積(3L)
[0140] 實(shí)施例3細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選-人肝微粒體細(xì)胞色素 P450 2E1
[0141] -、材料與方法
[0142] 1.試驗(yàn)材料
[0143] 本實(shí)施例是使用人類肝臟所制備微粒體，針對細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)與39種 中藥藥引及10種賦形劑進(jìn)行細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選，以篩選出對于人類 肝臟的細(xì)胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)有效抑制劑;該CYP2E1抑制劑的篩選作用原理為:利用 人類肝臟所制備微粒體中細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)與其受質(zhì)Chlorzoxazone反應(yīng)，加入 測試樣品作用后，再偵測CYP2E1代謝物標(biāo)準(zhǔn)品6-OH-CZX (6-Hydroxy-Chl orzoxazone)的生 成量，并以對照組(control)的6-OH-CZX生成量為基準(zhǔn)，計算測試樣品的CYP 2E1抑制率。
[0144] 各測試樣品均溶于10%甲醇(methanol)或是二次水中，測試不同濃度的中藥藥引 (66μΜ，33μΜ，16·5μΜ)及賦形劑（0·167%，0·08%，0·042%，w/v)對CYP2El的抑制率，所測試 的中藥藥引及結(jié)果如表6所列，所測試的賦形劑及結(jié)果如表7所列。
[0145] 本實(shí)施例所利用人類肝臟細(xì)胞色素 Ρ450 2E1(CYP2E1)抑制劑篩選所需的藥劑如 下：
[0146] (1 )CYP2E1:100mM potassium phosphate(pH 7 · 4)含有10mg/ml Ρ450 protein concentration〇
[0147] (2)Control Protein: lOmg/mL P450 Protein溶于lOOmM Potassium Phosphate (pH 7.4)中。
[0148] (3)Buffer Solution:?！?M Potassium Phosphate(pH 7·4)〇
[0149] Stop Solution：ice-acetonitrile〇
[0150] (4)Cofactors:含有l(wèi)OOmM NADP+以及l(fā)OmM Glucose 6-Phosphate〇
[0151] (5)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase:2000 units/ml溶于無菌水。
[0152] (6) Chlorzoxazone:受質(zhì)（substrate)，16mM Chlorzoxazone 溶于10% 甲醇 (Methanol)〇
[0153] (7)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid):CYP2E1選擇性抑制劑（陽性對照組）， 20mM DDTC容于 10% 甲醇（Methanol)。
[0154] (8)NADPH_regenerating System:于3.42ml中加入530μ1 Cofactors、40yl G6PDH (Glucose6_Phosphate Dehydrogenase Solution)以及 100μ1 Control Protein。
[0155] 2.細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制劑的篩選
[0156] 使用人類肝臟微粒體細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)進(jìn)行細(xì)胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制劑篩選的實(shí)驗(yàn)步驟如下所述：
[0157] (1)在4°C冰浴環(huán)境下，0 · 1M磷酸緩沖液(pH = 7 · 4)包含0 · 5mg/ml人肝微粒體、5mM MgCl2靜置15分鐘；
[0158] (2)此時實(shí)驗(yàn)組加入細(xì)胞色素 P450 2E1反應(yīng)基質(zhì)藥物16mM Chlorzoxazone以及濃 縮中藥藥引萃取液;對照組以甲醇:無菌水= 1:1取代中藥藥引；陽性對照組則以DDTC取代；
[0159] (3)最后加入輔酶ImM NADP+、10mM G6P與2IU G6PD。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至37°C水浴預(yù) 溫(pre-incubation) 1分鐘，活性測試實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時間為30分鐘；
[0160] (4)反應(yīng)完后以500L acetonitrile終止反應(yīng)，樣品靜置1分鐘后加入內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品 (5g/mL4-hydroxy-tobutamide)，離心后取上層液20L以甲醇:無菌水作稀釋十倍動作，取5L 回溶液注入LC/MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。
[0161] (5)結(jié)果分析：將L C / M S / M S測得的訊號數(shù)值換算成為C Y P 2 E1代謝物標(biāo)準(zhǔn)品6 -Hydroxy-Chlorzoxazone生成量(pmol)后，以對照組（control)為基準(zhǔn)，即對照組的CYP 2Ε1 抑制率為0%，以下列公式計算各陽性對照組及試驗(yàn)組的CYP 2E1抑制率：
[0163]二、結(jié)果
[0164] 1.陽性對照組
[0165] 陽性對照組(DDTC)所測出的CYP 2E1抑制率如表5所示，由表5可知當(dāng)DDTC的濃度 為100μM時，CYP2El抑制率可達(dá)87.56%。
[0166] 表5陽性對照組的CYP 2E1抑制率
[0167]
[0168] 2.試驗(yàn)組CYP 2E1抑制率
[0169] 中藥藥引所測出的CYP 2E1抑制率如表6所示，由結(jié)果可知各中藥藥引于不同濃度 (66μΜ，33μΜ，16.5μΜ)的條件下，對細(xì)胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μ Μ正二輕愈瘡酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果（96 · 98±0 · 19% )及66μΜ反式肉桂 酸(Trans-Cinnamaldehyde)抑制效果（92 · 81 ±0 · 53% )最佳。
[0170] 表6中藥藥引的CYP 2E1抑制率

[0173]
[0174] *最小有效劑量:最低篩選濃度(mg/L)X人肝腸體積(3L)
[0175] 賦形劑所測出的CYP 2E1抑制率如表7所示，由結(jié)果可知各賦形劑于不同濃度 (0.167 %，0.08 %，0.042 %，w/v)的條件下，對細(xì)胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效 果，其中以0.167%鯨蠟醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳(91.24 ±1.33%)。
[0176] 表7賦形劑的CYP 2E1抑制率



[0181]
[0182] *最小有效劑量:最低篩選濃度(mg/L)X人肝腸體積(3L)
[0183] 實(shí)施例4酰胺水解酶(amidase)抑制劑的篩選-鼠肝微粒體酰胺水解酶(amidase)
[0184] 一、材料與方法
[0185] 1.試驗(yàn)材料
[0186] Isonicotinic acid以高效能液相層析儀(HPLC-UV)分析定量。所有的有機(jī)溶劑均 為HPLC等級，購自 Tedia有限公司（Fairf ield，0H，USA)，isoniazid、isonicotinic acid與 nicotinic acid(內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)品，internal standard)購自 Sigma化學(xué)公司（St · Louis，M0 USA)〇
[0187] 2.試樣處理
[0188] 本實(shí)驗(yàn)擬以鼠肝微粒體溶液作為amidase酵素來源，isoniazid作為amidase代謝 模式藥物，定量isoniazid經(jīng)amidase代謝生成的代謝物isonicotinic acid(INA)，作為 amidase活性測量的標(biāo)的，建立amidase體外活性抑制劑篩選平臺，HPLC系統(tǒng)包括1個島津 LC-10AD栗（Shimadzu LC-10AD pump)、1 個島津系統(tǒng)控制器（Shimadzu system control)以 及1個島津自動樣本機(jī)(Shimadzu autosampler)(島津科學(xué)儀器，日本），以C18管柱(顆粒大 小5μπι，內(nèi)徑50父4.6111111，25〇11)并使用含有70%甲醇和30%甲酸銨(5011114!1=2.5)的移動相 進(jìn)行HPLC分離，實(shí)驗(yàn)步驟簡述如下：
[0189] (1)鼠肝酵素微粒體溶液制備及蛋白濃度測定。
[0190] (2)取鼠肝微粒體溶液150yL加入100yL isoniazid溶液(3mM溶于)35yL 67mM磷酸 鉀緩沖溶液(KH2P03，pH=7)及15yL amidase抑制劑(控制組加入去離子水)混合均勻。
[0191] (3)置于37 °C水浴槽反應(yīng)30分鐘。
[0192] (4)加入300yL 乙晴(acetonitrile，ACN)混勻后靜置 6 分鐘。
[0193] (5)加入30yL過氯酸混勻后靜置6分鐘。
