1.相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年10月9日提交的美國臨時專利申請no.62/062,021；2014年11月11日提交的美國臨時專利申請no.62/078,321；2015年1月14日提交的美國臨時專利申請no.62/103,515；2015年5月27日提交的美國臨時專利申請no.62/167,052；和2015年6月2日提交的美國臨時專利申請no.62/170,015的優(yōu)先權(quán)；為了所有目的將它們每一篇的全部內(nèi)容通過引用合并在文本中。

2.政府許可權(quán)

本發(fā)明是利用國家衛(wèi)生研究所頒發(fā)的款項編號dk070790和dk089137的政府支持下作出的。政府在本發(fā)明中擁有一定權(quán)利。

3.序列表

本申請與文件名為12827_934_228_seqlisting.txt、大小208千字節(jié)、2015年10月6日創(chuàng)建的序列表一起提交。為了所有目的，序列表通過完全引用合并在本文中。

4.技術(shù)領(lǐng)域

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、和/或與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病的方法，包括向所述對象施用激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，例如，激活素配體陷阱(activinligandtrap))。更具體地，本文提供的是選擇對象來治療心血管疾病、血管鈣化、動脈硬化水平升高、左心室肥大、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病、與左心室肥大相關(guān)和/或由左心室肥大引起的心血管疾病、和/或與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病的方法，通過利用一種或更多種生物標(biāo)記物的水平和/或活性，特別是，snail同源物1(snai1)、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dickkopf同源物1(dkk1)、1型膠原蛋白alpha1(col1a1)、激活素(例如，游離激活素)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runx2)、堿性磷酸酶(alp)、骨特異性堿性磷酸酶(bsap)、osterix、c-末端1型膠原蛋白端肽(ctx)、klotho、alpha-平滑肌動蛋白(alpha-sma)、心肌素(myocardin，myocd)、axis抑制蛋白質(zhì)2(axin2)和/或平滑肌蛋白22-alpha(sm22-alpha)，作為用激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的對象對治療的響應(yīng)、治療效果或適當(dāng)劑量的指示。本文提供的是降低對象的骨吸收的方法，包括向所述對象施用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。更具體地，本文提供的是選擇對象來降低骨吸收的方法，通過利用一種或更多種生物標(biāo)記物的水平和/或活性，特別是snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、osterix、ctx、klotho、alpha-sma、myocd和/或sm22-alpha，作為用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的對象對治療的響應(yīng)、治療效果或適當(dāng)劑量的指示。

5.背景

涉及貧血的腎病的常見并發(fā)癥是血管鈣化，在很多情況下其導(dǎo)致心血管疾病。在腎臟對象中，除了腎臟疾病本身相關(guān)的死亡之外，動脈粥樣硬化和所產(chǎn)生的心血管疾病可能導(dǎo)致顯著的死亡。因而，對于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)用于腎臟對象的心血管疾病的新藥物以及治療和/或預(yù)防方法存在著持續(xù)的需求。另外，由于腎臟對象經(jīng)?；加胸氀幸娴氖怯脝我坏闹委焺﹣碇委熦氀桶殡S的心血管疾病，這是當(dāng)前使用的紅細(xì)胞生成刺激試劑(esas)例如促紅細(xì)胞生成素所不具有的能力。

兩種相關(guān)的ii型受體actriia和actriib已經(jīng)被鑒定為激活素的ii型受體(mathewsandvale,1991,cell65:973-982；attisanoetal.,1992,cell68:97-108)。除了激活素之外，actriia和actriib可以與幾種其他的tgf-beta家族蛋白，包括bmp7、nodal、gdf8和gdf11生物化學(xué)地相互作用(yamashitaetal.,1995,j.cellbiol.130:217-226；leeandmcpherron,2001,proc.natl.acad.sci.98:9306-9311；yeoandwhitman,2001,mol.cell7:949-957；ohetal.,2002,genesdev.16:2749-54)。alk4是激活素的主要的i型受體，特別是對于激活素a，alk-7也可以充當(dāng)激活素的受體，特別是對于激活素b。

激活素配體陷阱，由人源化的融合蛋白組成，所述融合蛋白由激活素iia型受體(actriia)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和人igg1fc組成(在此稱為actriia-hfc或“sotatercept”；seqidno：7)，當(dāng)前在ii期臨床試驗中被評估，用于治療患有與終末期腎病(esrd)相關(guān)的貧血和骨失調(diào)的對象以及患有beta-地中海貧血的那些對象。在健康的絕經(jīng)后女性中，actriia-hfc也顯示了顯著地提高血細(xì)胞比容(hct)和血紅蛋白(hgb)以及骨礦物密度。

6.概述

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的血管鈣化的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象具有：(a)與參考群體中的runx2水平相比提高的runx2水平；(b)與參考群體中的alp水平相比提高的alp水平；(c)與參考群體中的snai1水平相比提高的snai1水平；(d)與參考群體中的phosphosmad2水平相比提高的phosphosmad2水平；(e)與參考群體中的dkk1水平相比提高的dkk1水平；(f)與參考群體中的col1a1水平相比提高的col1a1水平；(g)與參考群體中的激活素水平相比提高的激活素(例如，游離激活素)水平；(h)與參考群體中的bsap水平相比提高的bsap水平；(i)與參考群體中的osterix水平相比提高的osterix水平；(j)與參考群體中的ctx水平相比提高的ctx水平；(k)與參考群體中的klotho水平相比降低的klotho水平；(l)與參考群體中的alpha-sma水平相比降低的alpha-sma水平；(m)與參考群體中的myocd水平相比降低的myocd水平；(n)與參考群體中的sm22-alpha水平相比降低的sm22-alpha水平；(o)與參考群體中的phosphosmad3水平相比提高的phosphosmad3水平；(p)與參考群體中的尿蛋白水平相比提高的尿蛋白水平；和/或(q)與參考群體中的actriia水平相比降低的激活素2a型受體(actriia)水平。參見，例如，8.6章節(jié)對參考群體的描述。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象具有：(a)與參考群體中的runx2水平相比提高的runx2水平；(b)與參考群體中的alp水平相比提高的alp水平；(c)與參考群體中的snai1水平相比提高的snai1水平；(d)與參考群體中的phosphosmad2水平相比提高的phosphosmad2水平；(e)與參考群體中的dkk1水平相比提高的dkk1水平；(f)與參考群體中的col1a1水平相比提高的col1a1水平；(g)與參考群體中的激活素水平相比提高的激活素(例如，游離激活素)水平；(h)與參考群體中的bsap水平相比提高的bsap水平；(i)與參考群體中的osterix水平相比提高的osterix水平；(j)與參考群體中的ctx水平相比提高的ctx水平；(k)與參考群體中的klotho水平相比降低的klotho水平；(l)與參考群體中的alpha-sma水平相比降低的alpha-sma水平；(m)與參考群體中的myocd水平相比降低的myocd水平；(n)與參考群體中的sm22-alpha水平相比降低的sm22-alpha水平；(o)與參考群體中的phosphosmad3水平相比提高的phosphosmad3水平；(p)與參考群體中的尿蛋白水平相比提高的尿蛋白水平；和/或(q)與參考群體中的actriia水平相比降低的actriia水平。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象具有：(a)與參考群體中的runx2水平相比提高的runx2水平；(b)與參考群體中的alp水平相比提高的alp水平；(c)與參考群體中的snai1水平相比提高的snai1水平；(d)與參考群體中的phosphosmad2水平相比提高的phosphosmad2水平；(e)與參考群體中的dkk1水平相比提高的dkk1水平；(f)與參考群體中的col1a1水平相比提高的col1a1水平；(g)與參考群體中的激活素水平相比提高的激活素(例如，游離激活素)水平；(h)與參考群體中的bsap水平相比提高的bsap水平；(i)與參考群體中的osterix水平相比提高的osterix水平；(j)與參考群體中的ctx水平相比提高的ctx水平；(k)與參考群體中的klotho水平相比降低的klotho水平；(l)與參考群體中的alpha-sma水平相比降低的alpha-sma水平；(m)與參考群體中的myocd水平相比降低的myocd水平；(n)與參考群體中的sm22-alpha水平相比降低的sm22-alpha水平；(o)與參考群體中的phosphosmad3水平相比提高的phosphosmad3水平；(p)與參考群體中的尿蛋白水平相比提高的尿蛋白水平；和/或(q)與參考群體中的actriia水平相比降低的actriia水平，以及其中所述心血管疾病與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象具有：(a)與參考群體中的runx2水平相比提高的runx2水平；(b)與參考群體中的alp水平相比提高的alp水平；(c)與參考群體中的snai1水平相比提高的snai1水平；(d)與參考群體中的phosphosmad2水平相比提高的phosphosmad2水平；(e)與參考群體中的dkk1水平相比提高的dkk1水平；(f)與參考群體中的col1a1水平相比提高的col1a1水平；(g)與參考群體中的激活素水平相比提高的激活素(例如，游離激活素)水平；(h)與參考群體中的bsap水平相比提高的bsap水平；(i)與參考群體中的osterix水平相比提高的osterix水平；(j)與參考群體中的ctx水平相比提高的ctx水平；(k)與參考群體中的klotho水平相比降低的klotho水平；(l)與參考群體中的alpha-sma水平相比降低的alpha-sma水平；(m)與參考群體中的myocd水平相比降低的myocd水平；(n)與參考群體中的sm22-alpha水平相比降低的sm22-alpha水平；(o)與參考群體中的phosphosmad3水平相比提高的phosphosmad3水平；(p)與參考群體中的尿蛋白水平相比提高的尿蛋白水平；和/或(q)與參考群體中的actriia水平相比降低的actriia水平，以及其中所述心血管疾病與腎病相關(guān)和/或由腎病引起。

本文提供的是降低對象的骨吸收的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象具有：(a)與參考群體中的runx2水平相比提高的runx2水平；(b)與參考群體中的alp水平相比提高的alp水平；(c)與參考群體中的snai1水平相比提高的snai1水平；(d)與參考群體中的phosphosmad2水平相比提高的phosphosmad2水平；(e)與參考群體中的dkk1水平相比提高的dkk1水平；(f)與參考群體中的col1a1水平相比提高的col1a1水平；(g)與參考群體中的激活素水平相比提高的激活素(例如，游離激活素)水平；(h)與參考群體中的bsap水平相比提高的bsap水平；(i)與參考群體中的osterix水平相比提高的osterix水平；(j)與參考群體中的ctx水平相比提高的ctx水平；(k)與參考群體中的klotho水平相比降低的klotho水平；(l)與參考群體中的alpha-sma水平相比降低的alpha-sma水平；(m)與參考群體中的myocd水平相比降低的myocd水平；(n)與參考群體中的sm22-alpha水平相比降低的sm22-alpha水平；(o)與參考群體中的phosphosmad3水平相比提高的phosphosmad3水平；(p)與參考群體中的尿蛋白水平相比提高的尿蛋白水平；和/或(q)與參考群體中的actriia水平相比降低的actriia水平。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的動脈硬化的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象具有：(a)與參考群體中的runx2水平相比提高的runx2水平；(b)與參考群體中的alp水平相比提高的alp水平；(c)與參考群體中的snai1水平相比提高的snai1水平；(d)與參考群體中的phosphosmad2水平相比提高的phosphosmad2水平；(e)與參考群體中的dkk1水平相比提高的dkk1水平；(f)與參考群體中的col1a1水平相比提高的col1a1水平；(g)與參考群體中的激活素水平相比提高的激活素(例如，游離激活素)水平；(h)與參考群體中的bsap水平相比提高的bsap水平；(i)與參考群體中的osterix水平相比提高的osterix水平；(j)與參考群體中的ctx水平相比提高的ctx水平；(k)與參考群體中的klotho水平相比降低的klotho水平；(l)與參考群體中的alpha-sma水平相比降低的alpha-sma水平；(m)與參考群體中的myocd水平相比降低的myocd水平；(n)與參考群體中的sm22-alpha水平相比降低的sm22-alpha水平；(o)與參考群體中的phosphosmad3水平相比提高的phosphosmad3水平；(p)與參考群體中的尿蛋白水平相比提高的尿蛋白水平；和/或(q)與參考群體中的actriia水平相比降低的actriia水平。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的左心室肥大的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的激活素ii型受體(actrii)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象具有：(a)與參考群體中的runx2水平相比提高的runx2水平；(b)與參考群體中的alp水平相比提高的alp水平；(c)與參考群體中的snai1水平相比提高的snai1水平；(d)與參考群體中的phosphosmad2水平相比提高的phosphosmad2水平；(e)與參考群體中的dkk1水平相比提高的dkk1水平；(f)與參考群體中的col1a1水平相比提高的col1a1水平；(g)與參考群體中的激活素水平相比提高的激活素(例如，游離激活素)水平；(h)與參考群體中的bsap水平相比提高的bsap水平；(i)與參考群體中的osterix水平相比提高的osterix水平；(j)與參考群體中的ctx水平相比提高的ctx水平；(k)與參考群體中的klotho水平相比降低的klotho水平；(l)與參考群體中的alpha-sma水平相比降低的alpha-sma水平；(m)與參考群體中的myocd水平相比降低的myocd水平；(n)與參考群體中的sm22-alpha水平相比降低的sm22-alpha水平；(o)與參考群體中的phosphosmad3水平相比提高的phosphosmad3水平；(p)與參考群體中的尿蛋白水平相比提高的尿蛋白水平；和/或(q)與參考群體中的actriia水平相比降低的actriia水平。

在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效劑量的所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約15mg、約30mg、約45mg、約60mg、約75mg、約90mg或約1g或約0.1mg/kg、約0.13mg/kg、約0.2mg/kg、約0.26mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg或約1.5mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.1mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.3mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.5mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.7mg/kg。

在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量通過注射來施用。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量(i)每28天一次；或(ii)每42天一次施用。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量每14天施用一次。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量每21天施用一次。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量連續(xù)地和/或無限地施用。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的提高的水平分別比參考群體中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterixs水平高約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的提高的水平分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％高于參考群體的前10％、前5％、前4％、前3％、前2％或前1％中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterixs的水平。

在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的降低的水平分別比參考群體中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平低約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％。

在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的降低的水平分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％低于參考群體的后10％、后5％、后4％、后3％、后2％或后1％中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的血管鈣化的方法，其中所述方法包括：(a)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(b)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第一次測量；(c)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第二次測量；和(d)向所述對象施用調(diào)整的劑量的所述激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。在某些實施方式中，所述劑量是如章節(jié)8.3.4中描述調(diào)整的。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病的方法，其中所述方法包括：(a)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(b)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第一次測量；(c)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第二次測量；和(d)向所述對象施用調(diào)整的劑量的所述激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。在某些實施方式中，所述劑量是如章節(jié)8.3.4中描述調(diào)整的。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病的方法，其中所述方法包括：(a)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(b)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第一次測量；(c)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第二次測量；和(d)向所述對象施用調(diào)整的劑量的所述激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；其中所述心血管疾病與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。在某些實施方式中，所述劑量是如章節(jié)8.3.4中描述調(diào)整的。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病的方法，其中所述方法包括：(a)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(b)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第一次測量；(c)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第二次測量；和(d)向所述對象施用調(diào)整的劑量的所述激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；其中所述心血管疾病與腎病相關(guān)和/或由腎病引起。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。在某些實施方式中，所述劑量是如章節(jié)8.3.4中描述調(diào)整的。

本文提供的是降低對象的骨吸收的方法，其中所述方法包括：(a)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(b)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第一次測量；(c)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第二次測量；和(d)向所述對象施用調(diào)整的劑量的所述激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，骨吸收是如章節(jié)8.6中評估的。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。在某些實施方式中，所述劑量是如章節(jié)8.3.4中描述調(diào)整的。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的動脈硬化的方法，其中所述方法包括：(a)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(b)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第一次測量；(c)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第二次測量；和(d)向所述對象施用調(diào)整的劑量的所述激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，動脈硬化的是如章節(jié)8.6中評估的。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。在某些實施方式中，所述劑量是如章節(jié)8.3.4中描述調(diào)整的。

本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的左心室肥大的方法，其中所述方法包括：(a)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(b)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第一次測量；(c)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的第二次測量；和(d)向所述對象施用調(diào)整的劑量的所述激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。在某些實施方式中，所述劑量是如章節(jié)8.3.4中描述調(diào)整的。

在某些實施方式中，所述初始劑量的所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約15mg、約30mg、約45mg、約60mg、約75mg、約90mg或約1g或約0.1mg/kg、約0.13mg/kg、約0.2mg/kg、約0.26mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg或約1.5mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量的所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.1mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量的所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.3mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量的所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.5mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量的所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是約0.7mg/kg。

在某些實施方式中，所述初始劑量是通過注射施用的。在某些實施方式中，所述初始劑量是(i)每28天施用一次；或(ii)每42天施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是每14天施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是每21天施用一次。

在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的所述調(diào)整的劑量大于所述初始劑量，如果：(a)與參考群體中runx2的水平相比runx2的水平升高；(b)與參考群體中alp的水平相比alp的水平升高；(c)與參考群體中snai1的水平相比snai1的水平升高；(d)與參考群體中phosphosmad2的水平相比phosphosmad2的水平升高；(e)與參考群體中dkk1的水平相比dkk1的水平升高；(f)與參考群體中col1a1的水平相比col1a1的水平升高；(g)與參考群體中激活素的水平相比激活素的水平升高；(h)與參考群體中bsap的水平相比bsap的水平升高；(i)與參考群體中ctx的水平相比ctx的水平升高；(j)與參考群體中osterix的水平相比osterix的水平升高；(k)與參考群體中klotho的水平相比klotho的水平降低；(l)與參考群體中alpha-sma的水平相比alpha-sma的水平降低；(m)與參考群體中myocd的水平相比myocd的水平降低；(n)與參考群體中sm22-alpha的水平相比sm22-alpha的水平降低；(o)與參考群體中phosphosmad3的水平相比ppospposmad3的水平升高；(p)與參考群體中尿蛋白的水平相比尿蛋白的水平升高；(q)與參考群體中actriia的水平相比actriia的水平降低；和/或(r)與參考群體中axin2的水平相比axin2的水平降低。

在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是約2.5mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg或約35mg大于所述初始劑量，或約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.15mg/kg、約0.25mg/kg、約0.3mg/kg、約0.35mg/kg、約0.4mg/kg或約0.5mg/kg大于所述初始劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量比所述初始劑量更頻繁地施用。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量每5、10、15、20、25、28、30、35或40天施用。

在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的所述調(diào)整的劑量小于所述初始劑量，如果：(a)與參考群體中runx2的水平相比runx2的水平降低；(b)與參考群體中alp的水平相比alp的水平降低；(c)與參考群體中bsap的水平相比bsap的水平降低；(d)與參考群體中snai1的水平相比snai1的水平降低；(e)與參考群體中phosphosmad2的水平相比phosphosmad2的水平降低；(f)與參考群體中dkk1的水平相比dkk1的水平降低；(g)與參考群體中col1a1的水平相比col1a1的水平降低；(h)與參考群體中激活素(例如，游離激活素)的水平相比激活素(例如，游離激活素)的水平降低；(i)與參考群體中ctx的水平相比ctx的水平降低；(j)與參考群體中osterix的水平相比osterix的水平降低；(k)與參考群體中klotho的水平相比klotho的水平升高；(l)與參考群體中alpha-sma的水平相比alpha-sma的水平升高；(m)與參考群體中myocd的水平相比myocd的水平升高；(n)與參考群體中sm22-alpha的水平相比sm22-alpha的水平升高；(o)與參考群體中phosphosmad3的水平相比ppospposmad3的水平降低；(p)與參考群體中尿蛋白的水平相比尿蛋白的水平降低；(q)與參考群體中actriia的水平相比actriia的水平升高；和/或(r)與參考群體中axin2的水平相比axin2的水平升高。

在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是約2.5mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg或約35mg小于所述初始劑量，或約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.15mg/kg、約0.25mg/kg、約0.3mg/kg、約0.35mg/kg、約0.4mg/kg或約0.5mg/kg小于所述初始劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量比所述初始劑量較少頻繁地施用。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量每30、35、40、42、50、60、70、80或90天施用。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量連續(xù)地和/或無限地施用。

在某些實施方式中，所述第一次測量在治療的開始之前進(jìn)行。在某些實施方式中，所述第一次測量在治療的開始之后立即進(jìn)行，或在其最多1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周、2周、3周、4周或2個月之內(nèi)進(jìn)行。在某些實施方式中，所述第二次測量在治療開始后立即進(jìn)行，或在其最多1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周、2周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月之內(nèi)進(jìn)行。

在某些實施方式中，(a)snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的升高的水平分別高于參考群體中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的水平約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％；和/或(b)klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的降低的水平分別低于參考群體中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％。

在某些實施方式中，(a)snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的升高的水平分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％高于參考群體中的前10％、前5％、前4％、前3％、前2％或前1％中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的水平；(b)klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的降低的水平分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％低于參考群體中的后10％、后5％、后4％、后3％、后2％或后1％中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平。

在某些實施方式中，(a)klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的升高的水平分別高于參考群體中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％，和/或(b)snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的降低的水平分別低于參考群體snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的水平約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％。

在某些實施方式中，(a)klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的升高的水平分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％高于參考群體的前10％、前5％、前4％、前3％、前2％或前1％中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平；和/或(b)snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的降低的水平分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％低于參考群體的后10％、后5％、后4％、后3％、后2％或后1％中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的水平。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平分別是snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的蛋白質(zhì)水平。在某些實施方式中，所述蛋白質(zhì)水平通過酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)來測定。在某些實施方式中，進(jìn)行elisa，用(a)runx2-特異性抗體sc-390715(santacruz)來測定runx2水平；(b)用alp-特異性抗體sc-98652(santacruz)來測定alp水平；(c)snai1-特異性抗體sc-393172(santacruz)來測定snai1水平；(d)用phosphosmad2-特異性抗體sc-101801(santacruz)來測定phosphosmad2水平；(e)用dkk1-特異性抗體sc-374574(santacruz)來測定dkk1水平；(f)用col1a1-特異性抗體sc-8784(santacruz)來測定col1a1水平；(g)用激活素-特異性抗體a1594(sigmaaldrich)來測定激活素水平；(h)用bsap-特異性抗體sc-98652(santacruz)來測定bsap水平；(i)用ctx-特異性抗體abin1173415(antibodiesonline)來測定ctx水平；(j)用osterix-特異性抗體sc-22538(santacruz)來測定osterix水平；(k)用klotho-特異性抗體sc-22218(santacruz)來測定klotho水平；(l)用alpha-sma-特異性抗體sc-53142(santacruz)來測定alpha-sma水平；(m)用myocd-特異性抗體sc-21561(santacruz)來測定myocd水平；(n)用sm22-alpha-特異性抗體sc-271719(santacruz)來測定sm22-alpha水平；(o)用phosphosmad3-特異性抗體sc-11769(santacruz)來測定phosphosmad3水平；和/或(p)用actriia-特異性抗體ab135634(abcam)來測定actriia水平。

在某些實施方式中，snai1、dkk1、col1a1、激活素、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的平分別是snai1、dkk1、col1a1、激活素、runx2,alp,bsap,ctx,osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的mrna水平。在某些實施方式中，所述mrna水平通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)來測定。在某些實施方式中，進(jìn)行qrt-pcr，用(a)runx2-特異性引物(seqidno：48和49)來測定runx2水平；(b)用alp-特異性引物(seqidno：50和51)來測定alp水平；(c)用snai1-特異性引物(seqidno：78和79)來測定snai1水平；(d)用dkk1-特異性引物(seqidno：80和81)來測定dkk1水平；(e)用col1a1-特異性引物(seqidno：82和83)來測定col1a1水平；(f)用激活素-特異性引物(seqidno：84和85)來測定激活素水平；(g)用osterix-特異性引物(seqidno：52和53)來測定osterix水平；(h)用klotho-特異性引物(seqidno：54和55)來側(cè)klotho水平；和/或(i)用sm22-alpha-特異性引物(seqidno：56和57)來測定sm22-alpha水平。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是組織中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2水平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad3、尿蛋白、phosphosmad2、actriia、axin2和col1a1水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是主動脈中的。

在某些實施方案中，所述血管鈣化是鈣化性動脈粥樣硬化、鈣化的中層血管病變(也稱為中層鈣化性硬化癥)、中層鈣化、彈性蛋白沉積、鈣化尿毒癥性動脈病變，鈣化性主動脈瓣膜狹窄或門靜脈鈣化。

在某些實施方式中，所述心血管疾病是與以下相關(guān)的疾?。貉茆}化例如動脈粥樣硬化、高脂血癥、骨質(zhì)疏松癥、高血壓、炎癥、2型糖尿病、終末期腎病、所需截肢、彈性假黃瘤、先天性二尖瓣、風(fēng)濕性心臟病、門靜脈高壓癥或肝臟疾病。

在某些實施方式中，所述心血管疾病是繼發(fā)于慢性腎病的。在某些實施方式中，所述慢性腎病是3、4或5期慢性腎病。在某些實施方式中，所述慢性腎病是慢性腎病礦物質(zhì)和骨骼疾病。

在某些實施方式中，所述對象患有高周轉(zhuǎn)性骨病，例如，高周轉(zhuǎn)性腎性骨營養(yǎng)不良(rod)。

本文還提供的是一種治療高周轉(zhuǎn)性骨病，例如，高周轉(zhuǎn)性rod的方法，包括向?qū)ο笫┯盟帉W(xué)上有效量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。