[0194] (6)以13000g的轉(zhuǎn)速離心6分鐘。
[0195] (7)取100yL離心后上清液注射入HPLC。
[0196] (8)以甲醇：甲酸銨(5〇11^，？!1=2.5) = 70:30(￥/￥)為移動相，控制流速為11111/1^11， 以波長270nm紫外光檢測。
[0197] (9)結(jié)果分析：將HPLC-UV測得的訊號數(shù)值換算成為amidase代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 isonicotinic acid生成量(ng/mL)后，以對照組（control)為基準(zhǔn)，即對照組的amidase抑 制率為〇%，以下列公式計算各陽性對照組及試驗(yàn)組的amidase抑制率：
[0198]
[0199] 二、結(jié)果
[0200] 中藥純成份及賦形劑所測出的Amidase抑制率如表8及表9所示，由結(jié)果可知各中 藥純成分及賦形劑于不同濃度的條件下，對Amidase酵素具有不同程度的抑制效果，其中以 100μΜ HUCHE033抑制效果最佳(75·5±2·2%)。
[0201 ] 表8體外篩選中藥純成份所測出的Amidase抑制率
[0202]



[0206]
[0207] *最小有效劑量:最低篩選濃度(mg/L)X人肝腸體積(3L)
[0208] 表9體外篩選賦形劑所測出的Amidase抑制率
[0209]
[0210] *最小有效劑量:最低篩選濃度(mg/L)X人肝腸體積(3L)
[0211]實(shí)施例5丙基硫異煙酰胺(PZA)合并使用酰胺水解酶(amidase)抑制劑硝基苯酸磷 酸二酯（BNPP)的動物試驗(yàn) [0212] -、材料與方法
[0213] 1.試驗(yàn)材料
[0214] 所有的有機(jī)溶劑均為HPLC等級，購自Tedia有限公司（Fairfield，OH，USA)，PZA， BNPP則購自Sigma化學(xué)公司（St. Louis, MO USA)，硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)為文獻(xiàn)普遍使用 的酰胺水解酶(amidase)抑制劑，半乳糖注射溶液由南光化學(xué)制藥股份有限公司制備，是將 400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有適當(dāng)緩沖溶液系統(tǒng)以及等張鹽類的蒸餾水中，供作注 射使用。
[0215] 2.試驗(yàn)動物
[0216] 體重為320-350公克的雄性SD( Sprague-Dawley)大鼠購自國家實(shí)驗(yàn)動物中心（臺 灣），動物實(shí)驗(yàn)是遵照國衛(wèi)院動物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行，所有的大鼠均置于空氣/濕度調(diào)節(jié)環(huán)境下， 光照與黑暗各12小時，水及飼料的供給不限，在試驗(yàn)期間大鼠體重均持續(xù)監(jiān)測。
[0217] 3.試驗(yàn)處理
[0218] 試驗(yàn)動物隨機(jī)分成3組，每組包括2種處理，第一種處理為注射50mg/kg BNPP或 BNPP的基劑(vehicle，VEHl，即食鹽水），BNPP溶于加熱至60°C的食鹽水(0.9%NaCl)，冷卻 后以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至大鼠體內(nèi)；第二種處理為注射500mg/kg PZA或PZA的 基劑(VEH2，即食鹽水），PZA溶于食鹽水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至 大鼠體內(nèi)；第一種處理(BNPP或VEH1)較第二種處理(PZA或VEH2)早15分鐘處理。
[0219] 上述3組試驗(yàn)共包含：
[0220] (1)對照組（normal control group，NC，n= 10):正常的大鼠每天注射1 次VEH1 及 VEH2 (施行腹腔內(nèi)注射)共49天；
[0221] (2)PZA組（INH，η = 10):正常的大鼠每天注射1次PZA及VEH1 (施行腹腔內(nèi)注射)共 49天；
[0222] (3)ΒΝΡΡ-ΡΖΑ組(ΒΝΡΡ-ΡΖΑ，η = 10):正常的大鼠每天注射1次ΒΝΡΡ及ΡΖΑ(施行腹腔 內(nèi)注射)共49天；
[0223] 半乳糖單點(diǎn)法于第49天處理后16小時進(jìn)行測試。
[0224] 4.血液樣本
[0225] 處理完畢后，大鼠以乙醚麻醉犧牲，血液由大鼠背部主動脈抽取，置于含有EDTA的 試管中，血漿（plasma)以13,000g于4°C離心15分鐘，分離后的血漿分裝到微量小管 (Eppendorf tube)中并置于_80°C中儲存。
[0226] 5.生化分析
[0227] 肝細(xì)胞損傷以量測血漿中天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性以 進(jìn)行定量，AST與ALT活性是肝臟毒性常用的指標(biāo)，是以Synchron LXi 725系統(tǒng)來量測 (Beckman Instruments，美國）。
[0228] 6.光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡
[0229] 大鼠犧牲后肝臟隨即進(jìn)行組織學(xué)分析;肝臟樣本以10%磷酸緩沖液配制的福爾馬 林(phosphate-buffered formalin)固定，隨后脫水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片樣本以蘇木精（hematoxylin)與伊紅（eosin)染色，并進(jìn)行肝糖染色試驗(yàn) (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察；另外，肝臟切 片以二甲胂緩沖液（〇&(3 〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化鋨水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小時，以酒精連續(xù)脫水后包埋于Spurr樹脂（Spurr resin)中，并以鉆石刀切取超薄切片，以醋酸鈾酰（uranyl acetate)及梓檬酸鉛（lead citrate)作雙重染色，并以穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）觀察。
[0230] 7.肝功能的定量測試
[0231] 所有的大鼠均進(jìn)行半乳糖單點(diǎn)法(GSP)測試，大鼠接受在30秒內(nèi)的快速靜脈注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分鐘采血一次，血液樣本取自尾部靜脈； 以半乳糖脫氫酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量測半乳糖含量，測試 濃度范圍為50至1，000μg/ml，每個濃度的日內(nèi)差異(within-day variation)是由標(biāo)準(zhǔn)偏差 (standard deviation)以及變異系數(shù)（coefficient of variation,CV)百分比計算，最大 容許的變異系數(shù)為10 % CV ;日間差異（day-to-day variation)則由比較校正曲線 (calibration curves)的斜率及截距來檢驗(yàn);半乳糖單點(diǎn)法(GSP)為30秒注射停止后60分 鐘時血液中半乳糖濃度。
[0232] 8.統(tǒng)計分析
[0233]所有的數(shù)據(jù)皆以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)表示，試驗(yàn)結(jié)果以單因子變異數(shù)分析 (AN0VA)測試法來計算是否具有統(tǒng)計上的顯著差異，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)軟件包來計算；隨后使用事后比較 (post hoc test)最小差異顯著性（least significant difference)方法做多重比較，以 確認(rèn)族群間的顯著差異;族群平均的顯著差異為P〈〇. 05。
[0234]二、結(jié)果
[0235] 1.生化分析結(jié)果
[0236] 試驗(yàn)結(jié)束時，測量試驗(yàn)動物的體重及相對肝重量，與對照組動物相較之下并無顯 著差異;生化分析結(jié)果如圖11所示，PZA組血漿中的天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺 酶(ALT)活性明顯高于對照組(對照組血漿中的AST活性為109±27IU/L;PZA組血漿中的 AST活性為179 ± 10IU/L，p〈0.005;對照組血漿中的ALT活性為43 ± 9IU/L; PZA組血漿中的 ALT活性為91 ± 11IU/L，p〈0.005)，顯示PZA組產(chǎn)生生化上的肝損傷;BNPP-PZA血清中轉(zhuǎn)胺酶 濃度則顯著低于PZA組。
[0237] 2.組織病理學(xué)
[0238]經(jīng)過為期7周施行腹腔注射500mg/kg/day PZA的大鼠，其體內(nèi)成功的產(chǎn)生肝毒性； 相對的，在對照組大鼠體內(nèi)的肝結(jié)構(gòu)則較正常，如圖12A所示，對照組大鼠肝實(shí)質(zhì)（liver parenchyma)內(nèi)的肝細(xì)胞排列于自肝小葉中央靜脈輻射排列的網(wǎng)狀平板內(nèi)，肝血竇 (hepatic sinusoids)則在兩肝板(anastomosing plates)之間被發(fā)現(xiàn);PZA組大鼠的組織 切片則如圖12B所示，PZA組大鼠中央靜脈周圍的肝細(xì)胞則呈現(xiàn)碎裂及空泡化，然而并無看 到肝細(xì)胞壞死(necrosis)的征兆。而BNPP-PZA組大鼠的肝損害程度與對照組相較，并無明 顯區(qū)別（未顯示結(jié)果）。