在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是包含選自以下構(gòu)成的組的氨基酸序列的多肽：(a)90％相同于seqidno：2；(b)95％相同于seqidno：2；(c)98％相同于seqidno：2；(d)seqidno：2；(e)90％相同于seqidno：3；(f)95％相同于seqidno：3；(g)98％相同于seqidno：3；(h)seqidno：3；(i)90％相同于seqidno：6；(j)95％相同于seqidno：6；(k)98％相同于seqidno：6；(l)seqidno：6；(m)90％相同于seqidno：7；(n)95％相同于seqidno：7；(o)98％相同于seqidno：7；(p)seqidno：7；(q)90％相同于seqidno：12；(r)95％相同于seqidno：12；(s)98％相同于seqidno：12；(t)seqidno：12；(u)90％相同于seqidno：17；(v)95％相同于seqidno：17；(w)98％相同于seqidno：17；(x)seqidno：17；(y)90％相同于seqidno：20；(z)95％相同于seqidno：20；(aa)98％相同于seqidno：20；(bb)seqidno：20；(cc)90％相同于seqidno：21；(dd)95％相同于seqidno：21；(ee)98％相同于seqidno：21；以及(ff)seqidno：21。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是包含seqidno：7的氨基酸序列的多肽。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是由actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和人igg1fc結(jié)構(gòu)域組成的人源化的融合蛋白。

在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是sotatercept(seqidno：7；參見，例如，章節(jié)9)。sotatercept是一種激活素配體陷阱，其在本文描述的方法中是有用的(參見章節(jié)8)。

在某些實施方式中，所述對象是人類。

7.附圖簡述

附圖1a描繪了與野生型和假(sham)模型相比在腎病的間質(zhì)性纖維化模型(ckd-3)中提高的激活素-a水平(pg/ml)。附圖1b描繪了與野生型(wt)相比在腎病的aiports模型(aiport200d)中提高的激活素-a水平(pg/ml)以及在用bmp-7治療時提高的激活素-a水平。

附圖2描繪了與假的相比在ckd-3模型(ckd-3v)的腎臟和主動脈中提高的激活素a(抑制素beta)mrna水平。用mactriia-fc治療降低了ckd-3模型中的激活素amrna(mactriia-fc)。

附圖3a描繪了野生型小鼠主動脈中的actrii水平。附圖3b描繪了在假治療的小鼠主動脈中的actrii水平。附圖3c描繪了與附圖3a和/或附圖3b相比在ckd-3模型的小鼠主動脈中提高的actrii水平。附圖3d描繪了與附圖3c相比在mactriia-fc治療的ckd-3模型的小鼠主動脈中降低的actrii水平。

附圖4a描繪了在有(ckd3+actrii-fc)和沒有(ckd3+v)actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療時慢性腎病小鼠模型中runx2的mrna水平。附圖4b描繪了在有(ckd3+actrii-fc)和沒有(ckd3+v)actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療時慢性腎病小鼠模型中alp的mrna水平。附圖4c描繪了在有(ckd3+actrii-fc)和沒有(ckd3+v)actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療時慢性腎病小鼠模型中klotho的mrna水平。附圖4d描繪了在有(ckd3+actrii-fc)和沒有(ckd3+v)actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療時慢性腎病小鼠模型中心肌素(myocd)的mrna水平。附圖4e描繪了在有(ckd3+actrii-fc)和沒有(ckd3+v)actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療時慢性腎病小鼠模型中sm22-alpha(sm22α)的mrna水平。

附圖4f描繪了與用單獨的溶媒(ckd3+vehicle)治療或偽治療的ckd3相比，在用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(ckd3+actrii-fc)治療的ckd-3模型中肌動蛋白alpha-平滑肌、runx2、klotho、myocd和alpha-微管蛋白的蛋白質(zhì)水平。

附圖5a描繪了在用溶媒(veh.rx)治療時ckd-3誘導(dǎo)的血管鈣化。附圖5b描繪了用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(mactriia-fcrx)治療時降低的ckd-3誘導(dǎo)的血管鈣化。

附圖6a描繪了與野生型(wt)、假的、用溶媒治療的ckd-3模型(ckd-3veh)相比，鈣水平的ckd-3誘導(dǎo)的提高(ckd-322wk)。用mactriia-fc治療降低了ckd-3誘導(dǎo)的鈣積累(mactriia-fc)。附圖6b描繪了用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(mactriia-fc)治療的野生型小鼠(wt)、假治療的小鼠(sham)、ckd-3小鼠模型(ckd-3)或小鼠模型ckd-3的骨量。附圖6c描繪了用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(mactriia-fc)治療的野生型小鼠(wt)、假治療的小鼠(sham)、ckd-3小鼠模型(ckd-3)或小鼠模型ckd-3的破骨細(xì)胞數(shù)目。附圖6d描繪了用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(mactriia-fc)治療的野生型小鼠(wt)、假治療的小鼠(sham)、ckd-3小鼠模型(ckd-3)或小鼠模型ckd-3的破骨細(xì)胞表面。

附圖7a描繪了在gnz小鼠(stolleretal,genesis,2008)培育成內(nèi)皮特異性tie2-cre(也稱為“tek-cre”)小鼠中進(jìn)行的細(xì)胞譜系跟蹤的策略。附圖7b描繪了假的小鼠中的內(nèi)皮細(xì)胞譜系跟蹤。附圖7c描繪了ckd小鼠中的內(nèi)皮細(xì)胞譜系跟蹤。附圖7d描繪了ckd小鼠中的內(nèi)皮細(xì)胞譜系跟蹤。

附圖8描繪了對象分布。注意：“·”表示對象在基線和第225天有匹配的qct測量?！?”表示接受安慰劑的對象具有提高的血清促紅細(xì)胞生成素水平，表明方案之外的促紅細(xì)胞生成素施用。表示方案違背。表示對象在第29天滿足了血壓升高的停止規(guī)則指標(biāo)；研究治療被停止，在第26天實施挽回治療，繼續(xù)跟蹤。在基線時，根據(jù)不完備的評估，對象隨機分配不合格的血壓。

附圖9a描繪了在每個治療類別中具有大于2％的股骨頸部皮層骨提高的對象百分比。附圖9b描繪了在每個治療組中有腰椎小梁骨質(zhì)量的任何提高或降低的對象百分比。

附圖10a描繪了每個治療類別中總agatston得分改變的對象的百分比。附圖10b描繪了每個治療類別中平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分改變的對象的百分比。

附圖11描繪了安慰劑(pbo)治療的對象或用劑量0.3mg/kg(0.3)或0.5mg/kg(0.5)的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的對象的骨吸收生物標(biāo)記物(ctx)變化的百分比。

附圖12a表明用mactriia-fc(ckd-3r)以10mg/kg每周兩次皮下地治療的ckd-3小鼠對菊糖清除沒有影響。附圖12b表明用mactriia-fc(ckd-3r)以10mg/kg每周兩次皮下地治療的ckd-3小鼠對bun沒有影響。附圖12a和附圖12b利用了帶有ablativeckd的血管鈣化模型，如章節(jié)9.4.1.1中描述的，來產(chǎn)生與稱為ckd-3的人類ckd3期類似的降低的腎臟功能(溶媒治療的為ckd-3v)，通過菊糖清除和bun來估計，與wtc57b6小鼠(wt)相比具有g(shù)fr的70％降低。附圖12c表明200天齡的col4α5缺陷小鼠(alport)具有與人類3-4期ckd相當(dāng)?shù)木仗乔宄档汀?p<0.05。附圖12d表明200天齡的col4α5缺陷小鼠(alport)具有與人類3-4期cdk相當(dāng)?shù)腷un提高。*p<0.05。

附圖13表明ckd提高循環(huán)中的激活素以及腎臟和主動脈的actriia表達(dá)。“wt”＝野生型；“sham”＝假治療的小鼠；“ckd-3v”＝用溶媒治療的小鼠；“ckd-3r”＝用mactriia-fc治療的小鼠。附圖13a描繪了在如章節(jié)9.4.1.1中描述的ldlr-/-高脂肪飼喂的ckd-3小鼠模型中通過ckd的循環(huán)激活素-a誘導(dǎo)。附圖13b描繪了在如章節(jié)9.4.1.1中描述的alport’s綜合征小鼠中ckd對循環(huán)激活素-a的誘導(dǎo)。附圖13c表明小鼠腎臟和主動脈中的抑制素betaa表達(dá)(激活素-a由抑制素betaa基因的同二聚體形成)。附圖13d表明腎臟勻漿中抑制素betaa的蛋白水平。1，2和3是指單個樣品。附圖13e描繪了主動脈actriia的免疫組織化學(xué)。在野生型(wt)和假操作的ldlr-^/-高脂肪飼喂小鼠(sham)的主動脈中檢測到actriia表達(dá)，其是在用溶媒(ckd-3v)或mactriia-fc(ckd-3mactriia-fc)治療的ckd-3小鼠中刺激出的。比例尺是20μm。附圖13f表明，與wt和sham小鼠相比，在ckd-3小鼠(用溶媒治療的，ckd-3v；或用mactriia-fc治療的，ckd-3r)中循環(huán)卵泡抑素水平?jīng)]有改變。*p<0.05，***p<0.005。附圖13g表明，與wt和sham小鼠相比，在ckd-3小鼠(用溶媒治療的，ckd-3v；或用mactriia-fc治療的，ckd-3r)中循環(huán)卵泡抑素樣3(fstl3)水平?jīng)]有改變。*p<0.05，***p<0.005。

附圖14表明ckd刺激的內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變。附圖14a描繪了小鼠繁育策略的圖表。rosa26gnz敲入小鼠(gnz小鼠)具有帶終止密碼子的序列，其防止核定位的gfp-lacz報告物的表達(dá)(gnz)。當(dāng)與在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)cre重組酶(cre)的tek-cre小鼠繁育時，cre重組酶(cre)刪除了側(cè)翼有l(wèi)oxp的序列，內(nèi)皮來源的所有細(xì)胞產(chǎn)生gnz報告物蛋白。附圖14b到附圖14d展現(xiàn)了使用dapi核染色，對于內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物cd31和gfp，tek-cre/gnz小鼠主動脈的雙倍免疫染色。箭頭指向雙重染色的內(nèi)皮細(xì)胞。在假操作的小鼠中(附圖14b)，僅內(nèi)皮細(xì)胞顯示了核和細(xì)胞質(zhì)的gfp染色。在ckd3小鼠中，(附圖14c和附圖14d)除了內(nèi)皮細(xì)胞之外，主動脈中層和外膜的細(xì)胞顯現(xiàn)了gfp染色(箭頭)。比例尺是20μm。附圖14e描繪了與enmt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子snai1(medici,d.,etal.,2008.molecularbiologyofthecell19:4875-4887.)的主動脈mrna水平，相比野生型(wt)小鼠，在75天齡的alport’s小鼠中提高。alpha微管蛋白充當(dāng)加載對照。1和2是指單獨的樣品。

附圖15描繪了在有ckd-3的ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中mactriia-fc對血管鈣化的作用。附圖15a描繪了來自溶媒-(ckd-3v)和mactriia-fc治療的(ckd-3mactriia-fc)ckd-3小鼠的近端主動脈動脈粥樣硬化斑塊的茜素紅染色的切片。附圖15b描繪了小鼠的組中的主動脈鈣水平：野生型(wt)；假操作的ldlr-/-高脂肪飼喂(sham)；在治療的建立之時，在22周安樂死的ckd-3(ckd-3)；從22到28周用溶媒治療的ckd-3(ckd-3v)；從22到28周用mactriia-fc、10mg/kg每周兩次皮下治療的ckd-3(ckd-3r)。方框代表中值(框中的線條)，四分位數(shù)范圍從25^th到75^th百分位。誤差棒代表四分位數(shù)范圍的1.5倍。各組用anovaholm-sidak方法進(jìn)行比較，進(jìn)行多重比較，p<0.05為顯著差異水平。*p<0.02，每個組的n為8-12。

附圖16表明降低的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對ckd刺激的心臟病的作用。附圖16a表明ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中的ckd-3提高了心臟重量，與假治療的小鼠相比，這在mactriia-fc治療的組中是反轉(zhuǎn)的。ckd-3-l是指用碳酸鑭治療的ckd-3小鼠。附圖16b表明產(chǎn)生了主要在左心室的心臟肥大(中間)，與sham小鼠(左側(cè))相比，這在mactriia-fc治療的組(右側(cè))中被防止。三色染色，比例尺1mm。附圖16c描繪了在更高放大率下的左室性肌細(xì)胞的三色染色，沒有展現(xiàn)心臟纖維化的證據(jù)。比例尺20μm。

附圖17展現(xiàn)了ldlr-/-高脂肪飼喂的ckd-3小鼠中ckd-3對血管硬化的作用，以及dkk1中和作用的缺乏。附圖17a描繪了左頸總動脈的如早先的報道(wagenseil,j.e.,etal.,2009.circulationresearch104:1217-1224；wagenseil,j.e.,etal.,2005.ajp-heartandcirculatoryphysiology289:h1209-h1217.)進(jìn)行的壓力-直徑關(guān)系。附圖17b描繪了來自野生型(wt-28周)、假操作的(sham-28周)、ckd-3(28周)和用dkk1單克隆抗體治療的ckd-3(dkk1mab-28周)小鼠的升主動脈。對于附圖17，黑色代表wt或假操作的小鼠，而空心或灰色代表ckd-3小鼠。數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來呈現(xiàn)。對于頸動脈，n＝5-6只小鼠，升主動脈為3-6只。

附圖18展現(xiàn)了腎臟和主動脈中的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。附圖18a描繪了來自假治療的、ckd-3溶媒-(ckd-3v)和mactriia-fc治療的(ckd-3r)小鼠的腎臟(左側(cè))和主動脈(右側(cè))的組織勻漿通過westerns測定的激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在腎臟組織勻漿中而不是在主動脈組織勻漿中激活素水平提高，alk4(acvr1b)和alk2(acvr1)1型受體存在于腎臟組織勻漿，而ckd-3不提高alk4磷酸化。alk4和alk1(acvrl1)存在于主動脈組織勻漿中。ckd-3提高了腎臟中而非主動脈中的smad2/3磷酸化，并提高了腎臟col1a1水平。mactriia-fcz治療降低了腎臟phosphosmad2/3和col1a1水平。在主動脈中，ckd-3不僅對phosphosmad2/3水平?jīng)]有影響，對phosphoerk1/2水平也沒有影響。runx2水平通過ckd-3提高，而通過mactriia-fc歸一化。附圖18b描繪了ckd-3小鼠的腎臟中klothomrna表達(dá)的降低，以及通過mactriia-fc治療對它的糾正。附圖18c描繪了來自假治療的、ckd-3溶媒和mactriia-fc治療的小鼠(左側(cè))的腎臟和主動脈組織勻漿的westerns中通過dkk1蛋白表達(dá)來標(biāo)記的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及ckd-3和mactriia-fc對血漿dkk1水平(右側(cè))的影響。

附圖19描繪了患有3期ckd的患者(n＝30)對比健康供體(n＝10)的血漿激活素-a水平。通過使用商業(yè)的elisa試劑盒(r&dsystems,minneapolis,mn)一式兩份測量樣品來產(chǎn)生數(shù)據(jù)。分析的變異系數(shù)是2.7％。***p<0.002學(xué)生t檢驗。

附圖20描繪了野生型小鼠(wt)、假治療的小鼠(sham)、ckd-3小鼠(ckd-3v)或用mactriia-fc治療的ckd-3小鼠(ckd-3r)中fgf-23的水平。

附圖21a描繪了野生型小鼠(wt)、假操作的小鼠(sham)、用溶媒治療的ckd-3小鼠(ckd-3v)或用mactriia-fc治療的ckd-3小鼠(ckd-3r)中循環(huán)激活素a的水平。*表示p<0.005。附圖21b描繪了假操作的小鼠(sham)、用溶媒治療的ckd-3小鼠(ckd-3v)或用mactriia-fc治療的ckd-3小鼠(ckd-3r)的成骨細(xì)胞數(shù)量/骨骼周長數(shù)/100mm。ckd-3vvs.ckd-3的p<0.05。附圖21c描繪了假操作的小鼠(sham)、用溶媒治療的ckd-3小鼠(ckd-3v)或用mactriia-fc治療的ckd-3小鼠(ckd-3r)的成骨細(xì)胞表面/骨表面的百分比。ckd-3vvs.ckd-3的p<0.05。附圖21d描繪了假操作的小鼠(sham)、用溶媒治療的ckd-3小鼠(ckd-3v)或用mactriia-fc治療的ckd-3小鼠(ckd-3r)的骨形成率/成骨細(xì)胞。ckd-3vvs.ckd-3的p<0.05。

附圖22a描繪了在以標(biāo)明的劑量用安慰劑或mactriia-fc治療時，在研究的過程中的對象分布。y軸的上的每個數(shù)字代表單獨的對象。附圖22b描繪了在以標(biāo)明的劑量用安慰劑或mactriia-fc治療時，在對象的腹部主動脈的總agatston得分上有<15％的發(fā)展的對象比例。附圖22c描繪了在以標(biāo)明的劑量用安慰劑或mactriia-fc治療時，在股骨頸部皮層bmd方面有>2％提高的對象的比例。

附圖23a描繪了actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc結(jié)構(gòu)域的小鼠融合蛋白(mactriia-fc)的示意圖。附圖23b描繪了在ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中mactriia-fc對ckd-mbd的影響的實驗設(shè)計。從12周(wks)齡開始，四個組中的小鼠飼喂高脂肪飲食。在12周進(jìn)行假手術(shù)(so)或電灼皮層損傷(ec)。在14周，進(jìn)行so或?qū)?cè)腎切除(nx)。在生命的22周，研究10mg/kg皮下每周兩次的溶媒治療或mactriia-fc。wt野生型小鼠食物飲食為正常參考水平。sham，假操作的ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠；ckd-3，在治療開始時在22周研究以建立血管鈣水平的ckd-3ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠；ckd-3v，溶媒治療的ckd-3ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠；ckd-3r，mactriia-fc治療的ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠；wt、sham、ckd-3v和ckd-3r小鼠在28周齡處死。

附圖24a描繪了通過westerns對主動脈組織勻漿中的actriia測定的、小鼠主動脈中actriia的表達(dá)。附圖24b描繪了附圖24a的免疫印跡定量。對于定量，n＝4，**p<0.0l。附圖24c描繪了sham小鼠的主動脈中actriia的免疫熒光檢測。附圖24d描繪了ckd-3小鼠的主動脈中actriia的免疫熒光檢測。actriia在主動脈vsmc中表達(dá)，但在內(nèi)皮細(xì)胞中沒有檢出。與sham相比，在ckd中vsmcactriia水平保持為可檢測的。cd31(箭頭)用作內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物。核用dapi染色。比例尺20μm。

附圖25a顯示了ckd-3引起成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)(runx2和堿性磷酸酶(alpl))的提高的mrna表達(dá)，以及降低水平的主動脈平滑肌細(xì)胞22α(tagln)這些全部被mactriia-fc的治療反轉(zhuǎn)。主動脈的心肌素(myocd)水平被ckd降低，但是不受mactriia-fc影響。附圖25b描繪了主動脈組織勻漿中蛋白質(zhì)的westerns。附圖25c描繪了附圖25b的westerns的免疫印跡定量。ckd引起主動脈的α-平滑肌細(xì)胞肌動蛋白的水平降低，以及成骨細(xì)胞的runx2的水平提高，其被mactriia-fc的治療反轉(zhuǎn)，但是心肌素水平?jīng)]有改變。對于定量，n＝4，**p<0.01。

附圖26a描繪了在患有ckd-3的ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中ckd和actriia配體陷阱對主動脈鈣化的影響，顯示了用來自溶媒的茜素紅對近端主動脈動脈粥樣硬化斑塊的染色切片。附圖26b描繪了在患有ckd-3并用mactriia-fc治療的ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中ckd和actriia配體陷阱對主動脈鈣化的影響，如茜素紅染色的近端主動脈動脈粥樣硬化斑塊所示。箭頭表示內(nèi)膜中的鈣沉積(i)；m-中層。比例尺100μm。附圖26c描繪了小鼠的組中的主動脈鈣水平：野生型(wt)；假操作的ldlr-/-高脂肪飼喂(sham)；在治療的建立之時，在22周安樂死的ckd-3(ckd-3)；從22到28周用溶媒治療的ckd-3(ckd-3v)；從22到28周用mactriia-fc、10mg/kg每周兩次皮下治療的ckd-3(ckd-3r)。方框代表中值(框中的線條)，四分位數(shù)范圍從25th到75th百分位。誤差棒代表四分位數(shù)范圍的1.5倍。l各組用anovaholm-sidak方法進(jìn)行比較；進(jìn)行多重比較；p<0.05作為顯著差異水平。*p<0.02；每個組的n為8-12。

附圖27a描繪了來自假治療的、ckd-3溶媒和ckd-3mactriia-fc治療的小鼠的主動脈組織勻漿的westerns的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析。組織勻漿的免疫印跡來自每個組中動物的兩條主動脈。在來自ckd-3小鼠的主動脈組織勻漿中actriia和激活素(抑制素β-a)水平降低。alk4(acvr1b)和alk1(acvrl1)1型受體存在于主動脈組織勻漿中。ckd-3降低了主動脈中的smad2/2磷酸化，其被mactriia-fc治療提高。ckd-3降低了磷酸-erk1/2水平。runx2水平通過ckd-3提高，而通過mactriia-fc歸一化。附圖27b描繪了p-smad2/3免疫印跡定量，n＝4，**p<0.01。

附圖28a描繪了野生型小鼠的主動脈中beta-連環(huán)蛋白(catenin)表達(dá)的免疫熒光顯微術(shù)。附圖28b描繪了ckd小鼠的主動脈中beta-連環(huán)蛋白表達(dá)的免疫熒光顯微術(shù)。血管平滑肌細(xì)胞中沒有beta-連環(huán)蛋白的免疫熒光。來自ckd小鼠的主動脈的內(nèi)皮中有beta-連環(huán)蛋白表達(dá)。箭頭，內(nèi)皮細(xì)胞中beta-連環(huán)蛋白和cd31的共同定位。比例尺20μm。附圖28c描繪了主動脈的axin2mrna表達(dá)水平。附圖28d描繪了來自sham、ckd-3v和ckd-3r治療的小鼠的主動脈組織勻漿的westerns中，通過dkk1蛋白表達(dá)來標(biāo)記的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分析，以及免疫印跡定量，n＝4。附圖28e描繪了ckd-3v和mactriia-fc對血漿dkk1水平的影響。*p<0.05，**p<0.01。

附圖29a描繪了mactriia-fc治療對腎臟klothomrna水平的影響，表明ckd-3降低腎臟組織勻漿中的klotho基因表達(dá)水平，相比ckd-3v，mactriia-fc治療顯著地提高它們。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。附圖29b描繪了來自假治療的、ckd-3溶媒和ckd-3mactriia-fc治療的小鼠的腎臟組織勻漿的westerns的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析。所有的免疫印跡是來自3或4個腎臟的組織勻漿的表示。actriia不受ckd-3或mactriia-fc的影響。激活素a(抑制素β-a)水平在ckd-3小鼠的腎臟組織勻漿中提高(定量在附圖30a-b中顯示)，被mactriia-fc降低。alk4(acvr1b)和alk2(acvr1)1型受體存在于腎臟組織勻漿中，但是ckd-3v或ckd-3r不顯著影響alk4的磷酸化。ckd-3提高了腎臟的smad2/3磷酸化，mactriia-fc治療降低了腎臟的磷酸smad2/3。附圖29c描繪了附圖29b的免疫印跡定量)，*p<0.01。

附圖30a描繪了來自ckd-3vmactriia-fc治療的小鼠的腎臟切片的三色染色。附圖30b描繪了來自ckd-3vmactriia-fc治療的小鼠的腎臟切片的三色染色。附圖30c描繪了來自ckd-3vmactriia-fc治療的小鼠的腎臟切片的三色染色。附圖30d描繪了來自ckd-3mactriia-fc治療的小鼠的腎臟切片的三色染色。間質(zhì)性纖維化的區(qū)域通過箭頭標(biāo)出。ckd-3mactriia-fc治療的小鼠的腎臟具有降低的間質(zhì)性纖維化。比例尺50μm。整個腎臟冠狀面的標(biāo)記參見附圖35，從其中采集了顯微照片的切片。附圖30e描繪了mactriia-fc對尿蛋白的影響。在ckd-3v小鼠中有顯著的蛋白尿，這通過mactriia-fc治療降低了，*p<0.05。

附圖31a描繪了在動脈粥樣硬化的ldlr-/-高脂肪飼喂的ckd-3小鼠中通過ckd對循環(huán)激活素-a的誘導(dǎo)。附圖31b描繪了在如本文描述的alport’s綜合征小鼠中ckd對循環(huán)激活素-a的誘導(dǎo)。附圖31c描繪了小鼠腎臟中抑制素betaa(inhba)mrna表達(dá)(激活素-a是抑制素betaa的同二聚體形成的)。附圖31d描繪了用于腎臟組織勻漿中的抑制素β-a的westerns。附圖31e描繪了附圖31d的免疫印跡定量，免疫印跡定量的n＝6；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005。

附圖32a顯示了sham中的腎臟inhba免疫染色。附圖32b顯示了ckd-3溶媒小鼠中的腎臟inhba免疫染色。在sham小鼠中，偶爾的管周間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)激活素-a，但是在ckd-3小鼠中，更多的管周間質(zhì)細(xì)胞在不同強度下對于激活素-a是陽性的。比例尺50μm。

附圖33a和附圖33b描繪了小鼠中類似于人3期腎病的慢性腎病。在小鼠模型中按照與人類ckd的分期類似的方式將ckd分期。如方法(章節(jié)9.10.1)中描述的帶有消融性ckd的血管鈣化模型用于產(chǎn)生與稱為ckd-3的人類ckd3期類似的降低的腎臟功能(溶媒治療的為ckd-3v)，通過菊糖清除和bun來估計，與wtc57b6小鼠(wt)相比具有g(shù)fr的70％降低。10mg/kg每周兩次皮下地用mactriia-fc治療ckd-3小鼠(ckd-3r)對于菊糖清除或bun沒有影響。

附圖34描繪了來自tsuchida等(cellcomm.andsignaling,2009)的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的示意圖。激活素、肌肉生長抑制素和gdf11結(jié)合ii型受體，actriia(主要對于激活素)和actriib(主要對于肌肉生長抑制素和gdf11)活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括通過smad2,3的典型途徑。