[0239] 3.剩余肝功能的量測
[0240]如圖13所示，對照組與PZA組大鼠的半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值具有高度的顯著差異 (對照組大鼠的 GSP 值為 260±50μg/ml;PZA 組大鼠的 GSP 值為 776±65μg/ml，p〈0.005)Jb 外，BNPP-PZA組大鼠的GSP值為293 ± 61μg/ml，與PZA組相較，具有高度的顯著差異（p〈 0.005);單獨(dú)施用PZA的大鼠的GSP值明顯增加;然而，在PZA合并施用BNPP的大鼠則可抵抗 這種改變;而對照組與BNPP-PZA組之間大鼠的GSP值無顯著差異存在。
[0241]實(shí)施例6異煙堿酰胺（INH)及/或立復(fù)霉素(RIF)及/或丙基硫異煙酰胺(PZA)合并 使用CYP2E1抑制劑山奈酚（Kaempferol)或酰胺水解酶（amidase)抑制劑懈皮素 (Quercetin)的動物試驗(yàn)
[0242] 一、材料與方法
[0243] 1.試驗(yàn)材料
[0244] 所有的有機(jī)溶劑均為HPLC等級，購自Tedia有限公司（Fairfield，OH，USA)，INH、 RIF、PZA、Kaempferol、Quercetin購自 Sigma化學(xué)公司（St .Louis，MO USA)，半乳糖注射溶液 由南光化學(xué)制藥股份有限公司制備，是將400克半乳糖（Sigma)溶于1公升含有適當(dāng)緩沖溶 液系統(tǒng)以及等張鹽類的蒸餾水中，供作注射使用。
[0245] 2.試驗(yàn)動物
[0246] 體重為18-25公克的129/sv小鼠是購自美國國家衛(wèi)生研究院教授Dr.Gonzalez(美 國），引進(jìn)公鼠3只，母鼠4只后，自行配對繁殖，動物實(shí)驗(yàn)是遵照國衛(wèi)院動物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行， 所有的小鼠均置于空氣/濕度調(diào)節(jié)環(huán)境下，光照與黑暗各12小時，水及飼料的供給不限，在 試驗(yàn)期間小鼠體重均持續(xù)監(jiān)測，所有的小鼠均以使用乙醚進(jìn)行麻醉，并以眼窩方式進(jìn)行半 乳糖注射給藥，60分鐘后由尾靜脈采血測GSP值。
[0247] 3.試驗(yàn)處理
[0248] 試驗(yàn)動物隨機(jī)分成7組，每組包括5種處理，第一種處理為注射Kaempferol 3.78mg/kg或其基劑(vehic 1 e，VEH1，即食鹽水），以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠體 內(nèi)；第二種處理為則注射Quercetin 3.02mg/kg或其基劑(VEH2，即食鹽水），Quercetin溶于 食鹽水(0.9 %NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)；第三種處理為注射 50mg/kg INH或INH的基劑(VEH3，即食鹽水），INH溶于食鹽水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的體 積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)；第四種處理為注射l〇〇mg/kg RIF或其基劑(VEH4，即食鹽 水），RIF溶于食鹽水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)；第五種 處理為注射250mg/kg PZA或其基劑（VEH5，即食鹽水），PZA溶于食鹽水（0.9 %NaCl)中，以 lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)。
[0249] 上述5組試驗(yàn)共包含：
[0250] (1)對照組（normal control group,NC，n = 10):正常的小鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2、VEH3、VEH4以及VEH5 (施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0251] (2)INH-RIF組（INH-RIF，n=10):正常的小鼠每天注射l次INH、RIF、VEHl、VEH2以 及VEH5(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0252] (3)1(&611^^61'〇1-1順-1?正組（1(&611^^61'〇1-1順-1?正，11=10):正常的小鼠每天注射1 次Kaempferol、INH、RIF、VEH2以及VEH5(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0253] (4)Quercetin_INH-RIF組(Quercetin_INH-RIF，n = 10):正常的小鼠每天注射1次 Quercetin、INH、RIF、VEHl以及VEH5(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0254] (5)INH-RIF-PZA組（1順-1?正-?2厶，11=10):正常的小鼠每天注射1次1順、1?正、？2八、 VEH1以及VEH2 (施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0255] (6)Kaempferol-INH-RIF-PZA 組（Kaempferol-INH-RIF-PZA，n = 10):正常的小鼠 每天注射1次Kaempferol、INH、RIF、PZA以及VEH2(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0256] (7)Quercetin-INH-RIF-PZA組（Quercetin-INH-RIF-PZA，η = 10):正常的小鼠每 天注射1次QuerCetin、INH、RIF、PZA以及VEHl(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0257] 4.血液樣本
[0258] 處理完畢后，，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心臟采血，置于含有Heparin的試管 中，血衆(zhòng)(plasma)以13,000g于4°C離心10分鐘，分離后的血衆(zhòng)分裝到微量小管(Eppendorf tube)中并置于_80°C中儲存。
[0259] 5.生化分析
[0260] 肝細(xì)胞損傷以量測血漿中天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性以 進(jìn)行定量，AST與ALT活性是肝臟毒性常用的指標(biāo)，是以Synchron LXi 725系統(tǒng)來量測 (Beckman Instruments，美國）。
[0261] 6.光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡
[0262] 小鼠犧牲后肝臟隨即進(jìn)行組織學(xué)分析;肝臟樣本以10%磷酸緩沖液配制的福爾馬 林(phosphate-buffered formalin)固定，隨后脫水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片樣本以蘇木精（hematoxylin)與伊紅（eosin)染色，并進(jìn)行肝糖染色試驗(yàn) (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察；另外，肝臟切 片以二甲胂緩沖液（〇&(3 〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化鋨水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小時，以酒精連續(xù)脫水后包埋于Spurr樹脂（Spurr resin)中，并以鉆石刀切取超薄切片，以醋酸鈾酰（uranyl acetate)及梓檬酸鉛（lead citrate)作雙重染色，并以穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）觀察。
[0263] 7.肝功能之定量測試
[0264] 所有的小鼠均進(jìn)行半乳糖單點(diǎn)法(GSP)測試，小鼠接受在30秒內(nèi)的快速眼窩注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分鐘采血一次，血液樣本取自尾部靜脈； 以半乳糖脫氫酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量測半乳糖含量，測試 濃度范圍為50至1，000μg/ml，每個濃度的日內(nèi)差異(within-day variation)是由標(biāo)準(zhǔn)偏差 (standard deviation)以及變異系數(shù)（coefficient of variation,CV)百分比計算，最大 容許的變異系數(shù)為10 % CV ;日間差異（day-to-day variation)則由比較校正曲線 (calibration curves)的斜率及截距來檢驗(yàn);半乳糖單點(diǎn)法(GSP)為30秒注射停止后60分 鐘時血液中半乳糖濃度。
[0265] 8.統(tǒng)計分析
[0266] 所有的數(shù)據(jù)皆以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)表示，試驗(yàn)結(jié)果以單因子變異數(shù)分析 (AN0VA)測試法來計算是否具有統(tǒng)計上的顯著差異，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)軟件包來計算；隨后使用事后比較 (post hoc test)最小差異顯著性（least significant difference)方法做多重比較，以 確認(rèn)族群間的顯著差異;族群平均的顯著差異為P〈〇. 05。