附圖35a和附圖35b顯示了ckd-3溶媒治療的小鼠的腎臟(腎臟三色染色)。附圖35c和附圖35d顯示了ckd-3mactriia-fc治療的小鼠的腎臟(腎臟三色染色)。比例尺1mm。來自電灼損傷的皮層表面瘢痕由箭頭標(biāo)出。箭頭指向了附圖36中拍攝高功率顯微照片的點。比例尺1mm。

附圖36a描繪了與wt和sham小鼠相比，在ckd-3小鼠中循環(huán)卵泡抑素水平?jīng)]有改變。附圖36b描繪了與wt和sham小鼠相比，在ckd-3小鼠中循環(huán)卵泡抑素樣3(fstl3)水平?jīng)]有改變。

附圖37描繪了ckd-3小鼠的組織中激活素受體相互作用蛋白arip1和arip2)的水平。arip1在ckd-3小鼠的殘余腎臟中強烈表達(dá)，是arip2表達(dá)的兩倍。arip1在ckd-3小鼠的主動脈中以低水平表達(dá)，而主動脈中的arip2表達(dá)是arip1的兩倍。

8.詳細(xì)說明

8.1概述

在一個方面，本文提供的是治療和/或預(yù)防心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、和/或與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病、動脈硬化水平升高(例如，通過降低的血管順應(yīng)性所指示的)、和/或左心室肥大(lvh)，包括與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病和/或lvh的方法，其中所述方法包括向需要治療和/或預(yù)防的對象施用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)。在某些實施方式中，所述對象是腎臟的對象。所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可以是actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑。

特別地，本文提供的是治療和/或預(yù)防心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病、動脈硬化水平升高和/或左心室肥大(lvh)的方法，使用snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性作為患者群體的指示、作為對象對用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療和/或預(yù)防的響應(yīng)性的指示、作為用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的效力的指示或作為用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的適當(dāng)劑量的指示。snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha也可以用于鑒定用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療和/或預(yù)防的疾病和/或狀況。本文描述的方法中使用的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可以是actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑，例如，本文描述的或本領(lǐng)域已知的任何抑制劑。在優(yōu)選的實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是人源化的融合蛋白，其由actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和人類igg1fc結(jié)構(gòu)域組成(“actriia-fc,”例如，seqidno：7)。

本文提供的方法部分地基于以下發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，在慢性腎病誘導(dǎo)的血管鈣化的小鼠模型中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和osterix的水平提高，klotho、alpha-sma、myocd、actriia和sm22-alpha的水平降低。進(jìn)一步的，不受理論的限制，mactriia-fc的配體捕獲降低了慢性腎病小鼠模型(ldlr-/-小鼠，高脂肪飲食)中的血管鈣化。如本文呈現(xiàn)的實施例中所顯示的(參見章節(jié)9)，用mactriia-fc治療慢性腎病小鼠降低了血管鈣化、降低了主動脈的鈣水平、降低了phosphosmad3水平、降低了尿蛋白水平、降低了phosphosmad2水平、降低了dkk1水平、降低了runx2水平、降低了alp水平、降低了bsap水平、降低了ctx水平以及降低了osterix水平，并提高了klotho水平、提高了alpha-sma水平、提高了axin2水平和提高了sm22-alpha水平。此外，本文提供的方法部分地基于以下發(fā)現(xiàn)，在用mactriia-fc治療時在慢性腎病小鼠中血管鈣化的降低與dkk1、phosphosmad2、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix水平的降低相關(guān)，以及與klotho、alpha-sma、axin2和/或sm22-alpha水平的提高相關(guān)(參見實施例，章節(jié)9)。合起來，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平可以鑒定哪些對象可能響應(yīng)actriia-fc，和/或可以用于監(jiān)測對actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的臨床響應(yīng)，和/或選擇目標(biāo)患者群體。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)還表明，actriia-fc(例如，mactriia-fc或actriia-hfc，例如seqidno：7)在治療與慢性腎病相關(guān)的血管鈣化中是有用的。另外，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)還表明，actriia-fc(例如，mactriia-fc或actriia-hfc例如seqidno：7)在治療與snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的水平升高相關(guān)的疾病，或與klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平降低相關(guān)的疾病方面是有用的。最后，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)還表明，actriia-fc(例如，mactriia-fc或hactriia-hfc，例如seqidno：7)在降低主動脈粥樣化中的鈣沉積、降低主動脈鈣水平、逆轉(zhuǎn)ckd誘導(dǎo)的心臟重量增加、以及降低腎臟纖維化方面是有用的，因而，在治療心血管疾病方面是有用的。

實施例(參見章節(jié)9)中說明的、本文描述的發(fā)現(xiàn)表明，檢測snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2或sm22-alpha的水平和/或活性可以用作(i)對象的血管鈣化程度的標(biāo)志物(例如，血清標(biāo)志物)，(ii)測量對象對actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如actriia-fc)的響應(yīng)的標(biāo)志物，或(iii)評估治療之后對象種actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如actriia-fc)的藥效，其中所述對象是患有心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、和/或與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病的對象。因而，在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、axin2和/或sm22-alpha可以用于本文描述的方法，作為actriia-fc(例如，actriia-hfc，如seqidno：7)治療的效力的指示物，和/或作為對actriia-fc(例如，actriia–hfc，如seqidno：7)治療沒有響應(yīng)的指示物。此外，如本文描述的，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha可以用作可靠的分子標(biāo)志物來評估actriia-fc(例如，actriia-hfc，如seqidno：7)的時間-過程治療效力。進(jìn)一步，在具體的實施方式中，本文提供的是一種方法，其包括檢測血液中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性(例如，檢測與受損的血管平滑肌細(xì)胞功能相關(guān)的疾病中的異常表達(dá))，以及以對snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的活性和/或水平劑量依賴性的方式施用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，例如，actriia-fc。

在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是sotatercept(seqidno：7；參見，例如，章節(jié)9)。sotatercept是一種激活素配體陷阱，其在本文描述的方法中是有用的(參見章節(jié)8)。

8.2縮寫

如本文使用的，“snai1”或“snai1”是指snail同源物1。參見，例如twiggandwilkie,1999,humgenet.105(4):320-326，genbank^tm登記號nm_005985.3提供了示范性的人類snai1核酸序列。genbank^tm登記號np_005976.2提供了示范性的人類snai1氨基酸序列。

如本文使用的，“phosphosmad3”是指針對decapentaplegic同源物3的磷酸化的母本(phosphorylatedmothersagainstdecapentaplegichomolog3)。參見，例如matsuzaki,2013,cytokinegrowthfactorrev,24(4):385-399。genbank^tm登記號nm_005902.3提供了示范性的人類phosphosmad3核酸序列。genbank^tm登記號np_005893.1提供了示范性的人類phosphosmad3氨基酸序列。

如本文使用的，“phosphosmad2”是指針對decapentaplegic同源物2的磷酸化的母本。參見，例如matsuzaki,2013,cytokinegrowthfactorrev,24(4):385-399。genbank^tm登記號nm_001003652.3提供了示范性的人類phosphosmad2核酸序列。genbank^tm登記號np_001003652.1提供了示范性的人類phosphosmad2氨基酸序列。

如本文使用的，“dkk1”是指dickkopf相關(guān)蛋白1。參見，例如fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763。genbank^tm登記號nm_012242.2提供了示范性的人類dkk1核酸序列。genbank^tm登記號np_036374.1提供了示范性的人類dkk1氨基酸序列。

如本文使用的，“col1a1”是指1型膠原蛋白alpha1。參見，例如korkkoetal.,1998,am.j.hum.genet.,62:98-110。genbank^tm登記號xm_005257059.2提供了示范性的人類col1a1核酸序列。genbank^tm登記號xp_005257116.2提供了示范性的人類col1a1氨基酸序列。

如本文使用的，“runx2”是指runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2。參見，例如komori,2010,advexpmedbiol,658:43-49。genbank^tm登記號nm_001145920.2提供了示范性的人類runx2核酸序列。genbank^tm登記號np_001139392.1提供了示范性的人類runx2氨基酸序列。

如本文使用的，“alp”或“alpl”是指堿性磷酸酶。如本文使用的，“bsap”是指骨骼特異性堿性磷酸酶。參見，例如martinsetal.,2013,bone,56(2):390-397。genbank^tm登記號nm_000478.4提供了示范性的人類alp核酸序列。genbank^tm登記號np_000469.3提供了示范性的人類alp氨基酸序列。

如本文使用的，“ctx”是指i型膠原蛋白的c-末端端肽。參見，例如rosenetal,2000,calciftissueint.66(2):100-103。

如本文使用的，“osterix”是指osterix，也稱為sp7轉(zhuǎn)錄因子。參見，例如caoetal.,2005,cancerres.65(4):1124-1128。genbank^tm登記號nm_001173467.2提供了示范性的人類osterix核酸序列。genbank^tm登記號np_001166938.1提供了示范性的人類osterix氨基酸序列。

如本文使用的，“klotho”是指klotho。參見，例如matsumuraetal.1998,biochembiophysrescommun,242:626-630。genbank^tm登記號nm_004795.3提供了示范性的人類klotho核酸序列。genbank^tm登記號np_004786.2提供了示范性的人類klotho氨基酸序列。

如本文使用的，“alpha-sma”或“αsma”或“α-sma”是指alpha平滑肌肌動蛋白。參見，例如nowaketal.,1999,nat.genet.23:208-212。genbank^tm登記號nm_001100.3提供了示范性的人類alpha-sma核酸序列。genbank^tm登記號np_001091.1提供示范性的人類alpha-sma氨基酸序列。

如本文使用的，“myocd”是指心肌素。參見，例如imamuraetal.,2010,gene,464:1-10。genbank^tm登記號nm_001146312.2提供了示范性的人類myocd核酸序列。genbank^tm登記號np_001139784.1提供了示范性的人類myocd氨基酸序列。

如本文使用的，“sm22-alpha”或“sm22α”或“sm22-α”是指平滑肌蛋白22alpha，也稱為“transgelin”、“tagln”或“tagln1”。參見，例如camoretti-mercado,1998,genomics,49:452-457。genbank^tm登記號nm_001001522.1提供了示范性的人類sm22-alpha核酸序列。genbank^tm登記號np_001001522.1提供了示范性的人類sm22-alpha氨基酸序列。

如本文使用的，“actrii”是指激活素ii型受體。如本文使用的，“actriia”是指激活素iia型受體。參見，例如mathewsandvale,1991,cell65:973-982。genbank^tm登記號nm_001278579.1提供了示范性的人類actriia核酸序列。genbank^tm登記號np_001265508.1提供了示范性的人類actriia氨基酸序列。如本文使用的，“actriib”是指激活素iib型受體。參見，例如attisanoetal.,1992,cell68:97-108。genbank^tm登記號nm_001106.3提供了示范性的人類actriib核酸序列。genbank^tm登記號np_001097.2提供了示范性的人類actriib氨基酸序列。

如本文使用的，“axin2”是指軸抑制劑2(axisinhibitor2)。genbank^tm登記號nm_004655.3提供了示范性的人類axin2核酸序列。genbank^tm登記號np_004646.3提供了示范性的人類氨基酸序列。

如本文使用的，“mactriia-fc”或“actriia-mfc”是指小鼠激活素iia型受體-igg1融合蛋白。參見，例如，美國專利no.8,173,601。如本文使用的，“mactriib-fc”或“actriib-mfc”是指小鼠激活素iib型受體-igg1融合蛋白。參見，例如，美國專利no.8,173,601。如本文使用的，““hactriia-fc”或“actriia-hfc”是指人類激活素iia型受體-igg1融合蛋白。參見，例如，美國專利no.8,173,601。如本文使用的，“hactriib-fc”或“actriib-hfc”是指人類激活素iib型受體-igg1融合蛋白。參見，例如，美國專利no.8,173,601。

如本文使用的，“l(fā)vh”是指左心室肥大。

8.3治療和/或預(yù)防的方法

8.3.1心血管疾病和/或血管鈣化

在某些實施方式中，本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病、動脈硬化水平升高、左心室肥大、與左心室肥大相關(guān)和/或由左心室肥大引起的心血管疾病、和/或與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)。在某些實施方式中，所述對象是腎臟的對象。在某些其他實施方式中，所述對象被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些其他實施方式中，所述對象沒有被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。

在某些實施方式中，所述對象具有與參考群體中runx2的水平和/或活性相比升高的runx2水平和/或活性，與參考群體中alp的水平和/或活性相比升高的alp水平和/或活性，與參考群體中snai1的水平和/或活性相比升高的snai1水平和/或活性，與參考群體中phosphosmad2的水平和/或活性相比升高的phosphosmad2水平和/或活性，與參考群體中中phosphosmad3的水平和/或活性相比升高的phosphosmad3水平和/或活性，與參考群體中中尿蛋白的水平和/或活性相比升高的尿蛋白水平和/或活性，與參考群體中中dkk1的水平和/或活性相比升高的dkk1水平和/或活性，與參考群體中中激活素(例如，游離激活素)的水平和/或活性相比升高的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性，與參考群體中col1a1的水平和/或活性相比升高的col1a1水平和/或活性，與參考群體中bsap的水平和/或活性相比升高的bsap水平和/或活性，與參考群體中ctx的水平和/或活性相比升高的ctx水平和/或活性，與參考群體中osterix的水平和/或活性相比升高的osterix水平和/或活性，與參考群體中klotho的水平和/或活性相比降低的klotho水平和/或活性，與參考群體中alpha-sma的水平和/或活性相比降低的alpha-sma水平和/或活性，與參考群體中myocd的水平和/或活性相比降低的myocd水平和/或活性，與參考群體中sm22-alpha的水平和/或活性相比降低的sm22-alpha水平和/或活性；和/或與參考群體中actriia的水平和/或活性相比降低的actriia水平和/或活性。

在某些實施方式中，所述對象具有與所述對象中在先的runx2水平和/或活性相比升高的runx2水平和/或活性，與所述對象中在先的alp水平和/或活性相比升高的alp水平和/或活性，與所述對象中在先的snai1水平和/或活性相比升高的snai1水平和/或活性，與所述對象中在先的phosphosmad2水平和/或活性相比升高的phosphosmad2水平和/或活性，與所述對象中在先的phosphosmad3水平和/或活性相比升高的phosphosmad3水平和/或活性，與所述對象中在先的尿蛋白水平和/或活性相比升高的尿蛋白水平和/或活性，與所述對象中在先的dkk1水平和/或活性相比升高的dkk1水平和/或活性，與所述對象中在先的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性相比升高的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性，與所述對象中在先的col1a1水平和/或活性相比升高的col1a1水平和/或活性，與所述對象中在先的bsap水平和/或活性相比升高的bsap水平和/或活性，與所述對象中在先的ctx水平和/或活性相比升高的ctx水平和/或活性，與所述對象中在先的osterix水平和/或活性相比升高的osterix水平和/或活性，與所述對象中在先的klotho水平和/或活性相比降低的klotho水平和/或活性，與所述對象中在先的alpha-sma水平和/或活性相比降低的alpha-sma水平和/或活性，與所述對象中在先的myocd水平和/或活性相比降低的myocd水平和/或活性，與所述對象中在先的actriia水平和/或活性相比降低的actriia水平和/或活性，和/或與所述對象中在先的sm22-alpha水平和/或活性相比降低的sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，所述對象中在先的runx2水平和/或活性、所述對象中在先的alp水平和/或活性、所述對象中在先的snai1水平和/或活性、所述對象中在先的phosphosmad2水平和/或活性、所述對象中在先的phosphosmad3水平和/或活性、所述對象中在先的尿蛋白水平和/或活性、所述對象中在先的dkk1水平和/或活性、所述對象中在先的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性、所述對象中在先的col1a1水平和/或活性、所述對象中在先的bsap水平和/或活性、所述對象中在先的ctx水平和/或活性、所述對象中在先的osterix水平和/或活性、所述對象中在先的klotho水平和/或活性、所述對象中在先的alpha-sma水平和/或活性、所述對象中在先的myocd水平和/或活性、所述對象中在先的actriia水平和/或活性、所述對象中在先的sm22-alpha水平和/或活性是(i)心血管疾??；(ii)血管鈣化；(iii)與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病；(iv)與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾??；(v)動脈硬化水平升高；和/或左心室肥大(lvh)的癥狀發(fā)作或診斷之前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18、24或48個月的相應(yīng)水平。

在某些實施方式中，所述對象根據(jù)8.3.4中描述的方法治療。在某些實施方式中，所述對象的血管鈣化通過如章節(jié)8.6中描述的測定agatston評分來分析。

在某些實施方式中，用本文提供的方法治療的對象具有如章節(jié)8.6中描述的snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性。因而,在某些具體的實施方式中，本文提供的方法包括(i)根據(jù)如章節(jié)8.6中描述的snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia和/或sm22-alpha的水平和/或活性選擇對象；和(ii)施用藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)。在具體的實施方式中，所述對象患有心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有血管鈣化。在具體的實施方式中，所述對象患有與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有腎病。在某些其他實施方式中，所述對象被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些其他實施方式中，所述對象沒有被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些實施方式中，所述對象的血管鈣化通過如章節(jié)8.6中描述的測定agatston評分來分析。在具體的實施方式中，所述對象被診斷患有動脈硬化水平升高。在具體的實施方式中，所述對象被診斷患有l(wèi)vh。在具體的實施方式中，所述對象患有與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾病。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性如章節(jié)8.6中描述的測定。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別是snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的蛋白質(zhì)水平和/或活性。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別是snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的mrna水平和/或活性。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd和/或actriia、axin2、alpha-sma水平是在組織中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨骼。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2水平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和col1a1的水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。在某些實施方式中，相對于參考群體，激活素的水平在所述對象中升高。在某些實施方式中，所述對象中卵泡抑素的水平約等于參考群體中卵泡抑素的水平。

在某些實施方式中，所述參考群體是章節(jié)8.6中描述的群體。在某些實施方式中，所述對象是章節(jié)8.4中描述的對象。

在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是actriia-fc，例如actriia-hfc(例如，seqidno：7)。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是如章節(jié)8.5中描述的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。

在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是如章節(jié)8.7中描述的劑量。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是初始劑量。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量以如章節(jié)8.7中描述的頻率施用。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量如章節(jié)8.7中描述的施用。

在某些實施方式中，如章節(jié)8.8中描述的，本文提供的方法與第二藥學(xué)活性試劑組合使用。

在某些實施方式中，在心血管疾病或慢性腎病的上下文中“治療(treat)”、“治療(treatment)”或“治療(treating)”分別包括改善心血管疾病或慢性腎病的至少一種癥狀。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2、sm22-alpha、phosphosmad3和尿蛋白的水平和/或活性可以分別與相應(yīng)參考群體中的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的兩種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的三種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的三種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的四種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的五種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的六種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的七種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的八種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的九種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十一種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十二種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十三種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十四種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十五種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十六種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的十七種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。因而，在某些實施方式中，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白的每一種的水平和/或活性與相應(yīng)參考群體中它們的水平和/或活性比較。

8.3.2與snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha相關(guān)的疾病

在某些實施方式中，本文提供的是治療和/或預(yù)防與snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha相關(guān)的一種或更多種疾病的方法，包括向?qū)ο笫┯盟帉W(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)。

在某些實施方式中，所述對象是章節(jié)8.4中描述的對象。

在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是actriia-fc，例如actriia-hfc(例如，seqidno：7)。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是如章節(jié)8.5中描述的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。

在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是如章節(jié)8.7中描述的劑量。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是初始劑量。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量以如章節(jié)8.7中描述的頻率施用。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量如章節(jié)8.7中描述的施用。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量取決于本文描述的某些生物標(biāo)記物的水平和/或活性來調(diào)整。

在某些實施方式中，如章節(jié)8.8中描述的，本文提供的方法與第二藥學(xué)活性試劑組合使用。

8.3.3慢性腎病-礦物質(zhì)/骨骼失調(diào)

在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)。在某些實施方式中，提供的是降低對象中的骨吸收的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，所述對象患有心血管疾病。在某些實施方式中，所述對象患有血管鈣化。在某些實施方式中，所述對象患有與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病。在某些實施方式中，所述對象患有與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病。在某些實施方式中，所述對象是腎臟的對象。在某些其他實施方式中，所述對象被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些其他實施方式中，所述對象沒有被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。

在某些實施方式中，所述對象具有與參考群體中runx2的水平和/或活性相比升高的runx2水平和/或活性，與參考群體中alp的水平和/或活性相比升高的alp水平和/或活性，與參考群體中snai1的水平和/或活性相比升高的snai1水平和/或活性，與參考群體中phosphosmad2的水平和/或活性相比升高的phosphosmad2水平和/或活性，與參考群體中phosphosmad3的水平和/或活性相比升高的phosphosmad3水平和/或活性，與參考群體中尿蛋白的水平和/或活性相比升高的尿蛋白水平和/或活性，與參考群體中dkk1的水平和/或活性相比升高的dkk1水平和/或活性，與參考群體中col1a1的水平和/或活性相比升高的col1a1水平和/或活性，與參考群體中激活素(例如，游離激活素)的水平和/或活性相比升高的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性，與參考群體中bsap的水平和/或活性相比升高的bsap水平和/或活性，與參考群體中ctx的水平和/或活性相比升高的ctx水平和/或活性，與參考群體中osterix的水平和/或活性相比升高的osterix水平和/或活性，與參考群體中klotho的水平和/或活性相比降低的klotho水平和/或活性，與參考群體中alpha-sma的水平和/或活性相比降低的alpha-sma水平和/或活性，與參考群體中myocd的水平和/或活性相比降低的myocd水平和/或活性，與參考群體中actriia的水平和/或活性相比降低的actriia水平和/或活性，和/或與參考群體中sm22-alpha的水平和/或活性相比降低的sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是組織中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨骼。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、myocd和/或actriia水平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白和col1a1和/或actriia水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、actriia和/或alpha-sma水平是在主動脈中的。

在某些實施方式中，所述對象具有與對象中在先的runx2水平和/或活性相比升高的runx2水平和/或活性，與對象中在先的alp水平和/或活性相比升高的alp水平和/或活性，與對象中在先的snai1水平和/或活性相比升高的snai1水平和/或活性，與對象中在先的phosphosmad2水平和/或活性相比升高的phosphosmad2水平和/或活性，與對象中在先的phosphosmad3水平和/或活性相比升高的phosphosmad3水平和/或活性，與對象中在先的尿蛋白水平和/或活性相比升高的尿蛋白水平和/或活性，與對象中在先的dkk1水平和/或活性相比升高的dkk1水平和/或活性，與對象中在先的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性相比升高的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性，與所述對象中在先的col1a1水平和/或活性相比升高的col1a1水平和/或活性，與所述對象中在先的bsap水平和/或活性相比升高的bsap水平和/或活性，與所述對象中在先的ctx水平和/或活性相比升高的ctx水平和/或活性，與所述對象中在先的osterix水平和/或活性相比升高的osterix水平和/或活性，與所述對象中在先的klotho水平和/或活性相比降低的klotho水平和/或活性，與所述對象中在先的alpha-sma水平和/或活性相比降低的alpha-sma水平和/或活性，與所述對象中在先的myocd水平和/或活性相比降低的myocd水平和/或活性，與所述對象中在先的actriia水平和/或活性相比降低的actriia水平和/或活性，和/或與所述對象中在先的sm22-alpha水平和/或活性相比降低的sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，所述對象中在先的runx2水平和/或活性、所述對象中在先的alp水平和/或活性、所述對象中在先的snai1水平和/或活性、所述對象中在先的phosphosmad2水平和/或活性、所述對象中在先的phosphosmad3水平和/或活性、所述對象中在先的尿蛋白水平和/或活性、所述對象中在先的dkk1水平和/或活性、所述對象中在先的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性、所述對象中在先的col1a1水平和/或活性、所述對象中在先的bsap水平和/或活性、所述對象中在先的ctx水平和/或活性、所述對象中在先的osterix水平和/或活性、所述對象中在先的klotho水平和/或活性、所述對象中在先的alpha-sma水平和/或活性、所述對象中在先的myocd水平和/或活性、所述對象中在先的actriia水平和/或活性、所述對象中在先的sm22-alpha水平和/或活性是ckd-mbd的癥狀發(fā)作或診斷之前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18、24或48個月的相應(yīng)水平。

在某些實施方式中，所述對象根據(jù)章節(jié)8.3.4中描述的方法治療。在某些實施方式中，所述對象的血管鈣化通過如章節(jié)8.6中描述的測定agatston評分來分析。

在某些實施方式中，用本文提供的方法治療的對象具有如章節(jié)8.6中描述的snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性。因而,在某些具體的實施方式中，本文提供的方法包括(i)根據(jù)如章節(jié)8.6中描述的snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia和/或sm22-alpha的水平和/或活性選擇對象；和(ii)施用藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)。在具體的實施方式中，所述對象患有心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有血管鈣化。在具體的實施方式中，所述對象患有與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有腎病。在某些其他實施方式中，所述對象被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些其他實施方式中，所述對象沒有被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在具體的實施方式中，所述對象患有動脈硬化水平升高。在具體的實施方式中，所述對象患有與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病。在具體的實施方式中，所述對象患有l(wèi)vh。在具體的實施方式中，所述對象患有與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾病。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性如章節(jié)8.6中描述的測定。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的升高的水平是如章節(jié)8.6中描述的。在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的降低的水平是如章節(jié)8.6中描述的。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是組織中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨骼。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、actriia、axin2和myocd水平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、actriia和col1a1水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別是snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia和/或sm22-alpha的蛋白質(zhì)水平和/或活性。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別是snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia和/或sm22-alpha的mrna水平和/或活性。在某些實施方式中，相對于參考群體，激活素的水平在所述對象中升高。在某些實施方式中，所述對象中卵泡抑素的水平約等于參考群體中卵泡抑素的水平。

在某些實施方式中，所述參考群體是章節(jié)8.6中描述的群體。在某些實施方式中，所述對象是章節(jié)8.4中描述的對象。

在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是actriia-fc，例如actriia-hfc(例如，seqidno：7)。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是如章節(jié)8.5中描述的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。

在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是如章節(jié)8.7中描述的劑量。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是初始劑量。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量以如章節(jié)8.7中描述的頻率施用。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量如章節(jié)8.7中描述的施用。

在某些實施方式中，如章節(jié)8.8中描述的，本文提供的方法與第二藥學(xué)活性試劑組合使用。

在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括向所述對象施用藥學(xué)上有效劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括以每14天一次的間隔時間向所述對象皮下地施用0.13mg/kg的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括以每14天一次的間隔時間向所述對象皮下地施用0.26mg/kg的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括以每28天一次的間隔時間向所述對象皮下地施用0.3mg/kg的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括以每28天一次的間隔時間向所述對象皮下地施用0.5mg/kg的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括以每28天一次的間隔時間向所述對象皮下地施用0.7mg/kg的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括以每14天一次的間隔時間向所述對象靜脈內(nèi)地施用0.1mg/kg的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，本文提供的是治療對象的末期腎病的方法，包括以每14天一次的間隔時間向所述對象皮下地施用0.2mg/kg的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)，其中所述對象在血液透析，以及其中所述對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是actriia-hfc(seqidno：7)。

8.3.4調(diào)整的給藥

snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性可以進(jìn)一步用于(i)評估對象的適當(dāng)?shù)慕o藥，其中所述對象是用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)治療的或?qū)⒁委煹暮蜻x者；(ii)評估在治療期間是否調(diào)整actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量；和/或(iii)評估actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的適當(dāng)?shù)木S持劑量。如果snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平和/或活性大于或小于參考群體中的水平和/或活性，分別取決于snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性，用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的給藥可以啟動、提高、降低、延遲或終止。在某些實施方式中，本文提供的是治療和/或預(yù)防對象的心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病、ckd-mbd、動脈硬化水平升高、lvh、與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病和/或與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾病的方法，包括(i)向所述對象施用初始劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；(ii)進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性的第一次測量；(iii)一段時間以后，進(jìn)行所述對象中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性的第二次測量；和(v)向所述對象施用調(diào)整劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是actriia-fc，例如actriia-hfc(例如，seqidno：7)。在某些實施方式中，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是如章節(jié)8.5中描述的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些其他實施方式中，所述對象被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些其他實施方式中，所述對象沒有被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些實施方式中，所述對象的血管鈣化通過如章節(jié)8.6.6中描述的測定agatston評分來分析。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是基于所述第一次測量和所述第二次測量之間檢測到的變化。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性如章節(jié)8.6中描述的測定。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別是snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白和/或sm22-alpha的蛋白質(zhì)水平和/或活性。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別是snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或sm22-alpha的mrna水平和/或活性。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是組織中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨骼。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、myocd、actriia或axin2和平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和col1a1的水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。在某些實施方式中，相對于參考群體，激活素的水平在所述對象中升高。在某些實施方式中，相對于參考群體，卵泡抑素的水平在所述對象中是正常的。在某些實施方式中，所述對象的血管鈣化通過如章節(jié)8.6中描述的測定agatston評分來分析。

在某些實施方式中，所述參考群體是章節(jié)8.6中描述的群體。在某些實施方式中，所述對象是章節(jié)8.4中描述的對象。

在某些實施方式中，所述初始劑量是如章節(jié)8.7中描述的劑量。在某些實施方式中，所述初始劑量以如章節(jié)8.7中描述的頻率施用。在某些實施方式中，所述初始劑量如章節(jié)8.7中描述的施用。

在某些實施方式中，所述第一次測量和/或所述第二次測量如章節(jié)8.6中描述的進(jìn)行。在某些實施方式中，所述第一次測量在治療的開始之前進(jìn)行。在某些實施方式中，所述第一次測量在治療的開始之后，或在其最多1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周、2周、3周、4周或兩個月之內(nèi)進(jìn)行。在某些實施方式中，所述第二次測量在治療開始后立即進(jìn)行，或在其最多1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周、2周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月之內(nèi)進(jìn)行。

在某些實施方式中，如果與參考群體中runx2的水平和/或活性相比runx2的水平和/或活性升高，與參考群體中alp的水平和/或活性相比alp的水平和/或活性升高，與參考群體中snai1的水平和/或活性相比snai1的水平和/或活性升高，與參考群體中phosphosmad2的水平和/或活性相比phosphosmad2的水平和/或活性升高，與參考群體中phosphosmad3的水平和/或活性相比phosphosmad3的水平和/或活性升高，與參考群體中尿蛋白的水平和/或活性相比尿蛋白的水平和/或活性升高，與參考群體中dkk1的水平和/或活性相比dkk1的水平和/或活性升高，與參考群體中col1a1的水平和/或活性相比col1a1的水平和/或活性升高，與參考群體中激活素(例如，游離激活素)的水平和/或活性相比激活素(例如，游離激活素)的水平和/或活性升高，與參考群體中bsap的水平和/或活性相比bsap的水平和/或活性升高，與參考群體中ctx的水平和/或活性相比ctx的水平和/或活性升高，與參考群體中osterix的水平和/或活性相比osterix的水平和/或活性升高，與參考群體中klotho的水平和/或活性相比klotho的水平和/或活性降低，與參考群體中alpha-sma的水平和/或活性相比alpha-sma的水平和/或活性降低，與參考群體中myocd的水平和/或活性相比myocd的水平和/或活性降低，與參考群體中actriia的水平和/或活性相比actriia的水平和/或活性降低，與參考群體中axin2的水平和/或活性相比axin2的水平和/或活性降低，和/或與參考群體中sm22-alpha的水平和/或活性相比sm22-alpha的水平和/或活性降低，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的調(diào)整的劑量大于所述初始劑量。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的升高的水平是如章節(jié)8.6中描述的。在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、alp、actriia、axin2和/或sm22-alpha的降低的水平是如章節(jié)8.6中描述的。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是組織中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨骼。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、actriia、axin2和myocd水平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和col1a1的水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。

在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是如章節(jié)8.7中描述的劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量以如章節(jié)8.7中描述的頻率施用。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量如章節(jié)8.7中描述的施用。

在某些實施方式中，所述對象具有與對象中在先的runx2水平和/或活性相比升高的runx2水平和/或活性，與對象中在先的alp水平和/或活性相比升高的alp水平和/或活性，與對象中在先的snai1水平和/或活性相比升高的snai1水平和/或活性，與對象中在先的phosphosmad2水平和/或活性相比升高的phosphosmad2水平和/或活性，與對象中在先的phosphosmad3水平和/或活性相比升高的phosphosmad3水平和/或活性，與對象中在先的尿蛋白水平和/或活性相比升高的尿蛋白水平和/或活性，與對象中在先的dkk1水平和/或活性相比升高的dkk1水平和/或活性，與對象中在先的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性相比升高的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性，與所述對象中在先的col1a1水平和/或活性相比升高的col1a1水平和/或活性，與所述對象中在先的bsap水平和/或活性相比升高的bsap水平和/或活性，與所述對象中在先的ctx水平和/或活性相比升高的ctx水平和/或活性，與所述對象中在先的osterix水平和/或活性相比升高的osterix水平和/或活性，與所述對象中在先的klotho水平和/或活性相比降低的klotho水平和/或活性，與所述對象中在先的alpha-sma水平和/或活性相比降低的alpha-sma水平和/或活性，與所述對象中在先的myocd水平和/或活性相比降低的myocd水平和/或活性，與所述對象中在先的actriia水平和/或活性相比降低的actriia水平和/或活性，與所述對象中在先的axin2水平和/或活性相比降低的axin2水平和/或活性，和/或與所述對象中在先的sm22-alpha水平和/或活性相比降低的sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，所述對象中在先的runx2水平和/或活性、所述對象中在先的alp水平和/或活性、所述對象中在先的snai1水平和/或活性、所述對象中在先的phosphosmad2水平和/或活性、所述對象中在先的phosphosmad3水平和/或活性、所述對象中在先的尿蛋白水平和/或活性、所述對象中在先的dkk1水平和/或活性、所述對象中在先的激活素(例如，游離激活素)水平和/或活性、所述對象中在先的col1a1水平和/或活性、所述對象中在先的bsap水平和/或活性、所述對象中在先的ctx水平和/或活性、所述對象中在先的osterix水平和/或活性、所述對象中在先的klotho水平和/或活性、所述對象中在先的alpha-sma水平和/或活性、所述對象中在先的myocd水平和/或活性、所述對象中在先的actriia水平和/或活性、所述對象中在先的actriia水平和/或活性、所述對象中在先的axin2水平和/或活性、所述對象中在先的axin2水平和/或活性、和/或所述對象中在先的sm22-alpha水平和/或活性是(i)心血管疾病；(ii)血管鈣化；(iii)與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾??；(iv)與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾?。?v)ckd-mbd；(vi)動脈硬化水平升高；(vii)lvh；(viii)與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病；和/或(ix)與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾病的癥狀發(fā)作或診斷之前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18、24或48個月的相應(yīng)水平。

在某些實施方式中，如果與參考群體中runx2的水平和/或活性相比runx2的水平和/或活性降低，與參考群體中alp的水平和/或活性相比alp的水平和/或活性降低，與參考群體中snai1的水平和/或活性相比snai1的水平和/或活性降低，與參考群體中phosphosmad2的水平和/或活性相比phosphosmad2的水平和/或活性降低，與參考群體中phosphosmad3的水平和/或活性相比phosphosmad3的水平和/或活性降低，與參考群體中尿蛋白的水平和/或活性相比尿蛋白的水平和/或活性降低，與參考群體中dkk1的水平和/或活性相比dkk1的水平和/或活性降低，與參考群體中col1a1的水平和/或活性相比col1a1的水平和/或活性降低，與參考群體中激活素(例如，游離激活素)的水平和/或活性相比激活素(例如，游離激活素)的水平和/或活性降低，與參考群體中bsap的水平和/或活性相比bsap的水平和/或活性降低，與參考群體中ctx的水平和/或活性相比ctx的水平和/或活性降低，與參考群體中osterix的水平和/或活性相比osterix的水平和/或活性降低，與參考群體中klotho的水平和/或活性相比klotho的水平和/或活性升高，與參考群體中alpha-sma的水平和/或活性相比alpha-sma的水平和/或活性升高，與參考群體中myocd的水平和/或活性相比myocd的水平和/或活性升高，與參考群體中actriia的水平和/或活性相比actriia的水平和/或活性升高，與參考群體中axin2的水平和/或活性相比axin2的水平和/或活性升高，和/或與參考群體中sm22-alpha的水平和/或活性相比sm22-alpha的水平和/或活性升高，所述actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，激活素配體陷阱)的調(diào)整的劑量小于所述初始劑量。在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的升高的水平是如章節(jié)8.6中描述的。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的降低的水平是如章節(jié)8.6中描述的。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是組織中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨骼。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、actriia、axin2和myocd水平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和col1a1的水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、sm22-alpha、myocd、actriia、axin2和/或alpha-sma水平是主動脈中的。

在某些實施方式中，所述參考群體是章節(jié)8.6中描述的群體。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是如章節(jié)8.7中描述的劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量以如章節(jié)8.7中描述的頻率施用。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量如章節(jié)8.7中描述的施用。

在某些實施方式中，如章節(jié)8.8中描述的，本文提供的方法與第二藥學(xué)活性試劑組合使用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2、sm22-alpha、phosphosmad3和尿蛋白的水平和/或活性可以分別與相應(yīng)參考群體中的水平和/或活性獨立比較，例如，如上文在章節(jié)8.3.1中描述的。

8.4患者群體

根據(jù)本文描述的方法治療的對象可以是任何哺乳動物，例如嚙齒動物和靈長類，在優(yōu)選的實施方式中，是人類。在某些實施方式中，本文描述的方法可以用于在任何哺乳動物例如嚙齒動物和靈長類中，在優(yōu)選的實施方式中，在人類對象中治療心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病、高周轉(zhuǎn)rod、動脈硬化水平升高、與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病、lvh和/或與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾??；或者監(jiān)視和/或降低血管鈣化、動脈的(例如，血管的)硬化、lvh、主動脈鈣水平、內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和/或骨形成，和/或提高骨骼礦物密度和/或血管平滑肌細(xì)胞功能。

在某些實施方式中，與參考群體中的激活素水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有升高的激活素水平。在某些實施方式中，所述激活素水平是腎臟、血漿或主動脈的激活素水平。在某些實施方式中，所述激活素是激活素a。在某些實施方式中，與參考群體中的卵泡抑素水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有大約相等的卵泡抑素水平。在某些實施方式中，與參考群體中的卵泡抑素水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象不具有升高的卵泡抑素水平。在某些實施方式中，與參考群體中的卵泡抑素水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象不具有降低的卵泡抑素水平。在某些實施方式中，與參考群體中的卵泡抑素樣3水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有大約相等的卵泡抑素樣3水平。在某些實施方式中，與參考群體中的卵泡抑素樣3水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象不具有升高的卵泡抑素樣3水平。在某些實施方式中，與參考群體中的卵泡抑素樣3水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象不具有降低的卵泡抑素樣3水平。在某些實施方式中，與參考群體中的抑制素水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有大約相等的抑制素水平。在某些實施方式中，與參考群體中的抑制素水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象不具有升高的抑制素水平。在某些實施方式中，與參考群體中的抑制素水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象不具有降低的抑制素水平。在某些實施方式中，對象中的游離激活素水平通過抑制素、卵泡抑素、卵泡抑素樣3水平對激活素水平的化學(xué)當(dāng)量來確定。因而，在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有提高的游離激活素水平。

在某些實施方式中，與章節(jié)8.6中描述的參考群體相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象不具有phosphoerk1/2的提高。在某些實施方式中，phosphoerk1/2是主動脈的phosphoerk1/2。

在某些實施方式中，與參考群體中的enmt相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有提高的內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(enmt)。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有與enmt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，例如snai1的提高的表達(dá)。在某些實施方式中，與參考群體中的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變相比，對象中提高的enmt引起對象中提高的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變。在某些實施方式中，與參考群體中的血管硬化相比，對象中提高的enmt引起對象中提高的血管硬化。在某些實施方式中，與參考群體中的血管鈣化相比，對象中提高的enmt引起對象中提高的血管鈣化。在某些實施方式中，與參考群體中的血管平滑肌功能相比，對象中提高的enmt引起對象中降低的血管平滑肌功能。在某些實施方式中，與參考群體中的lvh相比，對象中提高的enmt引起對象中提高的lvh。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有腎臟纖維化。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有腎小球硬化癥。

在某些實施方式中，分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有升高的snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、phosphosmad3、尿蛋白和/或osterix的水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)血管鈣化；和(ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)心血管疾?。缓?ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾??；和(ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾??；和(ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)ckd-mbd；和(ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)動脈硬化水平升高；和(ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾??；和(ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)lvh；和(ii)分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有(i)與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾?。缓?ii)與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的水平相比，升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。

在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象分別與在(i)心血管疾?。?ii)血管鈣化；(iii)與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病；(iv)與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病；(v)ckd-mbd；(vi)動脈硬化水平升高；(vii)lvh；(viii)與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病；和/或(ix)與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾病的癥狀發(fā)作或診斷之前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18、24或48個月之時，所述對象中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的在先水平相比，具有升高的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix水平和/或活性，和/或降低的klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha水平和/或活性。

在某些其他實施方式中，所述對象被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些其他實施方式中，所述對象沒有被診斷為患有慢性腎病-礦物質(zhì)骨骼失調(diào)。在某些實施方式中，所述參考群體是章節(jié)8.6中描述的群體。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的升高的水平是如章節(jié)8.6中描述的。在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、myocd、actriia和/或sm22-alpha的降低的水平是如章節(jié)8.6中描述的。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的snai1水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的phosphosmad2水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的phosphosmad3水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的尿蛋白水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的dkk1水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的col1a1水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的runx2水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的alp水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的bsap水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的ctx水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的osterix水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與升高的actriia水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與降低的klotho水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與降低的alpha-sma水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與降低的myocd水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與降低的sm22-alpha水平相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與降低的actriia水平相關(guān)的疾病。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有心血管疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有血管鈣化。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病。在某些實施方式中，所述血管鈣化是如章節(jié)8.6中描述的確定的。在某些實施方式中，所述血管鈣化是通過agatston評分確定的。在某些實施方案中，所述血管鈣化是鈣化性動脈粥樣硬化、鈣化的中層血管病變(也稱為中層鈣化性硬化癥)、中層鈣化、彈性蛋白沉積、鈣化尿毒癥性動脈病變，鈣化性主動脈瓣膜狹窄和/或門靜脈鈣化。在某些實施方式中，所述與鈣化的動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病是動脈粥樣硬化、高脂血癥、骨質(zhì)疏松癥、高血壓、炎癥、2型糖尿病、終末期腎病、所需截肢、彈性假黃瘤、高脂血癥、先天性二尖瓣、風(fēng)濕性心臟病和/或肝臟疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有ckd誘導(dǎo)的心臟重量提高。在某些實施方式中，所述對象患有心臟肥大。在某些實施方式中，所述對象患有肌細(xì)胞過度生長。在某些實施方式中，所述對象患有提高的動脈和/或血管硬化。在某些實施方式中，所述對象患有l(wèi)vh。

在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象與如章節(jié)8.6中描述的參考群體相比具有不希望的高水平的主動脈鈣、血管鈣化、動脈硬化水平升高和/或成骨細(xì)胞數(shù)量。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象與如章節(jié)8.6中描述的參考群體相比具有發(fā)生不希望的高水平的主動脈鈣、血管鈣化、動脈硬化水平升高和/或成骨細(xì)胞數(shù)量的風(fēng)險，例如，患有慢性腎病的對象。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象與如章節(jié)8.6中描述的參考群體相比具有主動脈粥樣斑中的鈣沉積。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象與如章節(jié)8.6中描述的參考群體相比具有主動脈硬化形式的動脈硬化水平升高。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象與如章節(jié)8.6中描述的參考群體相比具有提高高血壓的動脈硬化水平升高水平。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病。在某些實施方式中，所述腎病是慢性腎病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有慢性腎病。在某些實施方式中，所述對象患有繼發(fā)于慢性腎病的心血管疾病。在某些實施方式中，所述慢性腎病達(dá)到3期、4期、5期或5d期。在具體的實施方式中，所述腎病是終末期腎病。在某些實施方式中，所述對象具有成年人的小于60ml/分鐘/1.73m²或兒童對象的小于89ml/分鐘/1.73m²的腎小球過濾率。參見moeetal.,2006,kidneyinternational69:1945-1953。在某些實施方式中，所述對象是成年人，其中所述對象具有小于50ml/分鐘/1.73m²、40ml/分鐘/1.73m²、30ml/分鐘/1.73m²、20ml/分鐘/1.73m²或小于10ml/分鐘/1.73m²的腎小球過濾率。在某些實施方式中，所述對象是兒童對象，其中所述兒童對象具有小于80ml/分鐘/1.73m²、70ml/分鐘/1.73m²、60ml/分鐘/1.73m²、50ml/分鐘/1.73m²、40ml/分鐘/1.73m²、30ml/分鐘/1.73m²、20ml/分鐘/1.73m²或小于10ml/分鐘/1.73m²的腎小球過濾率。不受理論的限制，在成年人對象中小于60ml/分鐘/1.73m²以及在兒童對象中小于89ml/分鐘/1.73m²的腎小球過濾率引起鈣水平、磷水平、pth水平和維生素d新陳代謝方面可檢測的異常；這些標(biāo)志物的異常水平引起骨骼疾病。在某些實施方式中，所述對象具有參考群體降低的菊糖清除率，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體。在某些實施方式中，所述對象具有參考群體降低的血尿氮水平，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體。在某些實施方式中，所述對象是高磷酸鹽血的。在某些實施方式中，所述對象患有腎臟纖維化。

在某些實施方式中，所述對象患有alport’s綜合征。在某些實施方式中，所述對象在與alport’s綜合征相關(guān)的col4a5基因中有一個或更多個體細(xì)胞突變。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象具有與慢性腎病相關(guān)的骨骼病理，即，ckd-礦物質(zhì)/骨骼失調(diào)(ckd-mbd)。參見moeetal.,2006,kidneyinternational69:1945-1953。在某些實施方式中，與參考群體，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體相比，所述對象具有降低的小梁骨體積。在某些實施方式中，與參考群體，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體的小梁厚度相比，所述對象具有降低的小梁厚度。在某些實施方式中，與參考群體，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體的侵蝕面骨表面比相比，所述對象具有提高的侵蝕面骨骼表面比。在某些實施方式中，與參考群體，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體的破骨細(xì)胞水平相比，所述對象具有提高的破骨細(xì)胞水平。在某些實施方式中，與參考群體，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體的成骨細(xì)胞表面骨骼表面比相比，所述對象具有提高的成骨細(xì)胞表面骨骼表面比。在某些實施方式中，與參考群體，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體的成骨細(xì)胞水平相比，所述對象具有提高的成骨細(xì)胞水平。在某些實施方式中，與參考群體中，例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體的骨形成率相比，所述對象具有降低的骨形成率。在某些實施方式中，所述ckd-mbd由腎性骨營養(yǎng)不良和血管鈣化組成。在某些實施方式中，所述ckd-mbd由腎性骨營養(yǎng)不良組成。在某些實施方式中，所述ckd-mbd是低周轉(zhuǎn)ckd-mbd。在某些實施方式中，所述ckd-mbd由動脈硬化水平升高和/或lvh組成。低周轉(zhuǎn)ckd-mbd可以通過以下的表1中列出的組織學(xué)特征來診斷。參見nationalkidneyfoundation,kidneydiseaseoutcomesqualityinitiativeguidelinesatthewebsiteofthenationalkidneyfoundation。在某些實施方式中，所述對象具有高周轉(zhuǎn)rod。

表1.低周轉(zhuǎn)ckd-mbd的組織學(xué)特征

在某些實施方式中，所述對象正經(jīng)歷血液透析。

在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象患有終末期腎病。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象經(jīng)歷透析。

在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象具有與參考群體中的骨吸收相比提高的骨吸收。在某些實施方式中，所述提高的骨吸收通過ctx的水平確定。在某些實施方式中，所述ctx是害怕如章節(jié)8.6中描述的確定。在某些實施方式中，所述骨吸收如章節(jié)8.6中描述的評估。

在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象可以是任何年齡。在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象是小于18歲。在具體的實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象是小于13歲。在另一個具體的實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象是小于12歲、小于11歲、小于10歲、小于9歲、小于8歲、小于7歲、小于6歲或小于5歲。在另一個具體的實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象是1-3歲、3-5歲、5-7歲、7-9歲、9-11歲、11-13歲、13-15歲、15-20歲、20-25歲、25-30歲或大于30歲。在另一個具體的實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象是30-35歲、35-40歲、40-45歲、45-50歲、50-55歲、55-60歲或大于60歲。在另一個具體的實施方式中，根據(jù)本文描述的方法治療的對象是60-65歲、65-70歲、70-75歲、75-80歲或大于80歲。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提高的方法治療的對象患有終末期腎病。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象在血液透析。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象患有終末期腎病，在血液透析，并且早先施用了促紅細(xì)胞生成素刺激劑。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2、sm22-alpha、phosphosmad3和尿蛋白的水平和/或活性可以分別與相應(yīng)參考群體中的水平和/或活性獨立比較，例如，如上文在章節(jié)8.3.1中描述的。

8.5actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑

本節(jié)中描述的和本領(lǐng)域已知的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可以用于本文提供的方法。在某些實施方式中，本節(jié)描述的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可以用于本文提供的方法中(參見，章節(jié)8.3)。

本文涵蓋的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包括actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(見下文)。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是特異于actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的。在其他實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是特異于actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑優(yōu)先地抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在其他實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑優(yōu)先地抑制actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)兩者。

在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可以是包含actrii的激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。不受理論的限制，這種包含激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多頭隔離了激活素，從而阻止激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些包含激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以包含actrii的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的全部或一部分(即，actriia的全部或部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或actriib的全部或部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)。在具體的實施方式中，actrii的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是可溶的。

在某些實施方式中，包含激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽連接到抗體的fc部分(即，產(chǎn)生包含actrii受體的包含激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽與抗體的fc部分的軛合物)。不受理論的限制，抗體部分為所述軛合物賦予了提高的穩(wěn)定性。在某些實施方式中，激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過接頭，例如肽接頭連接到抗體的fc部分。

本文描述的組合物和方法中使用的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含直接地或間接地、細(xì)胞外地或細(xì)胞內(nèi)地抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑通過與其本身的受體相互作用來抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在其他實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑通過與actriia和/或actriib配體，例如激活素的相互作用抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

8.5.1actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑

如本文使用的，術(shù)語“actriia”是指來自任何物種的激活素iia型受體(actriia)蛋白的家族，以及通過誘變或其他修飾衍生自這些actriia蛋白的變體。本文提及actriia被理解為是提及當(dāng)前鑒定的形式的任一種。actriia家族的成員一般是跨膜的蛋白質(zhì)，由具有富半胱氨酸區(qū)的配體結(jié)合細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及具有預(yù)測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。

本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑非限制性地包括，結(jié)合激活素的可溶的actriia多肽；結(jié)合激活素(特別是激活素a或b亞基，還成為βa或βb)并破壞actriia結(jié)合的抗體；結(jié)合actriia并破壞激活素結(jié)合的抗體；對于激活素或actriia結(jié)合而選擇的非抗體蛋白質(zhì)(參見，例如wo/2002/088171,wo/2006/055689,wo/2002/032925,wo/2005/037989,us2003/0133939,和us2005/0238646，它們的每一個通過完全引用合并在本文中，作為這類蛋白質(zhì)和設(shè)計與選擇這類蛋白質(zhì)的實例)；為激活素或actriia結(jié)合而選擇的隨機肽，它們可以軛合到fc結(jié)構(gòu)域。