[0267]二、結(jié)果
[0268] 1.生化分析結(jié)果
[0269] 試驗(yàn)結(jié)束時，測量試驗(yàn)小鼠的體重及相對肝重量，與對照組動物相較之下并無顯 著差異；生化分析結(jié)果如（圖14及表10)所示，當(dāng)小鼠以50/100mg/kg/day連續(xù)給予3周INH/ RIF后，INH/RIF控制組血漿中的天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性明顯高 于空白對照組(空白對照組血漿中的AST活性為90 ± 15IU/L; INH/RIF控制組血漿中的AST活 性為571 ± 295IU/L，p〈0.001;空白對照組血漿中的ALT活性為40 ± 5IU/L; INH/RIF控制組血 漿中的ALT活性為364±19211]/1，？〈0.001)，顯示1順/1?1?的確對小鼠造成生化程度上的肝 損傷；而以50/100/250mg/kg/day連續(xù)給予3周INH/RIF/PZA的小鼠，INH/RIF/PZA控制組血 漿中的AST和ALT活性分別為702±172IU/L及464±72IU/L，顯著高于空白對照組及INH/RIF 控制組，顯示INH/RIF/PZA的確對小鼠造成生化程度上的肝損傷，且損傷程度高于INH/RIF 造成的傷害；同時給予CYP2E1抑制劑Kaempferol或酰胺水解酶抑制劑Quercetin的 Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF、Que;rcetin-INH-RIF-PZA、Kaempfe;rol-INH-RIF-PZA實(shí)驗(yàn)組血清中轉(zhuǎn)胺酶濃度則接近正常值。
[0270]表 10 對照組、INH-RIF組、KH-1NH-RIF組、KM-1NH-RIF組、KL-1NH-RIF組、ΜΗ-1NH-RIF組、MM-INH-RIF組及ML-INH-RIF組Total HAI score、天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸 轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性分析，數(shù)值的計算為mean 土 SD。
[0272] Data are shown as mean土SD.
[0273] *p〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·005:Study compare to control group.
[0274] 2.組織病理學(xué)
[0275] 經(jīng)過為期三周施行腹腔注射50/100mg/kg/day INH/RIF及50/100/250mg/kg/day INH/RIF/PZA的小鼠，其體內(nèi)確實(shí)成功的產(chǎn)生肝毒性;相對的，在空白對照組小鼠體內(nèi)的肝 結(jié)構(gòu)則較正常；相較于INH-RIF-PZA組，Kaempferol-INH-RIF組、Quercetin-INH-RIF、 Kaempferol-INH-RIF-PZA組和Quercetin-INH-RIF-PZA組小鼠中央靜脈周圍肝細(xì)胞較為完 整，空泡明顯較少，發(fā)炎細(xì)胞亦較少。
[0276] 在評估肝臟病理組織切片嚴(yán)重程度的HAI-score方面，小鼠在連續(xù)給予INH/RIF或 INH/RIF/PZA 3周后，確實(shí)在Intralobular Degeneration and Focal Necrosis與 I nf 1 amma t i on這兩個項(xiàng)目得到積分，且在I NH-R IF及I NH-R IF-PZA控制組中發(fā)現(xiàn)有 Piecemeal necrosis，而Kaempferol-INH-RIF組、Quercetin-INH-RIF、Kaempferol_INH_ RIF-PZA組和Quercetin-INH-RIF-PZA組與INH/RIF控制組相比則有明顯的改善（圖16、圖 17)。
[0277] 1.剩余肝功能的量測
[0278] INH-RIF及INH-RIF-PZA控制組的半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值有隨著INH/RIF給藥時間 愈長而愈高的趨勢；空白對照組與INH-RIF及INH-RIF-PZA控制組小鼠的GSP值具有高度的 顯著差異（空白對照組小鼠的GSP值為177 ± 22mg/L;給藥3周后，INH-RIF及INH-RIF-PZA小 鼠的GSP 值各為866±339mg/L，p〈0·001與858±172mg/L，p〈0·001，此外，在Kaempferol-INH-RIF組、Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF-PZA組和Quercetin-INH-RIF-PZA組 小鼠之GSP 值為 401 ± 178mg/L、203 ± 76mg/L、273 ± 6 lmg/L、216 ± 67mg/L，與 INH-RIF及 INH-RIF-PZA控制組小鼠具有高度的顯著差異(p〈0.001);顯示施用INH-RIF及INH-RIF-PZA控制 組小鼠的GSP值明顯增加;然而，并用Kaempferol或Quercetin的小鼠則可抵抗這種改變，空 白對照組與Kaempferol或Quercetin實(shí)驗(yàn)組相比時，小鼠之間的GSP值無顯著差異存在（圖 15)〇
[0279] 實(shí)施例7異煙堿酰胺（INH)及立復(fù)霉素（RIF)合并使用CYP2E1抑制劑山奈酚 (Kaempferol)、甘露醇Mannitol、鄰磺酰苯酰亞胺、鹿糖素 、Dicalcium phosphate、交聯(lián)聚 乙烯吡咯烷酮的動物試驗(yàn)
[0280] 一、材料與方法
[0281] 1.試驗(yàn)材料
[0282] 所有的有機(jī)溶劑均為HPLC等級，購自Tedia有限公司（Fairf ie 1 d，0H，USA)，INH、 RIF、Kaempferol、甘露醇Mannitol、鄰磺酰苯酰亞胺、鹿糖素、Dicalcium phosphate、交聯(lián) 聚乙烯吡咯烷酮購自Sigma化學(xué)公司（St. Loui s，M0 USA)，半乳糖注射溶液由南光化學(xué)制藥 股份有限公司制備，是將400克半乳糖（Sigma)溶于1公升含有適當(dāng)緩沖溶液系統(tǒng)以及等張 鹽類的蒸餾水中，供作注射使用。
[0283] 2.試驗(yàn)動物
[0284] 體重為18-25公克的129/sv小鼠是購自美國國家衛(wèi)生研究院教授Dr.Gonzalez(美 國），引進(jìn)公鼠3只，母鼠4只后，自行配對繁殖，動物實(shí)驗(yàn)是遵照國衛(wèi)院動物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行， 所有的小鼠均置于空氣/濕度調(diào)節(jié)環(huán)境下，光照與黑暗各12小時，水及飼料的供給不限，在 試驗(yàn)期間小鼠體重均持續(xù)監(jiān)測，所有的小鼠均以使用乙醚進(jìn)行麻醉，并以眼窩方式進(jìn)行半 乳糖注射給藥，60分鐘后由尾靜脈采血測GSP值。
[0285] 3.試驗(yàn)處理
[0286] 試驗(yàn)動物隨機(jī)分成13組，每組包括3種處理，第一種處理為口服Kaempferol 1.67mg/kg，以0· lml/kg的體積給藥；或?yàn)榭诜﨣aempferol 4.27mg/kg，以0· lml/kg的體積 給藥;或?yàn)榭诜﨣aempferol 8 · 33mg/kg，以0 · lml/kg的體積給藥;或?yàn)榭诜事洞糓annitol 0· 17mg/kg，以0· lml/kg的體積給藥;或?yàn)榭诜事洞糓annitol 0.83mg/kg，以0· lml/kg的 體積給藥;或?yàn)榭诜事洞糓annitol 1.67mg/kg，以0. lml/kg的體積給藥;或?yàn)榭诜徎酋?苯酰亞胺〇.83mg/kg，以0· lml/kg的體積給藥;或?yàn)榭诜固撬?.67mg/kg，以0· lml/kg的體 積給藥；或?yàn)榭诜徎酋１锦啺?.83mg/kg+甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，或?yàn)榭诜?Dicalcium phosphate 0·83mg/kg，或處理為口服交聯(lián)聚乙稀吡略燒酮2·83mg/kg，第二種 處理為注射50mg/kg INH或INH的基劑(VEH1，即食鹽水），INH溶于食鹽水(0.9%NaCl)中，以 lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)；第三種處理為注射100mg/kg RIF或其基劑 (VEH2，即食鹽水），RIF溶于食鹽水(0.9 %NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠 體內(nèi)。
[0287] 上述5組試驗(yàn)共包含：
[0288] (1)對照組（normal control group,NC，n = 10):正常的小鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2 (施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0289] (2)INH-RIF組（INH-RIF，n=10):正常的小鼠每天注射1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注 射)共21天；
[0290] (3)KL-INH-RIF組(η = 8):正常的小鼠每天口 服一次Kaempferol 1 · 67mg/kg，注射 1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0291] (4)疆-1順-1?正組(11 = 6):正常的小鼠每天口服一次1^611^^61〇14.1711^/1^，注射 1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0292] (5 )KH-INH-RIF組(η = 6):正常的小鼠每天口 服一次Kaempf erol 8 · 33mg/kg，注射 1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0293] (6)ML-INH-RIF組(n = 8):正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 0.17mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0294] (7)MM-INH-RIF組(n = 6):正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 0.83mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0295] (8)MH-INH-RIF 組(n = 6):正常的小鼠每天口服一次甘露醇 Mannitol 1.67mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0296] (9)SA-INH-RIF組(n = 4):正常的小鼠每天口服一次鄰磺酰苯酰亞胺0.83mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0297] (lO)SU-INH-RIF組(n = 4):正常的小鼠每天口服一次蔗糖素1.67mg/kg，注射1次 INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0298] (11 )SAM-INH-RIF組(n = 4):正常的小鼠每天口服一次鄰磺酰苯酰亞胺0.83mg/kg +甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0299] (12)D_INH_RIF組（η = 4):正常的小鼠每天口服一次Dicalcium phosphate 0.83mg/kg，注射1次INH、RIF (施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0300] (I3)c-INH-RIF組(n = 4):正常的小鼠每天口服一次交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮2.83mg/ kg，注射1次INH、RIF (施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0301] 4.血液樣本
[0302] 處理完畢后，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心臟采血，置于含有Heparin的試管中， 血衆(zhòng)（plasma)以13，000g于4°C離心10分鐘，分離后的血衆(zhòng)分裝到微量小管（Eppendorf tube)中并置于-80 °C中儲存。
[0303] 5.生化分析
[0304]肝細(xì)胞損傷以量測血漿中天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性以 進(jìn)行定量，AST與ALT活性是肝臟毒性常用的指標(biāo)，是以Synchron LXi 725系統(tǒng)來量測 (Beckman Instruments，美國）。
[0305] 6.光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡
[0306]小鼠犧牲后肝臟隨即進(jìn)行組織學(xué)分析;肝臟樣本以10%磷酸緩沖液配制的福爾馬 林(phosphate-buffered formalin)固定，隨后脫水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片樣本以蘇木精（hematoxylin)與伊紅（eosin)染色，并進(jìn)行肝糖染色試驗(yàn) (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察；另外，肝臟切 片以二甲胂緩沖液（〇&(3〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化鋨水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小時，以酒精連續(xù)脫水后包埋于Spurr樹脂（Spurr resin)中，并以鉆石刀切取超薄切片，以醋酸鈾酰（uranyl acetate)及梓檬酸鉛（lead citrate)作雙重染色，并以穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）觀察。
[0307] 7.肝功能的定量測試
[0308] 所有的小鼠均進(jìn)行半乳糖單點(diǎn)法(GSP)測試，小鼠接受在30秒內(nèi)的快速眼窩注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分鐘采血一次，血液樣本取自尾部靜脈； 以半乳糖脫氫酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量測半乳糖含量，測試 濃度范圍為50至1，000μg/ml，每個濃度的日內(nèi)差異(within-day variation)是由標(biāo)準(zhǔn)偏差 (standard deviation)以及變異系數(shù)（coefficient of variation,CV)百分比計算，最大 容許的變異系數(shù)為10 % CV ;日間差異（day-to-day variation)則由比較校正曲線 (calibration curves)的斜率及截距來檢驗(yàn);半乳糖單點(diǎn)法(GSP)為30秒注射停止后60分 鐘時血液中半乳糖濃度。
[0309] 8.統(tǒng)計分析
[0310] 所有的數(shù)據(jù)皆以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)表示，試驗(yàn)結(jié)果以單因子變異數(shù)分析 (AN0VA)測試法來計算是否具有統(tǒng)計上的顯著差異，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)軟件包來計算；隨后使用事后比較 (post hoc test)最小差異顯著性（least significant difference)方法做多重比較，以 確認(rèn)族群間的顯著差異;族群平均的顯著差異為P〈〇. 05。
[0311] 二、結(jié)果
[0312] 1.生化分析結(jié)果
[0313]試驗(yàn)結(jié)束時，測量試驗(yàn)小鼠的體重及相對肝重量，與對照組動物相較之下并無顯 著差異；生化分析結(jié)果如表11所示，當(dāng)小鼠以50/100mg/kg/day連續(xù)給予3周INH/RIF后， INH/RIF控制組血漿中的天門冬氨酸轉(zhuǎn)胺酶(AST)與丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性明顯高于空白 對照組（空白對照組血漿中的AST活性為80±13IU/L;INH/RIF控制組血漿中的AST活性為 420±66IU/L，p〈0.001;空白對照組血漿中的ALT活性為46± 10IU/L; INH/RIF控制組血漿中 的ALT活性為358 ±67IU/L，p〈0.001)，顯示INH/RIF的確對小鼠造成生化程度上的肝損傷； 同時給予CYP2E1抑制劑Kaempferol、甘露醇Mannitol各劑量實(shí)驗(yàn)組、血清中轉(zhuǎn)胺酶濃度皆 顯著低于INH/RIF控制組。
[0314] 2.組織病理學(xué)
[0315]經(jīng)過為期三周施行腹腔注射50/100mg/kg/day INH/RIF的小鼠，其體內(nèi)確實(shí)成功 的產(chǎn)生肝毒性;相對的，在空白對照組小鼠體內(nèi)的肝結(jié)構(gòu)則較正常;相較于INH-RIF組，甘露 醇Mannitol各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠中央靜脈周圍肝細(xì)胞較為完整，空泡明顯較少，發(fā)炎細(xì)胞亦 較少(圖18)。
[0316] 在評估肝臟病理組織切片嚴(yán)重程度的HAI-score方面，小鼠在連續(xù)給予INH/RIF 3 周后，Kaempferol、甘露醇Mannitol各劑量實(shí)驗(yàn)組與INH/RIF控制組相比則有明顯的改善。 [0317] 3.剩余肝功能的量測
[0318] INH-RIF控制組的半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值有隨著INH/RIF給藥時間愈長而愈高的趨 勢；空白對照組與INH-RIF控制組小鼠的GSP值具有高度的顯著差異(空白對照組小鼠3周的 GSP值為 192 ± 18mg/L;給藥3周后，INH-RIF小鼠的GSP值為666 ± 126mg/L，p〈0 · 001，然而， Kaempferol、甘露醇Mannitol、鄰磺酰苯酰亞胺、鹿糖素 、Dicalcium phosphate各劑量實(shí)驗(yàn) 組的小鼠則可抵抗這種改變，其中空白對照組與KH-INH-RIF組、KM-INH-RIF組、MH-INH-RIF 組、MM-INH-RIF組、SU-INH-RIF組相比時，小鼠之間的GSP值無顯著差異存在(如表11)。
[0319] 表 11、為對照組、INH-RIF組、KH-1NH-RIF組、KM-1NH-RIF 組、KL-1NH-RIF組、MH-INH-RIF 組、MM-INH-RIF 組、ML-INH-RIF 組、SA-INH-RIF 組、SU-INH-RIF 組、SAM-INH-RIF 組、 D-INH-RIF組及C-INH-RIF組小鼠半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值，數(shù)值的計算為mean土SD。
[0320]
[0321] Data are shown as mean土SD.