在某些實施方式中，具有激活素或actriia結(jié)合活性的兩種或更多種不同的蛋白質(zhì)(或其他部分)，特別是分別阻斷i型(例如，可溶的i型激活素受體)和ii型(例如，可溶的ii型激活素受體)結(jié)合位點的激活素結(jié)合物可以連接在一起，產(chǎn)生抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙功能或多功能結(jié)合分子，因而可以用于本文描述的組合物和方法。在某些實施方式中，抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活素-actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸拮抗劑包括核酸適體、小分子和其他試劑，用于本文描述的組合物和方法中。

8.5.1.1包含actriia多肽的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑

術(shù)語“actriia多肽”包括這些多肽，其包含actriia家族成員的任何天然發(fā)生的多肽以及保持了有用活性的其任何變體(包括突變體、片段、融合物和肽模擬物形式)。例如，actriia多肽包括一些多肽，其衍生自任何已知的actriia的序列、具有至少約80％相同于actriia多肽的序列的序列，任選地至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性。例如，actriia多肽可以結(jié)合并抑制actriia蛋白質(zhì)和/或激活素的功能。可以針對其促進(jìn)骨骼生長和骨礦化的能力選擇actriib多肽。actriia多肽的實例包括人actriia前體多肽(seqidno：1)和可溶的人actriia多肽(例如，seqidno：2、3、7和12)。對于氨基酸序列在seqidno：1中描述的actriia前體多肽，人actriia前體多肽的信號肽位于氨基酸位置1到20；細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域位于氨基酸位置21到135，人actriia前體多肽(seqidno：1)的n-連接的糖基化位點位于seqidno：1的氨基酸位置43和56。編碼seqidno：1的人actriib前體多肽的核酸序列被公開為seqidno：4(genbank條目nm_001616的核苷酸164-1705)。編碼seqidno：2的可溶的人actriia多肽的核酸序列被公開為seqidno：5。序列的描述參見表21。

在具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia多肽是可溶的actriia多肽。actriia蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合激活素，一般是可溶的，因而可以稱為可溶的激活素結(jié)合actriia多肽。因而，如本文使用的，術(shù)語“可溶的actriia多肽”一般是指包含actriia蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多肽，包括actriia蛋白的任何天然發(fā)生的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以及其任何變體(包括突變體、片段、肽模擬物形式)?？扇艿腶ctriia多肽可以結(jié)合激活素；然而，野生型actriia蛋白在結(jié)合激活素與gdf8/11方面不展現(xiàn)顯著的選擇性。天然的或改變的actriia蛋白可以添加對激活素的特異性，通過將它們與第二激活素選擇結(jié)合試劑偶聯(lián)。可溶的激活素結(jié)合actriia多肽的實例包括seqidno：2、3、7、12和13中例舉的可溶多肽。可溶的激活素結(jié)合actriia多肽的其他實例除了actriia蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域之外包括信號序列，例如，蜜蜂蜂毒前導(dǎo)序列(seqidno：8)、組織纖溶酶原激活物(tpa)前導(dǎo)區(qū)(seqidno：9)或天然actriia前導(dǎo)區(qū)(seqidno：10)。seqidno：13中例舉的actriia-hfc多肽使用tpa前導(dǎo)區(qū)。

在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含軛合物/融合蛋白，其包含與抗體的fc部分連接的actriia的激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實施方式中，激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過接頭，例如肽接頭連接到抗體的fc部分。任選地，所述fc結(jié)構(gòu)域在殘基例如asp-265、賴氨酸322和asn-434處具有一個或更多個突變。在某些情況下，具有一個或更多個這些突變(例如，asp-265突變)的突變fc結(jié)構(gòu)域相對于野生型fc結(jié)構(gòu)域具有降低的結(jié)合fcγ受體的能力。在其它情況下，具有一個或更多個這些突變(例如，asn-434突變)的突變fc結(jié)構(gòu)域相對于野生型fc結(jié)構(gòu)域具有提高的結(jié)合mhci類相關(guān)fc受體(fcrn)的能力。包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的actriia的可溶細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的示范性的融合蛋白在seqidno：6、7、12和13中列出。

在具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含與抗體的fc部分連接的actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其部分，其中所述actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含至少75％相同于選自seqidno：6、7、12和13的氨基酸序列的氨基酸序列。在另一個具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含與抗體的fc部分連接的actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其部分，其中所述actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同于選自seqidno：6、7、12和13的氨基酸序列的氨基酸序列。

在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的截短的形式。所述截短可以是在actriia多肽的羧基末端和/或氨基末端。在某些實施方式中，相對于成熟的actriib多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，所述截短可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸長度。在某些實施方式中，所述截短可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個成熟actriia多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的n-末端氨基酸。在某些實施方式中，所述截短可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個成熟actriia多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的c-末端氨基酸。例如，actriia的截短形式包括具有氨基酸20-119；20-128；20-129；20-130；20-131；20-132；20-133；20-134；20-131；21-131；22-131；23-131；24-131；和25-131的多肽，其中所述氨基酸位置參考seqidno：1中的氨基酸位置。

在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含具有一個或更多個氨基酸取代的actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含還帶有氨基酸取代的actriia細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的截短的形式。

在具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是人actriia受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白。在另一個具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是人actriia受體的截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白。在另一個具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是人actriia受體的截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白，其中所述人actriia受體的截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有一個或更多個氨基酸取代。

例如，通過篩選重組地產(chǎn)自編碼actriia多肽的核酸的相應(yīng)片段的多肽，可以獲得actriia多肽的功能活性片段。此外，片段可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如，常規(guī)的merrifield固相f-moc或t-boc化學(xué)作用來化學(xué)地合成。所述片段可以被產(chǎn)生(重組地或通過化學(xué)合成)和測試，來鑒定可以用作actriia蛋白的或激活素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的那些肽片段。

此外，例如，通過篩選重組地產(chǎn)自編碼actriia多肽的相應(yīng)誘變核酸的修飾多肽的文庫，可以獲得actriia多肽的功能活性的變體。所述變體可以被產(chǎn)生和測試，來鑒定可以用作actriia蛋白的或激活素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的那些。在某些實施方式中，actriia多肽的功能變體包含至少75％相同于選自seqidno：2或3的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些情況下，所述功能變體具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同于選自seqidno：2或3的氨基酸序列的氨基酸序列。

例如，通過為了諸如增強效力或穩(wěn)定性(例如，體外貨架壽命或?qū)w內(nèi)蛋白水解降解的抗性)的目的修飾actriia多肽的結(jié)構(gòu)，可以產(chǎn)生功能變體。當(dāng)被選擇以保持激活素結(jié)合時，這種修飾的actriia多肽可以被認(rèn)為是天然發(fā)生的actriia多肽的功能等效物。例如，通過氨基酸取代、刪除或添加，也可以產(chǎn)生修飾的actriia多肽。例如，合理的是預(yù)計，亮氨酸用異亮氨酸或纈氨酸、天冬氨酸用谷氨酸、蘇氨酸用絲氨酸的獨立替換，或氨基酸用結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸的相似性替換(例如，保守突變)將不會對產(chǎn)生的分子的生物學(xué)活性有重大的影響。保守性替換是在其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的替換。通過評估變體actriia多肽在細(xì)胞中以類似于野生型actriia多肽的方式產(chǎn)生反應(yīng)的能力，actriia多肽的氨基酸序列改變是否產(chǎn)生功能性同源物可以容易地測定。

在某些實施方式中，在本文提供的描述的組合物和方法中使用的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可以包含actriia多肽，所述actriia多肽具有可以改變所述多肽的糖基化的一個或更多個特定突變。這樣的突變可以引入或除去一個或更多個糖基化位點，例如，o-連接的或n-連接的糖基化位點。天冬酰胺連接的糖基化識別位點一般包含三肽序列，天冬酰胺-x-蘇氨酸(或天冬酰胺-x-絲氨酸)(其中“x”是任意氨基酸)，其被適當(dāng)?shù)募?xì)胞糖基化酶特異性地識別。也可以通過向野生型actriia多肽的序列中添加或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于o－連接的糖基化位點)來進(jìn)行改變。在糖基化識別位點的第一或第三個氨基酸位置的一個或兩個上的各種氨基酸取代或刪除(和/或在第二位置上的氨基酸刪除)引起所述修飾的三肽序列處的非糖基化。提高actriia多肽上碳水化合物部分的數(shù)量的另一種方式是通過糖苷對actriia多肽的化學(xué)或酶學(xué)偶聯(lián)。取決于使用的偶聯(lián)方式，糖可以附著于(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基基團(tuán)；(c)游離巰基基團(tuán)，例如半胱氨酸的；(d)游離羧基基團(tuán)，例如，絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的；(e)芳香族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的；或(f)谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)。這些方法在1987年9月11日公開的wo87/05330中，以及在aplinandwriston(1981)crccrit.rev.biochem.,pp.259-306中描述了，通過引用合并在本文中。除去actriia多肽上存在的一個或更多個碳水化合物部分可以化學(xué)地或酶學(xué)地實現(xiàn)?；瘜W(xué)的脫糖基化可能涉及例如將actriia多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或相當(dāng)?shù)幕衔?。這種處理引起除了連接的糖(n-乙酰葡萄糖胺或n-乙酰半乳糖胺)之外大部分或所有的糖的裂解，而保留氨基酸序列完整?；瘜W(xué)的脫糖基化由hakimuddinetal.(1987)arch.biochem.biophys.259:52和edgeetal.(1981)anal.biochem.118:131進(jìn)一步描述了。actriia多肽上碳水化合物部分的酶裂解可以通過使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來實現(xiàn)，如thotakuraetal.(1987)meth.enzymol.138:350所描述的。actriia多肽的序列可以被調(diào)整，視情況，取決于使用的表達(dá)系統(tǒng)的類型，因為哺乳動物、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞可能都引入不同的糖基化模式，其可能受到肽的氨基酸序列的影響。一般地，用于人類的actriia蛋白可以在提供適當(dāng)?shù)奶腔牟溉閯游锛?xì)胞系中表達(dá)，例如，hek293或cho細(xì)胞系，而其他表達(dá)系統(tǒng)，例如其他哺乳動物表達(dá)細(xì)胞系、具有工程化的糖基化酶的酵母細(xì)胞系以及昆蟲細(xì)胞預(yù)計也是有用的。

本文進(jìn)一步提供的是產(chǎn)生突變體的方法，特別是actriia多肽的組合突變體的集合，以及截短突變體；組合突變體的庫對于鑒定功能性變體序列是特別有用的。篩選這種組合文庫的目的可以是產(chǎn)生，例如，可以用作激動劑或拮抗劑的actriia多肽變體，或作為選擇，其一起具有新的活性。下文提供了多種篩選分析，這樣的分析可以用于評估變體。例如，可以篩選actriia多肽變體結(jié)合actriia配體，防止actriia配體與actriia多肽結(jié)合，或干擾由actriia配體引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。

可以產(chǎn)生組合衍生的變體，其相對于天然發(fā)生的actriia多肽具有選擇的或一般提高的效價。同樣，誘變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)半衰期與相應(yīng)的野生型actriia多肽顯著不同的變體。例如，改變的蛋白可以變得對引起天然actriia多肽的破壞或滅活的蛋白水解降解或其他細(xì)胞代謝過程更穩(wěn)定或更不穩(wěn)定。這樣的變體和編碼它們的基因可以被利用通過調(diào)節(jié)actriia多肽的半衰期來改變actriia多肽水平。例如，短的半衰期可以產(chǎn)生更短暫的生物學(xué)效果，可以容許對象體內(nèi)重組actriia多肽水平的緊密的控制。在fc融合蛋白中，突變可以在接頭(如果有的話)和/或fc部分進(jìn)行，來改變蛋白質(zhì)的半衰期。

通過編碼多肽文庫的簡并基因文庫的方式可以產(chǎn)生組合文庫，所述多肽文庫各自包括可能的actriia多肽序列的至少一部分。例如，合成的寡核苷酸的混合物可以酶學(xué)連接到基因序列中，從而可能的actriia多肽核苷酸序列的簡并集合可以作為單獨的多肽表達(dá)，或作為選擇，作為更大的融合蛋白的集合(例如，用于噬菌體展示)。

有許多方法可以從簡并寡核苷酸序列中產(chǎn)生可能的同源物的文庫?？梢栽谧詣觗na合成儀中進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，合成的基因然后可以連接到適合的載體中用于表達(dá)。簡并寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域公知的(參見，例如narang,sa(1983)tetrahedron39:3；itakuraetal.,(1981)recombinantdna,proc.3rdclevelandsympos.macromolecules,ed.agwalton,amsterdam:elsevierpp273-289；itakuraetal.,(1984)annu.rev.biochem.53:323；itakuraetal.,(1984)science198:1056；ikeetal.,(1983)nucleicacidres.11:477)。這樣的技術(shù)已經(jīng)用于其他蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化(參見，例如scottetal.,(1990)science249:386-390；robertsetal.,(1992)pnasusa89:2429-2433；devlinetal.,(1990)science249:404-406；cwirlaetal.,(1990)pnasusa87:6378-6382；以及美國專利nos.5,223,409，5,198,346和5,096,815)。

做為選擇，可以利用其他形式的誘變來產(chǎn)生組合文庫。例如，actriia多肽變體可以通過篩選來從文庫中產(chǎn)生和分離，利用，例如，丙氨酸掃描誘變等(rufetal.,(1994)biochemistry33:1565-1572；wangetal.,(1994)j.biol.chem.269:3095-3099；balintetal.,(1993)gene137:109-118；grodbergetal.,(1993)eur.j.biochem.218:597-601；nagashimaetal.,(1993)j.biol.chem.268:2888-2892；lowmanetal.,(1991)biochemistry30:10832-10838；和cunninghametal.,(1989)science244:1081-1085)，通過接頭掃描誘變(gustinetal.,(1993)virology193:653-660；brownetal.,(1992)mol.cellbiol.12:2644-2652；mcknightetal.,(1982)science232:316)；通過飽和誘變(meyersetal.,(1986)science232:613)；通過pcr誘變(leungetal.,(1989)methodcellmolbiol1:11-19)；或通過隨機誘變，包括化學(xué)誘變等(milleretal.,(1992)ashortcourseinbacterialgenetics,cshlpress,coldspringharbor,n.y.；和greeneretal.,(1994)strategiesinmolbiol7:32-34)。接頭掃描誘變，特別是在組合場景中，是鑒定actriia多肽的截短形式(生物活性)的吸引人的方法。

大量的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，用于篩選由點突變或截短產(chǎn)生的組合庫的基因產(chǎn)物，就此而言，用于篩選cdna庫中具有某些性質(zhì)的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)一般將適合于通過actriia多肽的組合誘變產(chǎn)生的基因庫的快速篩選。用于篩選大的基因文庫的最廣泛使用的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用產(chǎn)生的載體庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，并在一定條件下表達(dá)組合的基因，在所述條件中期望的活性的檢測便于相對容易地分離編碼被檢出產(chǎn)物的基因的載體。優(yōu)選的分析包括激活素結(jié)合分析和激活素介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析。

在某些實施方式中，本文描述的方法和組合物的抑制劑中使用的actriia多肽可以進(jìn)一步包含翻譯后修飾，除了天然存在于所述actriia多肽中的之外。這種的修飾可以包括但不限于，乙?；Ⅳ然⑻腔?、磷酸化、脂質(zhì)化和酰化。結(jié)果，修飾的actriia多肽可以含有非氨基酸元件，例如，聚乙二醇、脂質(zhì)、聚糖或單體和磷酸鹽。這種非氨基酸元件對actriia多肽的功能的影響可以通過熟練技術(shù)人員已知的任何方法來測試。當(dāng)通過裂解actriia多肽的新生形式來在細(xì)胞中產(chǎn)生actriia多肽時，翻譯后的加工對于蛋白質(zhì)的正確折疊和/或功能可能也是重要的。不同的細(xì)胞(例如cho、hela、mdck、293、w138、nih-3t3或hek293)具有這種翻譯后活性的特定細(xì)胞機制和特征性的機制，可以選擇來確保actriia多肽的正確修飾和加工。

在某些方面，本文描述的方法和組合物的抑制劑中使用的actriia多肽的功能變體或修飾形式包括具有至少一部分actriia多肽和一個或更多個融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。這樣的融合結(jié)構(gòu)域的公知的實例包括但不限于，多組氨酸、glu-glu、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(gst)、硫氧還蛋白、蛋白a、蛋白g、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)或人血清白蛋白?？梢赃x擇融合結(jié)構(gòu)域以賦予期望的性質(zhì)。例如，某些融合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕ㄟ^親和層析分離融合蛋白是特別有用的。對于親和純化來說，使用親和層析的相關(guān)基質(zhì)，例如，谷胱甘肽-、淀粉酶-和鎳-或鈷-軛合的樹脂。許多這樣的基質(zhì)是以“試劑盒”形式可獲得的，例如，對于(his6)融合配體有用的pharmaciagst純化系統(tǒng)，以及qiaexpress.tm.系統(tǒng)(qiagen)。作為另一個實例，可以選擇融合結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)actriia多肽的檢測。這樣的檢測結(jié)構(gòu)域的實例包括各種熒光蛋白(例如，gfp)，以及“表位標(biāo)簽”，其通常是有特異性抗體的短肽序列。特異性單克隆抗體容易獲得的公知的表位標(biāo)簽包括flag、流感病毒血凝素(ha)和c-myc標(biāo)簽。在某些情況下，融合結(jié)構(gòu)域具有蛋白酶裂解位點，例如，因子xa或凝血酶的，其容許相關(guān)蛋白酶部分地消化所述融合蛋白，從而由此釋放重組蛋白質(zhì)。釋放的蛋白質(zhì)然后可以通過隨后的層析分離與融合結(jié)構(gòu)域分離。在某些優(yōu)選的實施方式中，actriia多肽與使所述actriia多肽在體內(nèi)穩(wěn)定化的結(jié)構(gòu)域融合(“穩(wěn)定物”結(jié)構(gòu)域)。“穩(wěn)定”是指提高血清半衰期的任何事，不論是由于降低的破壞、降低的腎臟清除、還是其他的藥物動力學(xué)效應(yīng)。已知與免疫球蛋白的fc部分融合為大范圍的蛋白質(zhì)賦予期望的藥物動力學(xué)性質(zhì)。同樣地，與人血清白蛋白融合可以賦予期望的性質(zhì)。可以選擇的其他類型的融合結(jié)構(gòu)域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域(賦予其他生物學(xué)功能的，例如，進(jìn)一步刺激骨骼生長或肌肉生長，如所希望的)。

要理解的是融合蛋白的不同元件可以以與期望的功能一致的任何方式布置。例如，actriia多肽可以置于異源結(jié)構(gòu)域的c-末端，或做為選擇，異源結(jié)構(gòu)域可以置于actriia多肽的c-末端。actriia多肽結(jié)構(gòu)域和異源結(jié)構(gòu)域不必在融合蛋白中相鄰，其他的結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列可以被包括在任一結(jié)構(gòu)域的c-末端或n-末端，或兩個結(jié)構(gòu)域之間。

在某些實施方式中，本文描述的方法和組合物的抑制劑中使用的actriia多肽可以含有能夠穩(wěn)定化所述actriia多肽的一個或更多個修飾。例如，這樣的修飾可以增強actriia多肽的體外半衰期，增強actriia多肽的循環(huán)半衰期，或降低actriia多肽的蛋白水解酶降解。這樣的穩(wěn)定化修飾可以包括，但不限于，融合蛋白(包括，例如，包含actriia多肽和穩(wěn)定化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)、糖基化位點的修飾(包括，例如，向actriia多肽添加糖基化位點)，以及碳水化合物部分的修飾(包括，例如，從actriia多肽除去碳水化合物部分)。對于融合蛋白來說，actriia多肽融合到穩(wěn)定物結(jié)構(gòu)域，例如igg分子(例如，fc結(jié)構(gòu)域)。如本文使用的，術(shù)語“穩(wěn)定物結(jié)構(gòu)域”不僅是指融合蛋白情況下的融合結(jié)構(gòu)域(例如，fc)，還包括非蛋白性的修飾，例如，碳水化合物部分，或非蛋白性的聚合物，例如，聚乙二醇。

在某些實施方式中，分離自或基本上沒有其他蛋白質(zhì)的actriia多肽的分離的和/或純化的形式可以用于本文描述的方法和組合物。actriia多肽一般可以通過從重組核酸表達(dá)來產(chǎn)生。

在某些方面，本文描述的組合物和方法中使用的actriia多肽使用分離的和/或重組的核酸產(chǎn)生，所述核酸編碼任一種actriia多肽(例如，可溶的actriia多肽)，包括本文公開的片段、功能變體和融合蛋白。例如，是4編碼天然發(fā)生的人actriia前體多肽，而seqidno：5編碼actriia的加工的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。這樣的核酸可以是單鏈的或是雙鏈的。所述核酸可以是dna或rna分子。這些核酸可以用于，例如，制造actriia多肽的方法，或作為直接的治療試劑(例如，在基因治療方法中)。

在某些方面，編碼actriia多肽的核酸可以包括作為seqidno：4或5的變體的核酸。變體核苷酸序列包括差異在于一個或更多個核苷酸取代、添加或刪除的序列，例如，等位變體。

在某些實施方式中，編碼actriia多肽的分離的或重組的核酸序列可以是至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同于seqidno：4或5。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，與seqidno：4或5互補的核酸序列以及seqidno：4或5的變體可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriia多肽。在進(jìn)一步的實施方式中，這樣的核酸序列可以是分離的，重組的和/或融合到異源核苷酸序列的，或是來自dna文庫。

在其他實施方式中，用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriia多肽的核酸可以包括在高度嚴(yán)格條件下與seqidno：4或5指定的核苷酸序列、seqidno：4或5的互補序列或其片段雜交的核苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，促進(jìn)dna雜交的合適的嚴(yán)格條件可以是變化的。例如，人們可以在6.0倍氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)、大約45℃下雜交，最后2.0倍ssc在50℃下洗滌。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自50℃下的約2.0倍ssc的低嚴(yán)格度，到50℃下約0.2倍ssc的高嚴(yán)格度。此外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫約22℃下的低嚴(yán)格條件，提高到大約65℃的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽度可以都變化，或者溫度或鹽濃度保持不變而另一個變量發(fā)生改變。在一個實施方式中，在6倍ssc室溫下的低嚴(yán)格條件下雜交、隨后在室溫下2倍ssc洗滌的核酸可以用于本文描述的方法和組合物。

由于遺傳密碼的簡并性而不同于seqidno：4或5中所列核酸的分離的核酸也可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriia多肽。例如，許多氨基酸由超過一種三聯(lián)體指定。指定相同氨基酸的密碼子，或同義密碼子(例如，cau和cac對于組氨酸是同義的)可以產(chǎn)生“沉默”突變，其不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列。然而，預(yù)計的是，引起目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變的dna序列多態(tài)性將存在于哺乳動物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，編碼特定蛋白質(zhì)的核酸的一個或更多個核苷酸(達(dá)到核苷酸的約3-5％)中的這些變異由于天然的等位變異可以存在于給定物種的個體中。

在某些實施方式中，重組核酸可以可操作連接到表達(dá)構(gòu)建體中的一個或更多個調(diào)節(jié)核苷酸序列。調(diào)節(jié)核苷酸序列一般將適合于用來表達(dá)的宿主細(xì)胞。許多類型的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和適合的調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域已知的，用于多種宿主細(xì)胞。一般地，所述一個或更多個調(diào)節(jié)核苷酸序列可以包括，但不限于，啟動子序列、前導(dǎo)區(qū)或信號序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，以及增強子或激活物序列。本領(lǐng)域已知的組成型或可誘導(dǎo)啟動子是本文期待的。啟動子可以是天然發(fā)生的啟動子，或組合了超過一種啟動子的元件的雜合啟動子。表達(dá)構(gòu)建體可以存在于細(xì)胞中或游離體例如質(zhì)粒上，或者表達(dá)構(gòu)建體可以插入染色體中。在優(yōu)選的實施方式中，表達(dá)載體含有選擇性標(biāo)記基因以容許選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。選擇性標(biāo)記基因是本領(lǐng)域公知的，將隨使用的宿主細(xì)胞而變化。

在某些方面，適用于本文描述的方法和組合物的actriia多肽的生產(chǎn)中使用的核酸可以在表達(dá)載體中提供，所述表達(dá)載體包含編碼actriia多肽的核苷酸序列并與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作連接。調(diào)節(jié)序列是公知的，被選擇來指導(dǎo)actriia多肽的表達(dá)。因而，術(shù)語調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強子和其他表達(dá)控制元件。示范性的調(diào)節(jié)序列在goeddel；geneexpressiontechnology:methodsinenzymology,academicpress,sandiego,calif.(1990)中描述。例如，控制與之可操作地連接的dna序列的表達(dá)的各種表達(dá)控制序列的任一種，可以用于這些載體來表達(dá)編碼actriia多肽的dna序列。這類有用的表達(dá)控制序列包括，例如，sv40的早期和晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒即時早期啟動子、rsv啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、tac或trc系統(tǒng)、其表達(dá)由t7rna聚合酶指導(dǎo)的t7啟動，噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)域，ft衣殼蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶例如pho5的啟動子、酵母.alpha.接合因子的啟動子、桿狀病毒系統(tǒng)的多面體啟動子，以及已知控制原核和真核細(xì)胞以及它們的病毒的基因表達(dá)的其他序列，以及它們的各種組合。要理解的是，表達(dá)載體的設(shè)計可以取決于這些因素，如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，和/或希望表達(dá)的蛋白質(zhì)的類型。此外，還應(yīng)當(dāng)考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力以及載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如抗生素標(biāo)志物。

適用于本文描述的方法和組合物的actriia多肽的生產(chǎn)中使用的重組核酸可以通過將克隆的基因或其部分連接到適合于在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞(酵母、禽類、昆蟲或哺乳動物)或兩者中表達(dá)的載體中來產(chǎn)生。用于重組actriia多肽的生產(chǎn)的表達(dá)載體包括質(zhì)粒和其他載體。例如，適合的載體包括質(zhì)粒類型：pbr322衍生的質(zhì)粒、pembl衍生的質(zhì)粒、pex衍生的質(zhì)粒、pbtac衍生的質(zhì)粒和puc-衍生的質(zhì)粒，用于在原核細(xì)胞例如e.coli中表達(dá)。