[0322] *p〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·005:Study compare to control group.
[0323] 實(shí)施例8異煙堿酰胺（INH)及立復(fù)霉素（RIF)及丙基硫異煙酰胺（PZA)合并使用 CYP2E1抑制劑甘露醇Mann i to 1的動物試驗(yàn)
[0324] 一、材料與方法
[0325] 1.試驗(yàn)材料
[0326] 所有的有機(jī)溶劑均為HPLC等級，購自Tedia有限公司（Fairfield，0H，USA)，INH、 RIF、PZA、甘露醇Mannitol購自Sigma化學(xué)公司（St.Louis，M0 USA)，半乳糖注射溶液由南光 化學(xué)制藥股份有限公司制備，是將400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有適當(dāng)緩沖溶液系統(tǒng) 以及等張鹽類的蒸餾水中，供作注射使用。
[0327] 2.試驗(yàn)動物
[0328] 體重為18-25公克的129/sv小鼠是購自美國國家衛(wèi)生研究院教授Dr.Gonzalez(美 國），引進(jìn)公鼠3只，母鼠4只后，自行配對繁殖，動物實(shí)驗(yàn)是遵照國衛(wèi)院動物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行， 所有的小鼠均置于空氣/濕度調(diào)節(jié)環(huán)境下，光照與黑暗各12小時，水及飼料的供給不限，在 試驗(yàn)期間小鼠體重均持續(xù)監(jiān)測，所有的小鼠均以使用乙醚進(jìn)行麻醉，并以眼窩方式進(jìn)行半 乳糖注射給藥，60分鐘后由尾靜脈采血測GSP值。
[0329] 3.試驗(yàn)處理
[0330] 試驗(yàn)動物隨機(jī)分成3組，每組包括4種處理，第一種處理為口服為口服甘露醇 Mannitol 1 · 67mg/kg，以0 · lml/kg的體積給藥；第二種處理為注射50mg/kg INH或INH的基 劑(VEH1，即食鹽水），INH溶于食鹽水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小 鼠體內(nèi)；第三種處理為注射l〇〇mg/kg RIF或其基劑（VEH2,即食鹽水），RIF溶于食鹽水 (0.9%NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)；第四種處理為注射250mg/kg PZA或其基劑(VEH3，即食鹽水），PZA溶于食鹽水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的體積進(jìn)行腹腔 內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)。
[0331] 上述3組試驗(yàn)共包含：
[0332] (1)對照組（normal control group,NC，n = 10):正常的小鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2、VEH3 (施行腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0333] (2)1順-1?正-?2六組（1順-1?1?，11 = 6):正常的小鼠每天注射1次1順、1?正、？2六(施行 腹腔內(nèi)注射)共21天；
[0334] (3)M-INH-RIF-PZA組(n = 6):正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 1.67mg/ kg，注射1次INH、RIF、PZA (施行腹腔內(nèi)注射)共21天。
[0335] 4.血液樣本
[0336] 處理完畢后，，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心臟采血，置于含有Heparin的試管 中，血衆(zhòng)(plasma)以13,000g于4°C離心10分鐘，分離后的血衆(zhòng)分裝到微量小管(Eppendorf tube)中并置于-80 °C中儲存。
[0337] 5.肝功能的定量測試
[0338]所有的小鼠均進(jìn)行半乳糖單點(diǎn)法(GSP)測試，大鼠接受在30秒內(nèi)的快速眼窩注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分鐘采血一次，血液樣本取自尾部靜脈； 以半乳糖脫氫酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量測半乳糖含量，測試 濃度范圍為50至1，000μg/ml，每個濃度的日內(nèi)差異(within-day variation)是由標(biāo)準(zhǔn)偏差 (standard deviation)以及變異系數(shù)（coefficient of variation,CV)百分比計算，最大 容許的變異系數(shù)為10 % CV ;日間差異（day-to-day variation)則由比較校正曲線 (calibration curves)的斜率及截距來檢驗(yàn);半乳糖單點(diǎn)法(GSP)為30秒注射停止后60分 鐘時血液中半乳糖濃度。
[0339] 6.統(tǒng)計分析
[0340] 所有的數(shù)據(jù)皆以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)表示，試驗(yàn)結(jié)果以單因子變異數(shù)分析 (AN0VA)測試法來計算是否具有統(tǒng)計上的顯著差異，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)軟件包來計算；隨后使用事后比較 (post hoc test)最小差異顯著性（least significant difference)方法做多重比較，以 確認(rèn)族群間的顯著差異;族群平均的顯著差異為P〈〇. 05。
[0341] 二、結(jié)果
[0342] 1.剩余肝功能的量測
[0343] INH-RIF-PZA控制組的半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值有隨著INH/RIF給藥時間愈長而愈高 的趨勢；空白對照組與INH-RIF-PZA控制組小鼠的GSP值具有高度的顯著差異（空白對照組 小鼠 3周的GSP值為570 ± 293mg/L;給藥3周后，INH-RIF-PZA小鼠的GSP值為948 ± 236mg/L，p 〈0.001，然而，甘露醇Mannito 1實(shí)驗(yàn)組的小鼠則可抵抗這種改變(如表12)。
[0344] 表12、為對照組、INH-RIF-PZA組、M-INH-RIF-PZA組小鼠半乳糖單點(diǎn)法(GSP)值，數(shù) 值的計算為mean 土 SD 〇
[0345]
[0346] Data are shown as mean土SD.
[0347] *p〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·005:Study compare to control group.