某些哺乳動物表達(dá)載體含有原核序列來促進(jìn)載體在細(xì)菌中的增殖，以及含有一種或更多種在真核細(xì)胞中表達(dá)的真核轉(zhuǎn)錄單位。pcdnai/amp、pcdnai/neo、prc/cmv、psv2gpt、psv2neo、psv2-dhfr、ptk2、prsvneo、pmsg、psvt7、pko-neo和phyg衍生的載體是適合于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的哺乳動物表達(dá)載體的實例。這些載體的一些被來自細(xì)菌質(zhì)粒例如pbr322表達(dá)序列修飾，來促進(jìn)在原核和真核細(xì)胞兩者中的復(fù)制和藥物抗性選擇。做為選擇，病毒的衍生物，例如，牛乳頭狀瘤病毒(bpv-1)或epstein-barr病毒(phebo、prep-衍生的和p205)可以用于蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的短暫表達(dá)。其他病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)表達(dá)系統(tǒng)的實例可以在下文基因治療遞送系統(tǒng)的說明中找到。制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化宿主生物體所采用的各種方法是本領(lǐng)域公知的。對于原核和真核細(xì)胞都適合的其他表達(dá)系統(tǒng)，以及一般的重組過程，參見molecularcloningalaboratorymanual,3rded.,ed.bysambrook,fritschandmaniatis(coldspringharborlaboratorypress,2001)。在某些情況下，可能希望的是通過使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組多肽。這樣的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的實例包括pvl衍生的載體(例如，pvl1392、pvl1393和pvl941)、pacuw衍生的載體(例如pacuw1)和pbluebac-衍生的載體(例如含有.beta.-gal的pbluebaciii)。

載體可以被設(shè)計用于在cho細(xì)胞中生產(chǎn)目標(biāo)actriia多肽，例如，pcmv-script載體(stratagene,lajolla,calif.)、pcdna4載體(invitrogen,carlsbad,calif.)和pci-neo載體(promega,madison,wis.)。明顯的是，目標(biāo)基因構(gòu)建體可以用于引起目標(biāo)actriia多肽在培養(yǎng)物中增殖的細(xì)胞中表達(dá)，例如，來產(chǎn)生蛋白質(zhì)，包括融合蛋白或變體蛋白，用于純化。

用包括一種或更多種目標(biāo)actriia多肽的編碼序列(例如，seqidno：4或5)的重組基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriia多肽。所述宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，本文提供的actriia多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞例如e.coli、昆蟲細(xì)胞(例如，使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

因而，本文提供的是生產(chǎn)actriia多肽的方法。例如，用編碼actriia多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)來容許發(fā)生actriia多肽的表達(dá)。從細(xì)胞與含有actriia多肽的培養(yǎng)基的混合物中，可以分泌和分離actriia多肽。做為選擇，actriia多肽可以細(xì)胞質(zhì)地或在膜部分中保持，收獲細(xì)胞、裂解并分離蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其他副產(chǎn)物。用于細(xì)胞培養(yǎng)的適合的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域公知的。利用本領(lǐng)域已知的用于純化蛋白質(zhì)的技術(shù)，可以從細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)、宿主細(xì)胞或兩者分離目標(biāo)actriia多肽，包括離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳、使用特異于actriia多肽的特定表位的抗體的免疫親和純化、以及使用結(jié)合與actriia多肽融合的結(jié)構(gòu)域的試劑的親和純化(例如，蛋白a柱可以用于純化actriia-fc融合物)。在優(yōu)選的實施方式中，actriia多肽是含有便于其純化的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在一個實施方式中，純化通過一系列柱層析步驟來實現(xiàn)，包括，例如，三種或更多種以下的，按任何順序：蛋白a層析、q瓊脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、空間排阻層析和陽離子交換層析。純化可以用病毒過濾和緩沖液交換來完成。如本文表明的，actriia-hfc蛋白可以純化到通過空間排阻層折測定的>98％的純度，和通過sds-page測定的>95％的純度。這一水平的純度足以在小鼠中對骨骼實現(xiàn)期望的效果，以及在小鼠、大鼠和非人靈長類中實現(xiàn)可接受的安全分布。

在另一個實施方式中，編碼位于重組actriia多肽的期望部分的n-末端的純化前導(dǎo)序列例如聚-(his)/腸激酶裂解位點序列的融合基因可以容許表達(dá)的融合蛋白通過利用ni²⁺金屬樹脂的親和層析來純化。純化前導(dǎo)序列然后通過用腸激酶處理來除去，以提供純化的actriia多肽(例如，參見hochulietal.,(1987)j.chromatography411:177；和janknechtetal.,pnasusa88:8972)。

用于制造融合基因的技術(shù)是公知的。基本上，根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行編碼不同多肽序列的各種dna片段的連接，采用鈍末端的或交錯末端的末端用于連接，限制酶消化來提供適當(dāng)?shù)哪┒耍暻闆r填充粘末端，堿性磷酸酶處理來避免不希望的連接，以及酶連接。在另一個實施方式中，融合基因可以通過常規(guī)技術(shù)，包括自動的dna合成儀來合成。做為選擇，可以使用錨引物來進(jìn)行基因片段的pcr擴增，所述錨引物產(chǎn)生兩個連續(xù)基因片段之間的互補的突出，其隨后可以退火來產(chǎn)生嵌合基因序列(參見，例如currentprotocolsinmolecularbiology,eds.ausubeletal.,johnwiley&sons:1992)。

actriia-fc融合蛋白可以從paid4載體(sv40ori/增強子，cmv啟動子)在穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的cho-dukxbl1細(xì)胞中表達(dá)，使用seqidno：9的組織血纖蛋白溶酶原前導(dǎo)序列。fc部分是人igg1fc序列，如seqidno：7所示。在某些實施方式中，在表達(dá)時，平均起來，所含的蛋白質(zhì)具有每分子的actriia-fc融合蛋白約1.5到2.5摩爾的唾液酸。

在某些實施方式中，actriia-fc融合物的長血清半衰期可以是在人類對象中25-32天。另外，相比在人293細(xì)胞中表達(dá)的actriia-hfc融合蛋白所報告的，cho細(xì)胞表達(dá)的材料可以具有更高的對激活素b配體的親和力(delreetal.,jbiolchem.2004dec17；279(51):53126-35)。另外，不受理論的限制，使用比其他前導(dǎo)序列提供更高生產(chǎn)的tpa前導(dǎo)序列，不同于用天然前導(dǎo)區(qū)表達(dá)的actriia-fc，可以提供高純度的n-末端序列。使用天然前導(dǎo)序列可能產(chǎn)生兩種主要種類的actriia-fc，各自具有不同的n-末端序列。

8.5.2actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑

如本文使用的，術(shù)語“actriib”是指來自任何物種的激活素iib型受體(actriib)蛋白的家族，以及通過誘變或其他修飾衍生自這些actriib蛋白的變體。本文提及actriib被理解為是提及所述受體的當(dāng)前鑒定的形式的任一種。actriib家族的成員一般是跨膜的蛋白質(zhì)，由具有富半胱氨酸區(qū)的配體結(jié)合細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及具有預(yù)測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。

本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包括，非限制性地，激活素結(jié)合可溶actriib多肽；結(jié)合激活素(特別是激活素a或b亞基，也稱為βa或βb)并破壞actriib結(jié)合的抗體；結(jié)合actriib并破壞激活素結(jié)合的抗體；為激活素或actriib結(jié)合選擇的非抗體蛋白質(zhì)；以及為激活素或actriib結(jié)合選擇的隨機肽，其可以軛合到fc結(jié)構(gòu)域。

在某些實施方式中，具有激活素或actriib結(jié)合活性的兩種或更多種不同的蛋白質(zhì)(或其他部分)，特別是分別阻斷i型(例如，可溶的i型激活素受體)和ii型(例如，可溶的ii型激活素受體)結(jié)合位點的激活素結(jié)合物可以連接在一起，產(chǎn)生抑制actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙功能或多功能結(jié)合分子，因而可以用于本文描述的組合物和方法。在某些實施方式中，抑制actriib的激活素-actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸拮抗劑包括核酸適體、小分子和其他試劑，用于本文描述的組合物和方法中。

8.5.2.1包含actriib多肽的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑

如本文使用的，術(shù)語“actriib多肽”是指這些多肽，其包含actriib家族成員的任何天然發(fā)生的多肽以及保持了有用活性的其任何變體(包括突變體、片段、融合物和肽模擬物形式)例如，actriib多肽包括一些多肽，其衍生自任何已知的actriib受體的序列、具有至少約80％相同于actriib多肽的序列的序列，任選地至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。例如，actriib多肽可以結(jié)合并抑制actriib蛋白質(zhì)和/或激活素的功能。actriib多肽的實例包括人actriib前體多肽(seqidno：16或seqidno：28)。對于氨基酸序列描述為seqidno：16或seqidno：28的actriib前體多肽(即，人actriib前體多肽)，actriib前體多肽的信號肽位于氨基酸1到18；細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域位于氨基酸19到134，潛在的n-連接的糖基化位點位于氨基酸位置42和65。編碼seqidno：16的人actriib前體多肽的核酸序列以seqidno：19公開(seqidno：19提供了在相應(yīng)于氨基酸位置64的密碼子處的丙氨酸，但是可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的方法容易地修飾，來提供相應(yīng)于氨基酸位置64的密碼子處的精氨酸作為替代)。序列的描述參見表21。

本文描述的所有actriib相關(guān)的多肽的氨基酸編號是基于seqidno：16和seqidno：28(其僅在位置64表達(dá)的氨基酸不同)的氨基酸編號，除非另外指定。例如，如果一actriib多肽被描述為在氨基酸位置79具有取代/突變，這將被理解為該位置79是指seqidno：16或seqidno：28中的第79個氨基酸，從其中衍生出所述actriib多肽。同樣地，如果一種actriib多肽被描述為在氨基酸位置64具有丙氨酸或精氨酸，這將被理解為位置64是指seqidno：16或seqidno：28中的第64個氨基酸，從其中衍生出所述actriib多肽。

在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含多肽，所述多肽包含actriib的激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實施方式中，actriib的激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其部分。在具體的實施方式中，actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分是可溶的。actriib多肽的說明性的修飾形式在美國專利申請公開no.20090005308和20100068215中公開了，其公開內(nèi)容通過完全引用合并在本文中。

在具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib多肽是可溶的actriib多肽。術(shù)語“可溶的actriib多肽”一般是指包含actriib蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多肽，包括actriib蛋白的任何天然發(fā)生的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以及其任何變體(包括突變體、片段和肽模擬物形式)?？扇艿腶ctriib多肽可以結(jié)合激活素；然而，在結(jié)合激活素與gdf8/11方面野生型actriib蛋白不展現(xiàn)顯著的選擇性。在某些實施方式中，具有不同結(jié)合性質(zhì)的改變形式的actriib可以用于本文提供的方法中。這樣的改變的形式公開于，例如，國際專利申請公開no.wo2006/012627和wo2010/019261，其公開內(nèi)容通過完全引用合并在本文中。通過將它們與第二激活素選擇性結(jié)合試劑偶聯(lián)，天然的或改變的actriib蛋白可以被給與添加的對激活素的特異性。示范性的可溶的actriib多肽包括人actriib多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(例如，seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43)。

具有hildenetal.(blood,1994,83(8):2163-70)公開的actriib細(xì)胞外序列的fc融合蛋白，其在相應(yīng)于actriib前體氨基酸序列即seqidno：16的氨基酸64的位置具有丙氨酸(本文稱為“a64”)，已經(jīng)被證明具有對激活素和gdf-11的相對低的親和力。相比之下，在actriib前體氨基酸序列的位置64處具有精氨酸(本文稱為“r64”)的fc融合蛋白具有處于低納摩爾到高皮摩爾范圍內(nèi)的對激活素和gdf-11的親和力(參見，例如，美國專利申請公開或20100068215，其公開內(nèi)容完全合并在本文中)。在位置64具有精氨酸的actriib前體氨基酸序列在seqidno：28中示出。因而，在某些實施方式中，根據(jù)本文描述的組合物和方法使用的actriib多肽可以包含(在相應(yīng)于actriib前體氨基酸序列的氨基酸64的位置上的丙氨酸，即seqidno：16；或(ii)在actriib前體序列的位置64的精氨酸，即seqidno：28)。在其他實施方式中，根據(jù)本文描述的組合物和方法使用的actriib多肽可以包含在相應(yīng)于actriib前體氨基酸序列，即seqidno：16或seqidno：28的氨基酸64的位置上的不是丙氨酸或精氨酸的氨基酸。

已經(jīng)顯示的是，刪除處于actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的c-末端的脯氨酸結(jié)降低了受體對激活素的親和力(參見，例如，attisanoetal.,cell,1992,68(1):97-108)。相對于包括脯氨酸結(jié)區(qū)域和完整的近膜結(jié)構(gòu)域、含有seqidno：28的氨基酸20-134的actriib-fc融合蛋白“actriib(20-134)-fc”，含有seqidno：28的氨基酸20-119(即，seqidno：32)的actriib-fc融合蛋白“actriib(20-119)-fc”具有降低的對gdf-11和激活素的結(jié)合。然而，相對于actriib的未截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，含有seqidno：28的氨基酸20-129的actriib-fc融合蛋白“actriib(20-129)-fc”保持了相似的但稍微降低的活性，盡管其脯氨酸結(jié)區(qū)域被破壞。因而，包含在seqidno：28的氨基酸134、133、132、131、130和129處停止的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的actriib多肽都被預(yù)期是有活性的，但是在氨基酸134或133停止的構(gòu)建體可能具有最大活性。類似地，在殘基129-134的任一個上的突變預(yù)期不會大幅度改變配體結(jié)合親和力，如seqidno：28的p129和p130的突變實質(zhì)上不降低配體結(jié)合的事實所指示的。因此，根據(jù)本文描述的方法和組合物使用的actriib多肽可以早至seqidno：28(或seqidno：16)的氨基酸109(即，最后的半胱氨酸)結(jié)束，然而，終止于seqidno：28(或seqidno：16)的氨基酸位置109到119或這之間的形式預(yù)計不具有降低的配體結(jié)合能力。

seqidno：16和seqidno：28的氨基酸29代表actriib前體序列中的最初的半胱氨酸。預(yù)計的是，在seqidno：16或seqidno：28的n-末端的氨基酸29開始或在這些氨基酸位置之前開始的actriib將保持配體結(jié)合活性。在seqidno：16或seqidno：28的位置24處丙氨酸到天冬酰胺的突變引入n-連接的糖基化位點而基本上不影響配體結(jié)合。這確認(rèn)了在相應(yīng)于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-29的信號裂解肽和半胱氨酸交聯(lián)區(qū)之間的突變是良好耐受的。特別地，在seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置20、21、22、23和24開始的actriib多肽將保持活性，在seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置25、26、27、28和29開始的actriib多肽也預(yù)期保持活性。在seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置22、23、24或25開始的actriib多肽將具有最大活性。

合起來，根據(jù)本文描述的方法和組合物使用的actriib前體蛋白(即，seqidno：16或seqidno：28)的活性部分(即，actriib多肽)一般將包含seqidno：16或seqidno：28的氨基酸29-109，這樣的actriib多肽可以，例如，開始于與seqidno：16或seqidno：28的氨基酸19-29的任一個相應(yīng)的殘基，結(jié)束于與seqidno：16或seqidno：28的氨基酸109-134的任一個相應(yīng)的位置。本文涵蓋的actriib多肽的具體實例包括開始于seqidno：16或seqidno：28的19-29、20-29或21-29的氨基酸位置、結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的119-134、119-133或129-134、129-133的氨基酸位置的那些。本文涵蓋的actriib多肽的其他具體實例包括開始于seqidno：16或seqidno：28的20-24(或21-24，或22-25)的氨基酸位置、結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的109-134(或109-133)、119-134(或119-133)或129-134(或129-133)的氨基酸位置的那些。落入這些范圍的變體actriib多肽也是期待的，特別是與seqidno：16或seqidno：28的相應(yīng)部分具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性或序列同源性的那些。

在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的截短的形式。所述截短可以是在actriib多肽的羧基末端和/或氨基末端。在某些實施方式中，相對于成熟的actriib多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，所述截短可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸長度。在某些實施方式中，所述截短可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個成熟actriib多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的n-末端氨基酸。在某些實施方式中，所述截短可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個成熟actriib多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的c-末端氨基酸。例如，actriib的截短形式包括具有氨基酸20-119；20-128；20-129；20-130；20-131；20-132；20-133；20-134；20-131；21-131；22-131；23-131；24-131；和25-131的多肽，其中所述氨基酸位置參考seqidno：16或seqidno：28中的氨基酸位置。

actriib的其他示范性的截短形式包括(i)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸21-29的任一個的氨基酸(任選地開始于seqidno：16或seqidno：28的21-25)以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸109-134的任一個的多肽；(ii)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-29的任一個(任選地開始于seqidno：16或seqidno：28的20-25)以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸109-133的任一個的多肽；(iii)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-24的任一個(任選地開始于seqidno：16或seqidno：28的20-25)以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸109-133的任一個的多肽；(iv)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸21-24的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸109-134的任一個的多肽；(v)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-24的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸118-133的任一個的多肽；(vi)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸21-24的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸118-134的任一個的多肽；(vii)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-24的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸128-133的任一個的多肽；(viii)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-24的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸128-133的任一個的多肽；(ix)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸21-29的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸118-134的任一個的多肽；(x)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-29的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸118-133的任一個的多肽；(xi)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸21-29的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸128-134的任一個的多肽；和(xii)開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-29的任一個以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸128-133的任一個的多肽。在具體的實施方式中，actriib多肽包含，基本上由以下組成，或由以下組成，開始于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置25、并結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置131的氨基酸序列。在另一個具體的實施方式中，actriib由以下組成或基本上由以下組成，seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42或43的氨基酸序列。

本文描述的組合物和方法中使用的actriib多肽的任一個可以作為同二聚體生產(chǎn)。本文描述的組合物和方法中使用的actriib多肽的任一個可以被配制為具有異源部分的融合蛋白，其包含來自igg重鏈的恒定區(qū)，例如fc結(jié)構(gòu)域。本文描述的組合物和方法中使用的actriib多肽的任一個可以包含處在相應(yīng)于seqidno：16或seqidno：28的位置79的位置上的酸性氨基酸，任選地與相對于seqidno：16或seqidno：28的一個或更多個其他的氨基酸取代、刪除或插入組合。

在具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含具有一個或更多個氨基酸取代/突變的actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。這樣的氨基酸取代/突變可以是，例如，seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置79處的亮氨酸交換為酸性氨基酸，例如，天冬氨酸或谷氨酸。例如，seqidno：16或seqidno：28的位置l79可以在actriib細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域多肽中改變，來賦予改變的激活素-肌肉生長抑制素(gdf-11)結(jié)合性質(zhì)。相比激活素結(jié)合，l79a和l79p突變更大程度地降低gdf-11結(jié)合。l79e和l79d突變保持了gdf-11結(jié)合，而展現(xiàn)了大大地降低的激活素結(jié)合。

在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含截短形式的actriib細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其還帶有氨基酸取代，例如，seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置79處的亮氨酸改變?yōu)樗嵝园被?，例如，天冬氨酸或谷氨酸。在具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的還帶有氨基酸取代的actriib多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的截短形式是seqidno：23。截短的和/或帶有一個或更多個氨基酸取代的actriib的形式可以如以上討論的連接到抗體的fc結(jié)構(gòu)域。

例如，通過篩選重組地產(chǎn)自編碼actriib多肽的核酸的相應(yīng)片段的多肽，可以獲得actriib多肽的功能活性片段。此外，片段可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如，常規(guī)的merrifield固相f-moc或t-boc化學(xué)作用來化學(xué)地合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到的是，其他技術(shù)，包括例如用于肽合成的各種樹脂和液相系統(tǒng)可以用于合成本文描述的肽基片段。所述片段可以被產(chǎn)生(重組地或通過化學(xué)合成)和測試，來鑒定可以用作actriib蛋白或激活素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的那些肽片段。

此外，例如，通過篩選重組地產(chǎn)自編碼actriib多肽的相應(yīng)誘變核酸的修飾多肽的文庫，可以獲得actriib多肽的功能活性的變體。所述變體可以被產(chǎn)生和測試，來鑒定可以用作actriib蛋白的或激活素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的那些。在某些實施方式中，actriib多肽的功能變體包括至少75％相同于選自seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述功能變體具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同于選自seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的氨基酸序列的氨基酸序列。

例如，通過為了諸如增強效力或穩(wěn)定性(例如，體外貨架壽命或?qū)w內(nèi)蛋白水解降解的抗性)的目的修飾actriib多肽的結(jié)構(gòu)，可以產(chǎn)生功能變體。當(dāng)被選擇以保持激活素結(jié)合時，這種修飾的actriib多肽可以被認(rèn)為是天然發(fā)生的actriib多肽的功能等效物。例如，通過氨基酸取代、刪除或添加，也可以產(chǎn)生修飾的actriib多肽。例如，合理的是預(yù)計，亮氨酸用異亮氨酸或纈氨酸、天冬氨酸用谷氨酸、蘇氨酸用絲氨酸的獨立替換，或氨基酸用結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸的相似性替換(例如，保守突變)將不會對產(chǎn)生的分子的生物學(xué)活性有重大的影響。保守性替換是在其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的替換。通過評估變體actriib多肽在細(xì)胞中以類似于野生型actriib多肽的方式產(chǎn)生反應(yīng)的能力，actriib多肽的氨基酸序列改變是否產(chǎn)生功能性同源物可以容易地測定。

actriib多肽突變體，特別是actriib多肽的組合突變體的集合，以及截短突變體；組合突變體的庫，對于鑒定可用于本文描述的方法和組合物的功能變體序列是特別有用的。篩選這種組合文庫的目的可以是產(chǎn)生，例如，可以用作激動劑或拮抗劑的actriib多肽變體，或作為選擇，其一起具有新的活性。

已經(jīng)證明的是，由seqidno：16或seqidno：28的殘基y31、n33、n35、l38到t41、e47、e50、q53到k55、l57、h58、y60、s62、k74、w78到n83、y85、r87、a92和e94到f101定義了actriib的配體結(jié)合口袋。在這些位置上，預(yù)計的是保守性突變將是耐受的，而k74a突變是良好耐受的，r40a、k55a、f82a和位置l70的突變也是。在非洲蟾蜍(xenopus)中r40是k，表明這個位置的堿性氨基酸是耐受的。在牛actriib中q53是r，在非洲蟾蜍actriib中是k，因而包括r、k、q、n和h的氨基酸在這個位置將是耐受的。因而，用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽的通式是，包含seqidno：16或seqidno：28的氨基酸29-109，但任選地開始于seqidno：16或seqidno：28的20-24或22-25的氨基酸位置，以及結(jié)束于seqidno：16或seqidno：28的129-134的氨基酸位置，在配體結(jié)合口袋中包含不超過1、2、5或15個保守氨基酸改變，以及在配體結(jié)合口袋中seqidno：16或seqidno：28的氨基酸位置40、53、55、74、79和/或82的零個、一個或更多個非保守改變。這樣的actriib多肽可以保持與seqidno：16或seqidno：28的氨基酸29-109的序列大于80％、90％、95％或99％的序列同一性或序列同源性。結(jié)合口袋之外的位點，在此變異性是特別好地耐受的，包括actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基和羧基末端，以及位置42-46和65-73。seqidno：16或seqidno：28的位置65處天冬酰胺到丙氨酸的改變(n65a)實際上改善了a64背景下的配體結(jié)合，因而預(yù)計在r64背景下對配體結(jié)合沒有不利影響。這種改變可能除去了a64背景下在n65處的糖基化，因而表明這個區(qū)域的顯著改變可能是耐受的。雖然r64a改變是不良耐受的，r64k是良好耐受的，因而另一種堿性殘基，例如，h可以在位置64處耐受。

作為在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中有突變的actriib多肽的具體實例，actriib的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的帶正電氨基酸殘基asp(d80)可以突變?yōu)椴煌陌被釟埢瑥亩凅wactriib多肽優(yōu)先地結(jié)合gdf8而不是激活素。在具體的實施方式中，d80殘基被改變?yōu)檫x自以下構(gòu)成的組的氨基酸殘基：不帶電的氨基酸殘基、負(fù)電氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基。作為進(jìn)一步的具體實例，疏水性殘基l79可以改變?yōu)樗嵝园被崽於彼峄蚬劝彼?，來大大降低激活素結(jié)合而保持gdf11結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，大多數(shù)所描述的突變體、變體或修飾體可以在核酸水平制備，或在某些情況下，通過翻譯修飾或化學(xué)合成制備。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。

在具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包含軛合物/融合蛋白，其包含與抗體的fc部分連接的actriib受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(例如，激活素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。這樣的軛合物/融合蛋白可以包含本文公開的任何actriib多肽(例如，seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42或43的任一個)、任何本領(lǐng)域已知的actriib多肽或使用本領(lǐng)域已知的和/或本文提供的方法產(chǎn)生的任何actriib多肽。

在某些實施方式中，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域通過接頭，例如肽接頭連接到抗體的fc部分。示范性的接頭包括短多肽序列，例如2-10、2-5、2-4、2-3個氨基酸殘基(例如，甘氨酸殘基)，例如，gly-gly-gly接頭。在具體的實施方式中，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)ly-gly-gly(ggg)。在另一個具體的實施方式中，所述接頭包含氨基酸序列thr-gly-gly-gly(tggg)。任選地，所述fc結(jié)構(gòu)域在殘基例如asp-265、賴氨酸322和asn-434處具有一個或更多個突變。在某些情況下，具有一個或更多個這些突變(例如，asp-265突變)的突變fc結(jié)構(gòu)域具有相對于野生型fc結(jié)構(gòu)域降低的結(jié)合fcγ受體的能力。在其它情況下，具有一個或更多個這些突變(例如，asn-434突變)的突變fc結(jié)構(gòu)域相對于野生型fc結(jié)構(gòu)域具有提高的結(jié)合mhci類相關(guān)fc受體(fcrn)的能力。包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的actriib的可溶細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的示范性的融合蛋白在seqidno：20、21、24、25、34、35、38、39、40、41、44、46和47中列出。