[0348] 實(shí)施例9低副作用INH/RIF劑型于健康受試者體內(nèi)對INH相關(guān)代謝酶的影響研究
[0349] 一、材料與方法
[0350] 1.試驗(yàn)處理
[0351] 利用CYP2E1 phenoytping藥物Chlorzoxazone 500mg與Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)并服CYP2E1抑制劑甘露醇Mannitol 100mg，于健康受試者進(jìn)行藥 動學(xué)比較研究。試驗(yàn)過程中，監(jiān)測受試者血漿中Chl〇rz〇XaZ〇ne(CZX)及其代謝物的變化情 形，并掌握ALT、AST及GSP值等生化值變化，進(jìn)而評估健康受試者在有無并服CYP2E1抑制劑 下，研究CYP2E1在健康受試者體內(nèi)的活性變化情形。
[0352] 2.試驗(yàn)分組
[0353] 本試驗(yàn)全程于三軍總醫(yī)院臨床研究中心執(zhí)行，試驗(yàn)共有2次階段性給藥，每次試驗(yàn) 間隔一周。第1次給藥，口服給予國外原廠Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)與 Chlorzoxazone(500mg)，第1次給藥后一周，同一批受試者進(jìn)行第2次給藥，給予國外原廠 Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)+甘露酉享Mannitol(100mg)與Chlorzoxazone (500mg)。
[0354] 3 ·評估及統(tǒng)計方法
[0355] 受試者的試驗(yàn)數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析結(jié)果將會作一個整合性概述，藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)以平 均值及標(biāo)準(zhǔn)差描述，試驗(yàn)中所得到的藥動學(xué)參數(shù)及數(shù)據(jù)上的顯著差異，將會以O(shè)NE WAY AN0VA或其它更適切的統(tǒng)計分析方法進(jìn)行分析。
[0356] 二、結(jié)果
[0357] 1.血液分析結(jié)果
[0358] 已完成 18人次臨床試驗(yàn)，控制組（Chlorzoxazone 500mg+Isoniazid 300mg)9人次 與實(shí)驗(yàn)組（Chlorzoxazone 500mg+Isoniazid 300mg+HUCHE033 180mg)9人次。結(jié)果顯不，并 用HUCHE033組，Chlorzoxazone原型藥的藥物動力學(xué)參數(shù)未有顯著影響，但其經(jīng)CYP2E1代謝 的代謝物6H3H Chlorzoxazone的Cmax顯著較低，其6-〇H_Chlorzoxazone/Chlorzoxazone代 謝比亦顯著低于控制組（圖19、圖20及表13)。
[0359] 表 13 Chlorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone及 其代謝物6-OH Chlorzoxazone于健康受試者的藥物動力學(xué)參數(shù)，數(shù)值的計算為mean土SD
[0360]
[0361] Data represent mean土S.D. .\<0.05，^<0.01，^^〈0.005
[0362] *Metabolic Ratio :AUCt6〇H-czx/AUCtczX
[0363] 上列詳細(xì)說明是針對本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以限制本 發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實(shí)施或變更，例如：異煙堿酰胺（INH)、細(xì)胞色素 P450 2E1抑制劑、酰胺水解酶(amidase)抑制劑施用的濃度及比例，以及細(xì)胞色素 P450 2E1 抑制劑或酰胺水解酶(amidase)抑制劑選用的種類等變化的等效性實(shí)施例，均應(yīng)包含于本 案的專利范圍中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無/低副作用的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，包含： (a) 抗結(jié)核病藥物，其是立復(fù)霉素、或丙基硫異煙堿酰胺、或乙酰胺醇、或前述任兩種以 上的組合；以及 (b) 至少一種醫(yī)藥上可接受的降低抗結(jié)核病藥物副作用的物質(zhì)，其特征在于，所述降低 抗結(jié)核病藥物副作用的物質(zhì)選自于下列化合物所組成的群組:正二羥愈瘡酸，所述正二羥 愈瘡酸的含量為17毫克至10克、（-)-表沒食子兒茶素，所述(-)-表沒食子兒茶素的含量為 25毫克至10克、茵陳色原酮，所述茵陳色原酮的含量為17毫克至10克、山奈酚，所述山奈酚 的含量為16_克至10克、根皮素，所述根皮素的含量為15暈克至10克、橙皮素，所述橙皮素 的含量為17毫克至10克、6-姜辣醇，所述6-姜辣醇的含量為16毫克至10克、沒食子酸，所述 沒食子酸的含量為9毫克至10克、異甘草素，所述異甘草素的含量為18毫克至10克、柚皮素， 所述柚皮素的含量為9毫克至10克、二氫化槲皮素，所述二氫化槲皮素的含量為17毫克至10 克、漢黃芩素，所述漢黃芩素的含量為16毫克至10克、原兒茶酸，所述原兒茶酸的含量為8毫 克至10克、兒茶素，所述兒茶素的含量為16毫克至10克、β-奈黃酮，所述β-奈黃酮的含量為 15毫克至10克、恩貝素，所述恩貝素的含量為16毫克至10克、反式肉桂酸，所述反式肉桂酸 的含量為8毫克至10克、表兒茶酚，所述表兒茶素的含量為16毫克至10克、根皮苷，所述根皮 苷的含量為24毫克至10克、反式肉桂醛，所述反式肉桂醛的含量為7毫克至10克、大豆苷元， 所述大豆苷元的含量為14毫克至10克、異牡荊素，所述異牡荊素的含量為24毫克至10克、β-香葉烯，所述香葉烯的含量為8毫克至10克、懈皮素，所述懈皮素的含量為0.9毫克至10 克、(+) _朽1檬稀，所述(+)_朽1檬稀的含量為7暈克至10克、楊梅素，所述楊梅素的含量為17_ 克至10克、懈皮，所述懈皮的含量為24毫克至10克、木犀草素-7-葡萄糖苷，所述木犀草素-7-葡萄糖苷的含量為24毫克至10克、桑葉素，所述桑葉素的含量為16毫克至10克、新橙皮 苷，所述新橙皮苷的含量為33毫克至10克、橙皮苷，所述橙皮苷的含量為33毫克至10克、 (-)_表沒食子兒茶素，所述(-)_表沒食子兒茶素的含量為17毫克至10克、木犀草素，所述木 犀草素的含量為16毫克至10克、金絲桃苷，所述金絲桃苷的含量為25毫克至10克、檉柳素， 所述檉柳素的含量為17毫克至10克、黃芩素，所述黃芩素的含量為15毫克至10克、蕓香素， 所述蕓香素的含量為15毫克至10克、黃芩，所述黃芩的含量為24毫克至10克、芹菜素，所述 序菜素的含量為15毫克至10克、（ + )_表兒茶素，所述( + )_表兒茶素的含量為16毫克至10克、 (-)_表兒茶素沒食子酸酯，所述(-)_表兒茶素沒食子酸酯的含量為24毫克至10克、牡荊素， 所述牡荊素的含量為24毫克至10克、金雀異黃酮，所述金雀異黃酮的含量為15毫克至10克、 異鼠李素，所述異鼠李素的含量為14毫克至10克、香葉木素，所述香葉木素的含量為33毫克 至10克、葛根素，所述葛根素的含量為23毫克至10克、或傘形花內(nèi)酯，所述傘形花內(nèi)酯的含 量為9毫克至10克、高良姜素，所述高良姜素的含量為0.8毫克至10克、非瑟酮，所述非瑟酮 的含量為0.8毫克至10克。2. 如權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，所述抗結(jié)核病藥物復(fù)方還加入 藥學(xué)上可接受的賦形劑。3. 如權(quán)利要求2所述的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，所述賦形劑為稀釋劑、填充劑、 結(jié)合劑、崩解劑或潤滑劑。4. 如權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，所述抗結(jié)核病藥物復(fù)方的劑型 為口服錠劑、膠囊劑、散劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、芳香水劑、糖漿劑、醑劑、酏劑、酊劑、流浸 膏劑、軟膏、乳霜劑、糊劑、注射劑或栓劑。5. -種無/低副作用的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，包含： (a) 抗結(jié)核病化合物，其是異煙堿酰胺合併選自于由立復(fù)霉素、丙基硫異煙堿酰胺以及 乙酰胺醇所組成的群組；以及 (b) 至少一種醫(yī)藥上可接受的降低抗結(jié)核病藥物副作用的物質(zhì)，其特征在于，所述降低 抗結(jié)核病藥物副作用的物質(zhì)選自于下列化合物所組成的群組:正二羥愈瘡酸，所述正二羥 愈瘡酸的含量為17毫克至10克、（-)_表兒茶素沒食子酸酯，所述(-)_表兒茶素沒食子酸酯 的含量為25毫克至10克、茵陳色原酮，所述茵陳色原酮的含量為17毫克至10、山奈酚，所述 山奈酚的含量為16毫克至10克、根皮素，所述根皮素的含量為15毫克至10克、橙皮素，所述 橙皮素的含量為17毫克至10克、6-姜辣醇，所述6-姜辣醇的含量為16毫克至10克、沒食子 酸，所述沒食子酸的含量為9毫克至10克、異甘草素，所述異甘草素的含量為18毫克至10克、 柚皮素，所述柚皮素的含量為9毫克至10克、二氫化槲皮素，所述二氫化槲皮素的含量為17 毫克至10克、漢黃芩素，所述漢黃芩素的含量為16毫克至10克、原兒茶酸，所述原兒茶酸的 含量為8毫克至10克、兒茶素，所述兒茶素的含量為16毫克至10克、β-奈黃酮，所述β-奈黃酮 的含量為15毫克至10克、恩貝素，所述恩貝素的含量為16毫克至10克、反式肉桂酸，所述反 式肉桂酸的含量為8毫克至10克、表兒茶素，所述表兒茶素的含量為16毫克至10克、根皮苷， 所述根皮苷的含量為24毫克至10克、反式肉桂醛，所述反式肉桂醛的含量為7毫克至10克、 大豆苷元，所述大豆苷元的含量為14毫克至10克、異牡荊素，所述異牡荊素的含量為24毫克 至10克、β-香葉烯，所述β-香葉烯的含量為8毫克至10克、懈皮素，所述懈皮素的含量為0.9 暈克至10克、（+)-朽 1檬稀，所述(+)-朽1檬稀的含量為7暈克至10克、楊梅素，所述楊梅素的含 量為17毫克至10克、懈皮，所述懈皮的含量為24毫克至10克、木犀草素-7-葡萄糖苷，所述木 犀草素-7-葡萄糖苷的含量為24毫克至10克、桑葉素，所述桑葉素的含量為16毫克至10克、 新橙皮苷，所述新橙皮苷的含量為33毫克至10克、橙皮苷，所述橙皮苷的含量為33毫克至10 克、（-)_表沒食子兒茶素，所述(-)_表沒食子兒茶素的含量為17毫克至10克、木犀草素，所 述木犀草素的含量為16毫克至10克、金絲桃苷，所述金絲桃苷的含量為25毫克至10克、檉柳 素，所述檉柳素的含量為17毫克至10克、黃芩素，所述黃芩素的含量為15毫克至10克、蕓香 素，所述蕓香素的含量為15毫克至10克、黃芩，所述黃芩的含量為24毫克至10克、芹菜素，所 述序菜素的含量為15毫克至10克、（ + )_表兒茶素，所述(+)_表兒茶素的含量為16毫克至10 克、（-)_表兒茶素沒食子酸酯，所述(-)_表兒茶素沒食子酸酯的含量為24毫克至10克、牡荊 素，所述牡荊素的含量為24毫克至10克、金雀異黃酮，所述金雀異黃酮的含量為15毫克至10 克、異鼠李素，所述異鼠李素的含量為14毫克至10克、香葉木素，所述香葉木素的含量為33 毫克至10克、葛根素，所述葛根素的含量為23毫克至10克、或傘形花內(nèi)酯，所述傘形花內(nèi)酯 的含量為9毫克至10克、高良姜素，所述高良姜素的含量為0.8毫克至10克、非瑟酮，所述非 瑟酮的含量為0.8毫克至10克。6. 如權(quán)利要求5所述的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，所述抗結(jié)核病藥物復(fù)方還加入 藥學(xué)上可接受的賦形劑。7. 如權(quán)利要求6所述的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，所述賦形劑為稀釋劑、填充劑、 結(jié)合劑、崩解劑或潤滑劑。8. 如權(quán)利要求5所述的抗結(jié)核病藥物復(fù)方，其特征在于，所述抗結(jié)核病藥物復(fù)方的劑型 為口服錠劑、膠囊劑、散劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、芳香水劑、糖漿劑、醑劑、酏劑、酊劑、流浸 膏劑、軟膏、乳霜劑、糊劑、注射劑或栓劑。9. 一種化合物用於制備無/低副作用的抗結(jié)核病藥物復(fù)方用途； 該抗結(jié)核病藥物是立復(fù)霉素、或丙基硫異煙堿酰胺、或乙酰胺醇、或前述任兩種以上的 組合； 該化合物係選自于下列物質(zhì)所組成的群組:正二羥愈瘡酸、（-)_表沒食子兒茶素、茵陳 色原酮、山奈酚、根皮素、橙皮素、6-姜辣醇、沒食子酸、異甘草素、柚皮素、二氫化槲皮素、漢 黃芩素、原兒茶酸、兒茶素、奈黃酮、恩貝素、反式肉桂酸、表兒茶酚、根皮苷、反式肉桂醛、 大豆苷元、異牡荊素、β-香葉烯、懈皮素、（ + )_檸檬烯、楊梅素、懈皮、木犀草素-7-葡萄糖苷、 桑葉素、新橙皮苷、橙皮苷、（-)_表沒食子兒茶素、木犀草素、金絲桃苷、檉柳素、黃芩素、蕓 香素、黃芩、芹菜素、（ + )_表兒茶素、（-)_表兒茶素沒食子酸酯、牡荊素、金雀異黃酮、異鼠李 素、香葉木素、葛根素、傘形花內(nèi)酯、高良姜素、非瑟酮。10. 如權(quán)利要求9所述的用途； 該化合物的特征為，所述正二羥愈瘡酸的含量為17毫克至10克、所述(-)-表沒食子兒 茶素的含量為25毫克至10克、所述茵陳色原酮的含量為17毫克至10克、所述山奈酚的含量 為16毫克至10克、所述根皮素的含量為15毫克至10克、所述橙皮素的含量為17毫克至10克、 所述6-姜辣醇的含量為16毫克至10克、所述沒食子酸的含量為9毫克至10克、所述異甘草素 的含量為18_克至10克、所述柚皮素的含量為9暈克至10克、所述二氫化槲皮素的含量為17 毫克至10克、所述漢黃芩素的含量為16毫克至10克、所述原兒茶酸的含量為8毫克至10克、 所述兒茶素的含量為16毫克至10克、所述β-奈黃酮的含量為15毫克至10克、所述恩貝素的 含量為16_克至10克、所述反式肉桂酸的含量為8暈克至10克、所述表兒茶素的含量為16暈 克至10克、所述根皮苷的含量為24毫克至10克、所述反式肉桂醛的含量為7毫克至10克、所 述大豆苷元的含量為14毫克至10克、所述異牡荊素的含量為24毫克至10克、所述β-香葉烯 的含量為8_克至10克、所述懈皮素的含量為0.9暈克至10克、（ + )-梓檬稀，所述( + )-梓檬稀 的含量為7毫克至10克、所述楊梅素的含量為17毫克至10克、所述懈皮的含量為24毫克至10 克、所述木犀草素-7-葡萄糖苷的含量為24毫克至10克、所述桑葉素的含量為16毫克至10 克、所述新橙皮苷的含量為33毫克至10克、所述橙皮苷的含量為33毫克至10克、所述(-)-表 沒食子兒茶素的含量為17毫克至10克、所述木犀草素的含量為16毫克至10克、所述金絲桃 苷的含量為25毫克至10克、所述檉柳素的含量為17毫克至10克、所述黃芩素的含量為15毫 克至10克、所述蕓香素的含量為15毫克至10克、所述黃芩的含量為24毫克至10克、所述芹菜 素的含量為15毫克至10克、所述( + )_表兒茶素的含量為16毫克至10克、所述(-)-表兒茶素 沒食子酸酯的含量為24毫克至10克、所述牡荊素的含量為24毫克至10克、所述金雀異黃酮 的含量為15_克至10克、所述異鼠李素的含量為14暈克至10克、所述香葉木素的含量為33 毫克至10克、所述葛根素的含量為23毫克至10克、所述傘形花內(nèi)酯的含量為9毫克至10克、 所述高良姜素的含量為0.8毫克至10克、所述非瑟酮的含量為0.8毫克至10克。
【文檔編號】A61K31/192GK105832738SQ201610140172
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2011年4月20日
【發(fā)明人】胡幼圃, 楊東和, 熊正輝, 張溫良, 石東原, 何欣恬
【申請人】國防教育研究基金會