在具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含與抗體的fc部分連接的actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其部分，其中所述actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含至少75％相同于選自seqidno：20、21、24、25、34、35、38、39、40、41、44、46和47的氨基酸序列的氨基酸序列。在另一個具體的實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含與抗體的fc部分連接的actriib的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其部分，其中所述actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包含至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同于選自seqidno：20、21、24、25、34、35、38、39、40、41、44、46和47的氨基酸序列的氨基酸序列。

在具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是人actriib受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白。在另一個具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是人actriib受體的截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白。在另一個具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是人actriib受體的截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白，其中所述人actriib受體的截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有相應(yīng)于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸79的氨基酸位置處的氨基酸取代。在一個實施方式中，在相應(yīng)于seqidno：16或seqidno：28的氨基酸79的氨基酸位置處的氨基酸取代是亮氨酸到天冬氨酸的取代(即，l79d突變)。

在具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是seqidno：24或25，其代表人actriib受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白，其中所述actriib細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含帶有l(wèi)79d突變的seqidno：28的氨基酸25-131。編碼seqidno：24的actriib-fc融合蛋白的核酸序列在seqidno：45中示出。

在另一個具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是seqidno：34或35，其代表人actriib受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與igg1的fc部分之間的融合蛋白，其中所述actriib細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含帶有l(wèi)79d突變的seqidno：16的氨基酸25-131。

天冬酰胺連接的糖基化識別位點一般包含三肽序列，天冬酰胺-x-蘇氨酸(或天冬酰胺-x-絲氨酸)(其中“x”是任意氨基酸)，其被適當(dāng)?shù)募?xì)胞糖基化酶特異性地識別。也可以通過向野生型actriib多肽的序列中添加或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于o－連接的糖基化位點)來進(jìn)行改變。在糖基化識別位點的第一或第三個氨基酸位置的一個或兩個上的各種氨基酸取代或刪除(和/或在第二位置上的氨基酸刪除)引起所述修飾的三肽序列處的非糖基化。提高actriib多肽上碳水化合物部分的數(shù)量的另一種方式是通過糖苷對actriib多肽的化學(xué)或酶學(xué)偶聯(lián)。取決于使用的偶聯(lián)方式，糖可以附著于(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基基團(tuán)；(c)游離巰基基團(tuán)，例如半胱氨酸的；(d)游離羧基基團(tuán)，例如，絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的；(e)芳香族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的；或(f)谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)。這些方法在1987年9月11日公開的wo87/05330中，以及在aplinandwriston(1981)crccrit.rev.biochem.,pp.259-306中描述了，通過引用合并在本文中。除去actriib多肽上存在的一個或更多個碳水化合物部分可以化學(xué)地或酶學(xué)地實現(xiàn)?；瘜W(xué)的脫糖基化可能涉及例如將actriib多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或相當(dāng)?shù)幕衔?。這種處理引起除了連接的糖(n-乙酰葡萄糖胺或n-乙酰半乳糖胺)之外大部分或所有的糖的裂解，而保留氨基酸序列完整?；瘜W(xué)的脫糖基化由hakimuddinetal.(1987)arch.biochem.biophys.259:52和edgeetal.(1981)anal.biochem.118:131進(jìn)一步描述了。actriib多肽上碳水化合物部分的酶裂解可以通過使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來實現(xiàn)，如thotakuraetal.(1987)meth.enzymol.138:350所描述的。actriib多肽的序列可以被調(diào)整，視情況，取決于使用的表達(dá)系統(tǒng)的類型，因為哺乳動物、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞可能都引入不同的糖基化模式，其可能受到肽的氨基酸序列的影響。一般地，用于人類的actriib蛋白將在提供適當(dāng)?shù)奶腔牟溉閯游锛?xì)胞系中表達(dá)，例如，hek293或cho細(xì)胞系，而其他表達(dá)系統(tǒng)，例如其他哺乳動物表達(dá)細(xì)胞系、具有工程化的糖基化酶的酵母細(xì)胞系以及昆蟲細(xì)胞預(yù)計也是有用的。

在具體的實施方式中，相對于actriib(r64)-fc形式，包含了提高actriib-fc融合蛋白的血清半衰期的進(jìn)一步的n-連接的糖基化位點(n-x-s/t)的突變的actriib多肽可以用于本文描述的方法和組合物中。在具體的實施方式中，在seqidno：16或seqidno：28的位置24處引入天冬酰胺(a24n)產(chǎn)生了賦予更長半衰期的nxt序列。其他nx(t/s)序列可以在42-44(nqs)和65-67(nss)中找到，而后者可能不不能用位置64的r有效地糖基化(即，在r64多肽中)。n-x-s/t序列一般可以引入到actriib的配體結(jié)合口袋之外的位置，其在上文中詳述了。對于引入非內(nèi)源的n-x-s/t序列特別適合的位點包括seqidno：16或seqidno：28的氨基酸20-29、20-24、22-25、109-134、120-134或129-134。n-x-s/t序列還可以導(dǎo)入到actriib序列與fc或其他融合部件之間的接頭中。因而，產(chǎn)生n-連接的糖基化位點的可取的改變是：a24n、r64n、s67n(可能與n65a改變組合)、e106n、r112n、g120n、e123n、p129n、a132n、r112s和r112t(所有氨基酸位置相應(yīng)于它們在seqidno：16或seqidno：28中的位置)。預(yù)計誒糖基化的任何s可以改變?yōu)閠，而不產(chǎn)生免疫原性位點，因為由糖基化提供了保護(hù)。同樣地，預(yù)計被糖基化的任何t可以改變?yōu)閟。因而，改變s67t和s44t被涵蓋在此。同樣地，在a24n變體中，可以使用s26t改變。因而，actriib多肽可以包括一個或更多個額外的、非內(nèi)源的n-連接的糖基化共有序列。

多種篩選分析可以用于評估actriib多肽變體。例如，可以篩選actriib多肽變體結(jié)合actriib配體，防止actriib配體與actriib多肽結(jié)合，或干擾由actriib配體引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。actriib多肽或其變體活性也可以在基于細(xì)胞的或體內(nèi)的分析中測試。

可以產(chǎn)生組合衍生的變體，其相對于天然發(fā)生的actriib多肽具有選擇的或一般提高的效價。同樣，誘變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)半衰期與相應(yīng)的野生型actriib多肽顯著不同的變體。例如，改變的蛋白可以變得對引起天然actriib多肽的破壞或滅活的蛋白水解降解或其他細(xì)胞代謝過程更穩(wěn)定或更不穩(wěn)定。這樣的變體和編碼它們的基因可以被利用通過調(diào)節(jié)actriib多肽的半衰期來改變actriib多肽水平。例如，短的半衰期可以產(chǎn)生更短暫的生物學(xué)效果，可以容許對象體內(nèi)重組actriib多肽水平的緊密的控制。在fc融合蛋白中，突變可以在接頭(如果有的話)和/或fc部分進(jìn)行，來改變蛋白質(zhì)的半衰期。

通過編碼多肽文庫的簡并基因文庫的方式可以產(chǎn)生組合文庫，所述多肽文庫各自包括可能的actriib多肽序列的至少一部分。例如，合成的寡核苷酸的混合物可以酶學(xué)連接到基因序列中，從而可能的actriib多肽核苷酸序列的簡并集合可以作為單獨的多肽表達(dá)，或作為選擇，作為更大的融合蛋白的集合(例如，用于噬菌體展示)。

有許多方法可以從簡并寡核苷酸序列中產(chǎn)生可能的同源物的文庫?？梢栽谧詣觗na合成儀中進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，合成的基因然后可以連接到適合的載體中用于表達(dá)。簡并寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，narang,sa(1983)tetrahedron39:3；itakuraetal.,(1981)recombinantdna,proc.3rdclevelandsympos.macromolecules,ed.agwalton,amsterdam:elsevierpp273-289；itakuraetal.,(1984)annu.rev.biochem.53:323；itakuraetal.,(1984)science198:1056；ikeetal.,(1983)nucleicacidres.11:477)。這樣的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于其他蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化(參見，例如，scottetal.,(1990)science249:386-390；robertsetal.,(1992)pnasusa89:2429-2433；devlinetal.,(1990)science249:404-406；cwirlaetal.,(1990)pnasusa87:6378-6382；以及美國專利nos.5,223,409、5,198,346和5,096,815)。

做為選擇，可以利用其他形式的誘變來產(chǎn)生組合文庫。例如，actriib多肽變體可以通過篩選來從文庫中產(chǎn)生和分離，利用，例如，丙氨酸掃描誘變等(rufetal.,(1994)biochemistry33:1565-1572；wangetal.,(1994)j.biol.chem.269:3095-3099；balintetal.,(1993)gene137:109-118；grodbergetal.,(1993)eur.j.biochem.218:597-601；nagashimaetal.,(1993)j.biol.chem.268:2888-2892；lowmanetal.,(1991)biochemistry30:10832-10838；和cunninghametal.,(1989)science244:1081-1085)，通過接頭掃描誘變(gustinetal.,(1993)virology193:653-660；brownetal.,(1992)mol.cellbiol.12:2644-2652；mcknightetal.,(1982)science232:316)；通過飽和誘變(meyersetal.,(1986)science232:613)；通過pcr誘變(leungetal.,(1989)methodcellmolbiol1:11-19)；或通過隨機誘變，包括化學(xué)誘變等(milleretal.,(1992)ashortcourseinbacterialgenetics,cshlpress,coldspringharbor,n.y.；和greeneretal.,(1994)strategiesinmolbiol7:32-34)。接頭掃描誘變，特別是在組合場景中，是鑒定actriib多肽的截短形式(生物活性)的吸引人的方法。

大量的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，用于篩選由點突變或截短產(chǎn)生的組合庫的基因產(chǎn)物，就此而言，用于篩選cdna庫中具有某些性質(zhì)的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)一般將適合于通過actriib多肽的組合誘變產(chǎn)生的基因庫的快速篩選。用于篩選大的基因文庫的最廣泛使用的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用產(chǎn)生的載體庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，并在一定條件下表達(dá)組合的基因，在所述條件中期望的活性的檢測便于相對容易地分離編碼被檢出產(chǎn)物的基因的載體。優(yōu)選的分析包括激活素結(jié)合分析和激活素介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析。

在某些實施方式中，本文描述的方法和組合物的抑制劑中使用的actriib多肽可以進(jìn)一步包含翻譯后修飾，除了天然存在于所述actriib多肽中的之外。這種的修飾可以包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和酰化。結(jié)果，修飾的actriib多肽可以含有非氨基酸元件，例如，聚乙二醇、脂質(zhì)、聚糖或單體和磷酸鹽。這種非氨基酸元件對actriib多肽的功能的影響可以通過熟練技術(shù)人員已知的任何方法來測試。當(dāng)通過裂解actriib多肽的新生形式來在細(xì)胞中產(chǎn)生actriib多肽時，翻譯后的加工對于蛋白質(zhì)的正確折疊和/或功能可能也是重要的。不同的細(xì)胞(例如cho、hela、mdck、293、w138、nih-3t3或hek293)具有這種翻譯后活性的特定細(xì)胞機制和特征性的機制，可以選擇來確保actriib多肽的正確修飾和加工。

在某些方面，actriib多肽的功能變體或修飾形式包括具有至少一部分actriib多肽和一個或更多個融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。這樣的融合結(jié)構(gòu)域的公知的實例包括但不限于，多組氨酸、glu-glu、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(gst)、硫氧還蛋白、蛋白a、蛋白g、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)或人血清白蛋白。可以選擇融合結(jié)構(gòu)域以賦予期望的性質(zhì)。例如，某些融合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕ㄟ^親和層析分離融合蛋白是特別有用的。對于親和純化來說，使用親和層析的相關(guān)基質(zhì)，例如，谷胱甘肽-、淀粉酶-和鎳-或鈷-軛合的樹脂。許多這樣的基質(zhì)是以“試劑盒”形式可獲得的，例如，對于(his6)融合配體有用的pharmaciagst純化系統(tǒng)，以及qiaexpresstm系統(tǒng)(qiagen)。作為另一個實例，可以選擇融合結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)actriib多肽的檢測。這樣的檢測結(jié)構(gòu)域的實例包括各種熒光蛋白(例如，gfp)，以及“表位標(biāo)簽”，其通常是有特異性抗體的短肽序列。特異性單克隆抗體容易獲得的公知的表位標(biāo)簽包括flag、流感病毒血凝素(ha)和c-myc標(biāo)簽。在某些情況下，融合結(jié)構(gòu)域具有蛋白酶裂解位點，例如，因子xa或凝血酶的，其容許相關(guān)蛋白酶部分地消化所述融合蛋白，從而由此釋放重組蛋白。釋放的蛋白質(zhì)然后可以通過隨后的層析分離從融合結(jié)構(gòu)域中分離。在某些優(yōu)選的實施方式中，actriib多肽與使所述actriib多肽在體內(nèi)穩(wěn)定化的結(jié)構(gòu)域融合(“穩(wěn)定物”結(jié)構(gòu)域)。“穩(wěn)定”是指提高血清半衰期的任何事，不論是由于降低的破壞、降低的腎臟清除、還是其他的藥物動力學(xué)效應(yīng)。已知與免疫球蛋白的fc部分融合為大范圍的蛋白質(zhì)賦予期望的藥物動力學(xué)性質(zhì)。同樣地，與人血清白蛋白融合可以賦予期望的性質(zhì)?？梢赃x擇的其他類型的融合結(jié)構(gòu)域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域(賦予其他生物學(xué)功能的，例如，進(jìn)一步刺激骨骼生長或肌肉生長，如所希望的)。

要理解的是融合蛋白的不同元件可以以與期望的功能一致的任何方式布置。例如，actriib多肽可以置于異源結(jié)構(gòu)域的c-末端，或做為選擇，異源結(jié)構(gòu)域可以置于actriib多肽的c-末端。actriib多肽結(jié)構(gòu)域和異源結(jié)構(gòu)域不必在融合蛋白中相鄰，其他的結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列可以被包括在任一結(jié)構(gòu)域的c-末端或n-末端，或兩個結(jié)構(gòu)域之間。

在某些實施方式中，本文描述的方法和組合物的抑制劑中使用的actriib多肽可以含有能夠穩(wěn)定化所述actriib多肽的一個或更多個修飾。例如，這樣的修飾可以增強actriib多肽的體外半衰期，增強actriib多肽的循環(huán)半衰期，或降低actriib多肽的蛋白水解酶降解。這樣的穩(wěn)定化修飾可以包括，但不限于，融合蛋白(包括，例如，包含actriib多肽和穩(wěn)定化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)、糖基化位點的修飾(包括，例如，向actriib多肽添加糖基化位點)，以及碳水化合物部分的修飾(包括，例如，從actriib多肽除去碳水化合物部分)。對于融合蛋白來說，actriib多肽融合到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，例如igg分子(例如，fc結(jié)構(gòu)域)。如本文使用的，術(shù)語“穩(wěn)定物結(jié)構(gòu)域”不僅是指融合蛋白情況下的融合結(jié)構(gòu)域(例如，fc)，還包括非蛋白性的修飾，例如，碳水化合物部分，或非蛋白性的聚合物，例如，聚乙二醇。

在某些實施方式中，本文描述的方法和組合物使用分離的或純化的actriib多肽，即，分離自或基本上沒有其他蛋白質(zhì)的actriib多肽可以用于本文描述的方法和組合物。一般將通過從重組核酸表達(dá)來產(chǎn)生actriib多肽。

在某些方面，本文描述的方法和組合物中使用的actriib多肽由分離的和/或重組的核酸編碼，包括本文公開的片段、功能變體和融合蛋白。例如，seqidno：19編碼天然發(fā)生的人actriib前體多肽。目標(biāo)核酸可以是單鏈的或是雙鏈的。這樣的核酸可以是dna或rna分子。這些核酸可以用于，例如，制造actriib多肽的方法，或作為直接的治療試劑(例如，在基因治療方法中)。

在某些方面，可以用生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽的核酸進(jìn)一步被理解為包括作為seqidno：19的變體的核酸，以及編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列的變體(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)。變體核苷酸序列包括差異在于一個或更多個核苷酸取代、添加或刪除的序列，例如，等位變體。

在某些實施方式中，可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽的分離的或重組的核酸序列是至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同于seqidno：19或編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，與seqidno：19或編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)互補的核酸序列，以及seqidno：19或編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)的變體可以用于本文描述的方法和組合物。在進(jìn)一步的實施方式中，所述核酸序列可以是分離的，重組和/或融合到異源核苷酸序列的，或是在dna文庫中。

在其他實施方式中，可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽的核酸包括在高度嚴(yán)格條件與seqidno：19中指定的核苷酸序列或編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)、seqidno：19的互補序列或編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)或其片段雜交的核苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，促進(jìn)dna雜交的合適的嚴(yán)格條件可以是變化的。例如，人們可以在6.0倍氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)、大約45℃下雜交，最后2.0倍ssc在50℃下洗滌。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自50℃下的約2.0倍ssc的低嚴(yán)格度，到50℃下約0.2倍ssc的高嚴(yán)格度。此外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫約22℃下的低嚴(yán)格條件，提高到大約65℃的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽度可以都變化，或者溫度或鹽濃度保持不變而另一個變量發(fā)生改變。在一個實施方式中，在6倍ssc室溫下的低嚴(yán)格條件下雜交、隨后在室溫下2倍ssc洗滌的核酸可以用于本文描述的方法和組合物。

由于遺傳密碼方面的簡并性而不同于seqidno：19中所列的核酸或編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)的分離的核酸也可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽。例如，許多氨基酸由超過一種三聯(lián)體指定。指定相同氨基酸的密碼子，或同義密碼子(例如，cau和cac對于組氨酸是同義的)可以產(chǎn)生“沉默”突變，其不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列。然而，預(yù)計的是，引起目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變的dna序列多態(tài)性將存在于哺乳動物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，編碼特定蛋白質(zhì)的核酸的一個或更多個核苷酸(達(dá)到核苷酸的約3-5％)中的這些變異由于天然的等位變異可以存在于給定物種的個體中。任何和所有的這類核苷酸變異和產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性可以用于本文描述的方法和組合物。

在某些實施方式中，可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽的重組核酸可以可操作連接到表達(dá)構(gòu)建體中的一個或更多個調(diào)節(jié)核苷酸序列。調(diào)節(jié)核苷酸序列一般將適合于用來表達(dá)的宿主細(xì)胞。許多類型的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和適合的調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域已知的，用于多種宿主細(xì)胞。一般地，所述一個或更多個調(diào)節(jié)核苷酸序列可以包括，但不限于，啟動子序列、前導(dǎo)區(qū)或信號序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，以及增強子或激活物序列。本領(lǐng)域已知的組成型或可誘導(dǎo)啟動子可以用于本文描述的方法和組合物。啟動子可以是天然發(fā)生的啟動子，或組合了超過一種啟動子的元件的雜合啟動子。表達(dá)構(gòu)建體可以存在于細(xì)胞中或游離體例如質(zhì)粒上，或者表達(dá)構(gòu)建體可以插入染色體中。在優(yōu)選的實施方式中，表達(dá)載體含有選擇性標(biāo)記基因以容許選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。選擇性標(biāo)記基因是本領(lǐng)域公知的，將隨使用的宿主細(xì)胞而變化。

在某些方面，可用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽的核酸可以在表達(dá)載體中提供，所述表達(dá)載體包含編碼actriib多肽的核苷酸序列并與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作連接。調(diào)節(jié)序列是公知的，被選擇來指導(dǎo)actriib多肽的表達(dá)。因而，術(shù)語調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強子和其他表達(dá)控制元件。示范性的調(diào)節(jié)序列在goeddel；geneexpressiontechnology:methodsinenzymology,academicpress,sandiego,calif.(1990)中描述。例如，控制與之可操作地連接的dna序列的表達(dá)的各種表達(dá)控制序列的任一種，可以用于這些載體來表達(dá)編碼actriib多肽的dna序列。這類有用的表達(dá)控制序列包括，例如，sv40的早期和晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒即時早期啟動子、rsv啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、tac或trc系統(tǒng)、其表達(dá)由t7rna聚合酶指導(dǎo)的t7啟動，噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)域，ft衣殼蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶例如pho5的啟動子、酵母.alpha.接合因子的啟動子、桿狀病毒系統(tǒng)的多面體啟動子，以及已知控制原核和真核細(xì)胞以及它們的病毒的基因表達(dá)的其他序列，以及它們的各種組合。要理解的是，表達(dá)載體的設(shè)計可以取決于這些因素，如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，和/或希望表達(dá)的蛋白質(zhì)的類型。此外，還應(yīng)當(dāng)考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力以及載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如抗生素標(biāo)志物。

重組核酸可以通過將克隆的基因或其部分連接到適合于在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞(酵母、禽類、昆蟲或哺乳動物)或兩者中表達(dá)的載體中來產(chǎn)生。用于重組actriib多肽的生產(chǎn)的表達(dá)載體包括質(zhì)粒和其他載體。例如，適合的載體包括質(zhì)粒類型：pbr322衍生的質(zhì)粒、pembl衍生的質(zhì)粒、pex衍生的質(zhì)粒、pbtac衍生的質(zhì)粒和puc-衍生的質(zhì)粒，用于在原核細(xì)胞例如e.coli中表達(dá)。

某些哺乳動物表達(dá)載體含有原核序列來促進(jìn)載體在細(xì)菌中的增殖，以及含有一種或更多種在真核細(xì)胞中表達(dá)的真核轉(zhuǎn)錄單位。pcdnai/amp、pcdnai/neo、prc/cmv、psv2gpt、psv2neo、psv2-dhfr、ptk2、prsvneo、pmsg、psvt7、pko-neo和phyg衍生的載體是適合于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的哺乳動物表達(dá)載體的實例。這些載體的一些被來自細(xì)菌質(zhì)粒例如pbr322表達(dá)序列修飾，來促進(jìn)在原核和真核細(xì)胞兩者中的復(fù)制和藥物抗性。做為選擇，病毒的衍生物，例如，牛乳頭狀瘤病毒(bpv-1)或epstein-barr病毒(phebo、prep-衍生的和p205)可以用于蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的短暫表達(dá)。其他病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)表達(dá)系統(tǒng)的實例可以在下文基因治療遞送系統(tǒng)的說明中找到。制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化宿主生物體所采用的各種方法是本領(lǐng)域公知的。對于原核和真核細(xì)胞都適合的其他表達(dá)系統(tǒng)，以及一般的重組過程，參見molecularcloningalaboratorymanual,3rded.,ed.bysambrook,fritschandmaniatis(coldspringharborlaboratorypress,2001)。在某些情況下，可能希望的是通過使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組多肽。這樣的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的實例包括pvl衍生的載體(例如，pvl1392、pvl1393和pvl941)、pacuw衍生的載體(例如pacuw1)和pbluebac-衍生的載體(例如含有.beta.-gal的pbluebaciii)。

在一個實施方式中，載體可以被設(shè)計用于在cho細(xì)胞中生產(chǎn)本文描述的方法和組合物中使用的actriib多肽，例如pcmv-script載體(stratagene,lajolla,calif.)、pcdna4載體(invitrogen,carlsbad,calif.)和pci-neo載體(promega,madison,wis.)。明顯的是，目標(biāo)基因構(gòu)建體可以用于引起目標(biāo)actriib多肽在培養(yǎng)物中增殖的細(xì)胞中表達(dá)，例如，來產(chǎn)生蛋白質(zhì)，包括融合蛋白或變體蛋白，用于純化。

用包括一種或更多種目標(biāo)actriib多肽的編碼序列(例如，seqidno：19或編碼可溶actriib多肽的那些核酸序列(例如，編碼seqidno：17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42和43的核酸)))的重組基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以用于生產(chǎn)適用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽。所述宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，本文提供的actriib多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞例如e.coli、昆蟲細(xì)胞(例如，使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

因而，本文提供的是生產(chǎn)用于本文描述的方法和組合物的actriib多肽的方法。例如，用編碼actriib多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)來容許發(fā)生actriib多肽的表達(dá)。從細(xì)胞與含有actriib多肽的培養(yǎng)基的混合物中，可以分泌和分離actriib多肽。做為選擇，actriib多肽可以細(xì)胞質(zhì)地或在膜部分中保持，收獲細(xì)胞、裂解并分離蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其他副產(chǎn)物。用于細(xì)胞培養(yǎng)的適合的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域公知的。利用本領(lǐng)域已知的用于純化蛋白質(zhì)的技術(shù)，可以從細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)、宿主細(xì)胞或兩者分離目標(biāo)actriib多肽，包括離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳、使用特異于actriib多肽的特定表位的抗體的免疫親和純化、以及使用結(jié)合與actriib多肽融合的結(jié)構(gòu)域的試劑的親和純化(例如，蛋白a柱可以用于純化actriib-fc融合物)。在優(yōu)選的實施方式中，actriib多肽是含有便于其純化的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，純化通過一系列柱層析步驟來實現(xiàn)，包括，例如，三種或更多種以下的，按任何順序：蛋白a層析、q瓊脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、空間排阻層析和陽離子交換層析。純化可以用病毒過濾和緩沖液交換來完成。如本文表明的，actriib-hfc蛋白可以純化到通過空間排阻層折測定的>98％的純度，和通過sds-page測定的>95％的純度。這一水平的純度足以在小鼠中對骨骼實現(xiàn)期望的效果，以及在小鼠、大鼠和非人靈長類中實現(xiàn)可接受的安全分布。

在另一個實施方式中，編碼位于重組actriia多肽的期望部分的n-末端的純化前導(dǎo)序列例如聚-(his)/腸激酶裂解位點序列的融合基因可以容許表達(dá)的融合蛋白通過利用ni2+金屬樹脂的親和層析來純化。純化前導(dǎo)序列然后通過用腸激酶處理來除去，以提供純化的actriib多肽(例如，參見hochulietal.,(1987)j.chromatography411:177；和janknechtetal.,pnasusa88:8972)。

制造融合物基因的技術(shù)是公知的?；旧?，根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行編碼不同多肽序列的各種dna片段的連接，采用鈍末端的或交錯末端的末端用于連接，限制酶消化來提供適當(dāng)?shù)哪┒?，視情況填充粘末端，堿性磷酸酶處理來避免不希望的連接，以及酶連接。在另一個實施方式中，融合基因可以通過常規(guī)技術(shù)，包括自動的dna合成儀來合成。做為選擇，可以使用錨引物來進(jìn)行基因片段的pcr擴增，所述錨引物產(chǎn)生兩個連續(xù)基因片段之間的互補的突出，其隨后可以退火來產(chǎn)生嵌合基因序列(參見，例如currentprotocolsinmolecularbiology,eds.ausubeletal.,johnwiley&sons:1992)。

actriib-fc融合蛋白可以從paid4載體(sv40ori/增強子，cmv啟動子)在穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的cho-dukxbl1細(xì)胞中表達(dá)，使用seqidno：8的組織血纖蛋白溶酶原前導(dǎo)序列。fc部分可以包含人igg1fc序列，如seqidno：7所示。在某些實施方式中，在表達(dá)時，平均起來，所含的蛋白質(zhì)具有每分子的actriib-fc融合蛋白約1.5到2.5摩爾的唾液酸。

在某些實施方式中，actriib-fc融合物的長血清半衰期可以是在人類對象中25-32天。另外，相比在人293細(xì)胞中表達(dá)的actriib-hfc融合蛋白所報告的，cho細(xì)胞表達(dá)的材料可以具有更高的對激活素b配體的親和力(delreetal.,jbiolchem.2004dec17；279(51):53126-35)。另外，不受理論的限制，使用比其他前導(dǎo)序列提供更高生產(chǎn)的tpa前導(dǎo)序列，不同于用天然前導(dǎo)區(qū)表達(dá)的actriib-fc，可以提供高純度的n-末端序列。使用天然前導(dǎo)序列可能產(chǎn)生兩種主要種類的actriib-fc，各自具有不同的n-末端序列。

8.5.3其他actrii受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑

在某些實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是核酸化合物。

抑制actrii受體的核酸化合物的類別的實例包括反義核酸、sirna或rnai構(gòu)建體以及催化性核酸構(gòu)建體。核酸化合物可以是單鏈的或雙鏈的。雙鏈的化合物還可以包括突出的或非互補的區(qū)域，其中鏈的一條或另一條是單鏈的。單鏈的化合物可以包括自我互補的區(qū)域，意味著所述化合物可以形成所謂的“發(fā)夾”或“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)，帶有雙螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域。

在某些實施方式中，抑制actrii受體的核酸化合物可以包含與一區(qū)域互補的核苷酸序列，所述區(qū)域由全長actrii受體核酸序列或激活素核酸序列(例如，激活素a或激活素b亞基，也稱為βa或βb的核酸序列)的不超過1000個、不超過500個、不超過250個、不超過100個或不超過50、35、30、25、22、20或18個核苷酸組成。在具體的實施方式中，互補的區(qū)域?qū)⑹侵辽?個核苷酸，任選地至少10個或至少15個核苷酸，任選地在15到25個核苷酸之間?；パa的區(qū)域可以落入內(nèi)含子、目標(biāo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的編碼序列或非編碼序列，例如編碼序列部分。一般地，抑制actrii受體的核酸化合物將具有約8個到約500個核苷酸或堿基對的長度，任選地所述長度是約14個到約50個核苷酸。抑制actrii受體的核酸化合物可以是dna(特別是作為反義使用的)、rna或rna：dna雜交物。任一條鏈可以包括dna和rna的混合物，以及不容易被分類為dna或rna的修飾形式。同樣地，雙鏈的核酸化合物可以是dna:dna、dna:rna或rna:rna，任一條鏈還可以包括dna和rna的混合物，以及不容易被分類為dna或rna的修飾形式。

抑制actrii受體的核酸化合物可以包括各種修飾的任一種，包括對主干(天然核酸中的糖-磷酸部分，包括核苷酸間連鍵)或堿基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一個或多個修飾。在某些實施方式中，反義核酸化合物將具有約15個到約30個核苷酸的長度，通常將含有一個或更多個修飾來改善某些特性，例如，血清中的穩(wěn)定性、細(xì)胞中的穩(wěn)定性、化合物可能被遞送的部位中的穩(wěn)定性，例如，就口服遞送來說是胃部，以及對于吸入的化合物來說是肺部。對于rnai構(gòu)建體來說，與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的鏈一般將是rna或其修飾體。其他的鏈可以是rna、dna或任何其他的變異體。在某些實施方式中，雙鏈的或單鏈的“發(fā)夾”rnai構(gòu)建體的雙螺旋部分可以具有18到40個核苷酸的長度，任選地約21到23個核苷酸長度，只要它起到dicer底物的作用。催化性或酶性核酸可以是核酶或dna每，也可以含有修飾的形式。在某些實施方式中，在生理條件下以及在無義或正義對照很少作用或沒有作用的濃度下，抑制actrii受體的核酸化合物可以抑制它的目標(biāo)的表達(dá)達(dá)到約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多，測試核酸化合物的作用的濃度包括1、5、10微摩爾，或更高。

在其他實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是抗體。這樣的抗體包括結(jié)合激活素(特別是激活素a或b亞基，也稱為βa或βb)并破壞actrii受體結(jié)合的抗體；以及結(jié)合actrii受體多肽(例如，可溶的actriia或可溶的actriib多肽)并破壞激活素結(jié)合的抗體。

通過使用衍生自actrii受體多肽或激活素多肽的免疫原，抗蛋白質(zhì)/抗肽的抗血清或單克隆抗體可以通過標(biāo)準(zhǔn)方案產(chǎn)生(參見，例如，antibodies:alaboratorymanualed.byharlowandlane(coldspringharborpress:1988))。哺乳動物，例如，小鼠、倉鼠或家兔可以用actrii受體多肽的免疫原性形式、能夠引發(fā)抗體反應(yīng)的抗原性片段或融合蛋白來免疫。對蛋白質(zhì)或肽賦予免疫原性的技術(shù)包括結(jié)合到載體，或本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)。actrii受體或激活素多肽的免疫原性部分可以在存在佐劑的情況下施用。免疫的進(jìn)展可以通過檢測血漿或血清中的抗體滴度來監(jiān)視。標(biāo)準(zhǔn)的elisa或其他免疫分析可以使用免疫原作為抗原來評估抗體的水平。

在用actrii受體多肽的抗原性制品免疫動物之后，可以獲得抗血清，如果希望，可以從血清分離多克隆抗體。為了產(chǎn)生單克隆抗體，抗體生產(chǎn)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)可以從免疫的動物中收獲，通過標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合過程與永生化細(xì)胞如骨髓瘤細(xì)胞融合來產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，包括，例如，雜交瘤技術(shù)(由kohlerandmilstein,(1975)nature,256:495-497最早開發(fā))、人b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbaretal.,(1983)immunologytoday,4:72)以及ebv雜交瘤技術(shù)來生產(chǎn)人單克隆抗體(coleetal.,(1985)monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.pp.77-96)?？梢悦庖呋瘜W(xué)地篩選雜交瘤細(xì)胞中與actrii受體多肽特異性反應(yīng)的抗體生產(chǎn)，從包含這樣的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離單克隆抗體。

如本文使用的術(shù)語“抗體”意圖包括也特異性地與目標(biāo)多肽反應(yīng)的抗體的片段。抗體可以使用常規(guī)技術(shù)片段化，按上文對完整抗體描述的相同的方式為了實用性篩選片段。例如，f(ab)2片段可以通過用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生。產(chǎn)生的f(ab)2片段可以進(jìn)行處理來還原二硫鍵，產(chǎn)生fab片段。抗體進(jìn)一步意圖包括雙特異性的、單鏈的、嵌合的、人源化的和完全的人分子，其具有由抗體的至少一個cdr區(qū)賦予的對actrii受體或激活素多肽的親和力?？贵w可以進(jìn)一步包含附著于其上并能被檢測的標(biāo)簽(例如，所述標(biāo)簽可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔助因子)。

在某些實施方式中，抗體是重組抗體，該術(shù)語涵蓋部分通過分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的任何抗體，包括cdr移植的或嵌合的抗體、從文庫選擇的抗體結(jié)構(gòu)域中組裝的人抗體或其他抗體、單鏈抗體和單結(jié)構(gòu)域抗體(例如，人vh蛋白或駱駝化的vhh蛋白)。在某些實施方式中，抗體可以是單克隆抗體，以及在某些實施方式中。例如，產(chǎn)生特異性結(jié)合actrii受體多肽或激活素多肽的單克隆抗體的方法可以包括，向小鼠施用一定數(shù)量的包含有效刺激可檢測免疫應(yīng)答的抗原多肽的免疫原性組合物，從小鼠獲得抗體生產(chǎn)細(xì)胞(例如，來自脾臟的細(xì)胞)，將所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合來獲得抗體生產(chǎn)雜交瘤，以及測試所述抗體生產(chǎn)雜交瘤來鑒定產(chǎn)生特異性結(jié)合所述抗原的單克隆抗體的雜交瘤。一旦獲得雜交瘤，雜交瘤可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖，任選地在雜交瘤衍生的細(xì)胞產(chǎn)生特異性結(jié)合抗原的單克隆抗體的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。單克隆抗體可以從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化。

提及抗體時使用的形容詞“特異性反應(yīng)”意圖是指，如本領(lǐng)域一般理解的，在目標(biāo)抗原(例如，actrii受體多肽)和非目標(biāo)的其他抗原之間所述抗體是足夠有選擇性的，使得所述抗體至少在檢測特定類型的生物樣品中目標(biāo)抗原的存在方面是有用的。在采用抗體的某些方法例如治療應(yīng)用中，更高程度的結(jié)合特異性是希望的。單克隆抗體一般具有更高的傾向(相比多克隆抗體)來有效地區(qū)分期望的抗原和交叉反應(yīng)的多肽。影響抗體:抗原相互作用的特異性的一個特征是抗體對抗原的親和力。雖然可以在大范圍的不同親和力下實現(xiàn)期望的特異性，一般地優(yōu)選的抗體將具有約10^-6、10^-7、10^-8、10^-9或更低的親和力(解離常數(shù))?？紤]到激活素與actrii受體之間非常緊密的結(jié)合，預(yù)計的是中和性抗激活素或抗actrii受體抗體一般應(yīng)具有10^-10或更低的解離常數(shù)。

此外，用于篩選抗體來鑒定期望的抗體的技術(shù)可能影響所獲得的抗體的性質(zhì)。例如，如果抗體用于結(jié)合溶液中的抗原，可能希望的是測試溶液結(jié)合。多種不同的技術(shù)可以用于測試抗體與抗原之間的相互作用來鑒定特別希望的抗體。這樣的技術(shù)包括elisa、表面胞質(zhì)團(tuán)共振結(jié)合分析(例如，biacore.tm.結(jié)合分析，biacoreab，uppsala，sweden)、夾心分析(例如，igeninternationalinc.的順磁性的珠子系統(tǒng)，gaithersburg，md.)、western印跡、免疫沉淀分析和免疫組織化學(xué)。

在某些實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包括可選擇形式的激活素，特別是在i型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有改變、可以結(jié)合ii型受體并且不能形成活性的三元復(fù)合物的那些。在某些實施方式中，抑制激活素a、b、c或e或特別是actrii受體表達(dá)的核酸，例如，反義分子、sirna或核酶，可以用于本文描述的組合物和方法中。在某些實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑展現(xiàn)了相比抑制tnf-beta家族的其他成員、抑制gdf11介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的選擇性，特別是對于gdf8和激活素。

在其他實施方式中，本文描述的組合物和方法中使用的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是具有actrii受體拮抗劑活性的非抗體蛋白，包括抑制素(即，抑制素alpha亞基)、卵泡抑素(例如，卵泡抑素-288和卵泡抑素-315)、cerberus、卵泡抑素相關(guān)蛋白(“fsrp”)、內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)、激活素c、alpha(2)-巨球蛋白和m108a(位置108處甲硫氨酸到丙氨酸的改變)突變的激活素a。

在具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是拮抗激活素生物活性和/或結(jié)合激活素的卵泡抑素多肽。術(shù)語“卵泡抑素多肽”包括這些多肽，其包含卵泡抑素的任何天然發(fā)生的多肽以及保持了有用活性的其任何變體(包括突變體、片段、融合物和肽模擬物形式)，進(jìn)一步包括卵泡抑素的任何功能單體或多聚體。保持了激活素結(jié)合性質(zhì)的卵泡抑素多肽變體可以根據(jù)涉及卵泡抑素和激活素相互作用的早先的研究來鑒定。例如，wo2008/030367公開了顯示對激活素結(jié)合重要的特定的卵泡抑素結(jié)構(gòu)域(“fsds”)，通過全部引用將其合并在本文中。卵泡抑素多肽包括一些多肽，其衍生自任何已知的卵泡抑素的序列、具有至少約80％相同于卵泡抑素多肽的序列的序列，任選地至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。卵泡抑素多肽的實例包括成熟的卵泡抑素多肽或較短的同種型或人卵泡抑素前體多肽的其他變體，例如，在wo2005/025601中描述的，通過全部引用將其合并在本文中。

在具體的實施方式中，用于本文描述的組合物和方法的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是拮抗激活素生物活性和/或結(jié)合激活素的卵泡抑素-樣相關(guān)基因(flrg)。術(shù)語“flrg多肽”包括這些多肽，其包含flrg的任何天然發(fā)生的多肽以及保持了有用活性的其任何變體(包括突變體、片段、融合物和肽模擬物形式)保持了激活素結(jié)合性質(zhì)的flrg多肽變體可以使用分析flrg和激活素相互作用的常規(guī)方法來鑒定。參見，例如，美國專利no.6,537,966，通過全部引用將其包括在本文中。flrg多肽包括一些多肽，其衍生自任何已知的flrg的序列、具有至少約80％相同于flrg多肽的序列的序列，任選地至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

在某些實施方式中，卵泡抑素多肽和flrg多肽的功能變體或修飾形式包括具有卵泡抑素多肽或flrg多肽的至少一部分以及一個或更多個融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述融合結(jié)構(gòu)域例如，促進(jìn)多肽的分離檢測或穩(wěn)定化或多聚化的結(jié)構(gòu)域。上文參考actriia和actriib多肽詳細(xì)地討論了適合的融合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的卵泡抑素多肽的激活素結(jié)合部分的融合蛋白。在另一個實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的flrg多肽的激活素結(jié)合部分的融合蛋白。

8.6分析

各種actrii多肽變體或可溶的actrii多肽變體，可以測試它們抑制actrii的能力。此外，化合物可以測試它們抑制actrii的能力。一旦確認(rèn)了actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑活性，這些化合物可以用于本文提供的方法。actrii可以是actriia或actriib。以下對actriia描述的分析也可以類似地對actriib進(jìn)行。

8.6.1評估snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平和/或活性

snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性可以通過本領(lǐng)域已知的或本文描述的任何方法來測定。例如，組織樣品中snai1、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平可以利用例如northern印跡、pcr分析、實時pcr分析或本領(lǐng)域已知的或本文描述的任何其他技術(shù)，通過評估(例如，定量)樣品中snai1、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素、runx2、osterix、alp、bsap、ctx、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的轉(zhuǎn)錄的rna來測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2、sm22-alpha、phosphosmad3和尿蛋白的一種或更多種的水平和/或活性可以與相應(yīng)參考群體中的水平和/或活性分別地和獨立地比較，例如，如上文在章節(jié)8.3.1中描述的。在一個實施方式中，組織樣品中snai1、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平可以分別通過評估(例如，定量)樣品中snai1、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的mrna來測定。在具體的實施方式中，snai1、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的mrna水平通過定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)來測定。在具體的實施方式中，runx2mrna的核酸序列包含seqidno：58的核酸序列。在具體的實施方式中，alpmrna的核酸序列包含seqidno：59的核酸序列。在具體的實施方式中，snai1mrna的核酸序列包含seqidno：74的核酸序列。在具體的實施方式中，dkk1mrna的核酸序列包含seqidno：75的核酸序列。在具體的實施方式中，col1a1mrna的核酸序列包含seqidno：76的核酸序列。在具體的實施方式中，激活素mrna的核酸序列包含seqidno：77的核酸序列。在具體的實施方式中，osterix的核酸序列包含seqidno：60的核酸序列。在具體的實施方式中，klotho的核酸序列包含seqidno：61的核酸序列。在具體的實施方式中，alpha-smamrna的核酸序列包含seqidno：70的核酸序列。在具體的實施方式中，myocdmrna的核酸序列包含seqidno：71的核酸序列。在具體的實施方式中，sm22-alphamrna的核酸序列包含seqidno：62的核酸序列。在具體的實施方式中，使用runx2特異性引物(seqidno：48和49)進(jìn)行qrt-pcr來測定runx2水平。在具體的實施方式中，使用alp特異性引物(seqidno：50和51)進(jìn)行qrt-pcr來測定alp水平。在具體的實施方式中，使用snai1特異性引物(seqidno：78和79)進(jìn)行qrt-pcr來測定snai1水平。在具體的實施方式中，使用dkk1特異性引物(seqidno：80和81)進(jìn)行qrt-pcr來測定dkk1水平。在具體的實施方式中，使用col1a1特異性引物(seqidno：82和83)進(jìn)行qrt-pcr來測定col1a1水平。在具體的實施方式中，使用激活素特異性引物(seqidno：84和85)進(jìn)行qrt-pcr來測定激活素水平。在具體的實施方式中，使用osterix特異性引物(seqidno：52和53)進(jìn)行qrt-pcr來測定osterix水平。在具體的實施方式中，使用klotho特異性引物(seqidno：54和55)進(jìn)行qrt-pcr來測定klotho水平。在具體的實施方式中，使用sm22-alpha特異性引物(seqidno：56和57)進(jìn)行qrt-pcr來測定sm22-alpha水平。

組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平也可以利用例如免疫組織化學(xué)分析、western印跡、elisa、免疫沉淀、流式細(xì)胞計分析或本領(lǐng)域已知的或本文描述的任何其他技術(shù)通過分別評估(例如，定量)樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的蛋白表達(dá)水平來測定。在具體的實施方式中，runx2蛋白的氨基酸序列包含seqidno：63的氨基酸序列。在具體的實施方式中，alp蛋白的氨基酸序列包含seqidno：64的氨基酸序列。在具體的實施方式中，snai1蛋白的氨基酸序列包含seqidno：86的氨基酸序列。在具體的實施方式中，dkk1蛋白的氨基酸序列包含seqidno：87的氨基酸序列。在具體的實施方式中，col1a1蛋白的氨基酸序列包含seqidno：88的氨基酸序列。在具體的實施方式中，激活素(例如，游離激活素)蛋白的氨基酸序列包含seqidno：89的氨基酸序列。在具體的實施方式中，bsap蛋白的氨基酸序列包含seqidno：72的氨基酸序列。在具體的實施方式中，osterix蛋白的氨基酸序列包含seqidno：65的氨基酸序列。在具體的實施方式中，klotho蛋白的氨基酸序列包含seqidno：66的氨基酸序列。在具體的實施方式中，alpha-sma蛋白的氨基酸序列包含seqidno：68的氨基酸序列。在具體的實施方式中，myocd的氨基酸序列包含seqidno：69的氨基酸序列。在具體的實施方式中，sm22-alpha蛋白的氨基酸序列包含seqidno：67的氨基酸序列。在具體的實施方式中，actriia蛋白的氨基酸序列包含seqidno：1的氨基酸序列。在具體的實施方式中，actriia蛋白的氨基酸序列包含seqidno：2的氨基酸序列。在具體的實施方式中，actriia蛋白的氨基酸序列包含seqidno：3的氨基酸序列。在具體的實施方式中，actriia蛋白的氨基酸序列包含seqidno：4的氨基酸序列。在具體的實施方式中，actriia蛋白的氨基酸序列包含seqidno：5的氨基酸序列。在具體的實施方式中，axin2蛋白的氨基酸序列包含seqidno：87的氨基酸序列。在特定的實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性通過western印跡來測定。在特定的實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的活性通過snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2或sm22-alpha所調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的western印跡分析來測定。在特定的實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平通過能夠分別定量對象的組織樣品中(例如，人血清中)存在的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的數(shù)量的方法，和/或能夠分別檢測在用actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療之后snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平的矯正的方法來測定。在一個實施方式中，組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平通過利用elisa分別評估(例如，定量)樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的蛋白質(zhì)表達(dá)來測定。例如，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha可以利用elisa方法在人血清中鑒定和定量。用于測定組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平的elisa方法可以包括用組織樣品(例如，人血清)包被elisa平板，并分別檢測所述組織樣品(例如，人血清)中分別結(jié)合snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha特異性抗體的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha。在某些實施方式中，如本文描述的用于測定snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性的方法(例如，elisa)能夠檢測100pg/ml起的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha。在具體的實施方式中，用runx2特異性抗體sc-390715(santacruz)進(jìn)行elisa來測定runx2水平。在具體的實施方式中，用alp特異性抗體sc-98652(santacruz)進(jìn)行elisa來測定alp水平。在具體的實施方式中，用snai1特異性抗體sc-393172(santacruz)進(jìn)行elisa來測定snai1水平。在具體的實施方式中，用phosphosmad2特異性抗體sc-101801(santacruz)進(jìn)行elisa來測定phosphosmad2水平。在具體的實施方式中，用phosphosmad3特異性抗體sc-130218(santacruz)進(jìn)行elisa來測定phosphosmad2水平。在具體的實施方式中，用dkk1特異性抗體sc-374574(santacruz)進(jìn)行elisa來測定dkk1水平。在具體的實施方式中，用col1a1特異性抗體sc-8784(santacruz)進(jìn)行elisa來測定col1a1水平。在具體的實施方式中，用激活素特異性抗體a1594(sigmaaldrich)進(jìn)行elisa來測定激活素(例如，游離激活素)水平。在具體的實施方式中，用bsap特異性抗體sc-98652(santacruz)進(jìn)行elisa來測定ctx水平。在具體的實施方式中，用ctx特異性抗體abin1173415(antibodiesonline)進(jìn)行elisa來測定ctx水平。在具體的實施方式中，用osterix特異性抗體sc-22538(santacruz)進(jìn)行elisa來測定osterix水平。在具體的實施方式中，用klotho特異性抗體sc-22218(santacruz)進(jìn)行elisa來測定klotho水平。在具體的實施方式中，用alpha-sma特異性抗體sc-53142(santacruz)進(jìn)行elisa來測定alpha-sma水平。在具體的實施方式中，用myocd特異性抗體sc-21561(santacruz)進(jìn)行elisa來測定myocd水平。在具體的實施方式中，用sm22-alpha特異性抗體sc-271719(santacruz)進(jìn)行elisa來測定sm22-alpha水平。在具體的實施方式中，用actriia特異性抗體ab135634(abcam)進(jìn)行elisa來測定actriia水平。

本文描述的elisa分子中描述的runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2、sm22-alpha、phosphosmad3和尿蛋白的一種或更多種的水平可以與相應(yīng)的參考群體中的水平和/或活性獨立地和分別地比較，如上文在章節(jié)8.3.1中描述的。

在測量樣品中(例如，組織樣品中，例如，主動脈、血液、血清、血漿、肝臟、脾臟和/或骨髓的樣品)snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平的分析中使用的抗體是本領(lǐng)域已知的，或可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的途徑容易地開發(fā)?？梢杂糜跍y量樣品中runx2水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-b4293、ls-b4294、ls-b4296的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-390715的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:wh0000860m1的抗體?？梢杂糜跍y量樣品中alp水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-b2877、ls-b1844、ls-c169212的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-98652的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:sab1405449的抗體?？梢杂糜跍y量樣品中snai1水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-c161335、ls-c198229和ls-c169298的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-393172的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:sab1404386的抗體?？捎糜跍y量樣品中phosphosmad2水平的分析中的抗體的實例包括來自santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca、目錄編號sc-101801的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:sab4200251和sab4300252的抗體。可用于測量樣品中phosphosmad3水平的分析中的抗體的實例包括來自santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca、目錄編號sc-130218的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:sab4300253和sab4504210的抗體。可以用于測量樣品中dkk1水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-c108793、ls-c105116和ls-c105117的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-374574的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:wh0022943m1的抗體?？捎糜跍y量樣品中col1a1水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-b5932的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-8784的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:c2456的抗體。可用于測量樣品中激活素(例如，游離激活素)水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-c308491抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:a1719的抗體?？梢杂糜跍y量樣品中bsap水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-b2877、ls-b1844和ls-c169212的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-98652的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:sab1405449的抗體?？捎糜跍y量樣品中ctx水平的分析中的單克隆抗體的實例包括abin1173415(antibodiesonline)?？梢杂糜跍y量樣品中osterix水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-c139215、ls-c132610、ls-b6531的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-133871的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:wh0121340m1的抗體?？梢杂糜跍y量樣品中klotho水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-c165587、ls-c145689、ls-c8376的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-22218的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:sab1306662的抗體?？捎糜跍y量樣品中alpha-sma水平的分析中的抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-b6000、ls-b5966、ls-b2161的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-21561的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼：a5228的抗體?？捎糜跍y量樣品中myocd水平的分析中的抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-c37407、ls-c153495、ls-c137255的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-53142的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼：m8948的抗體?？梢杂糜跍y量樣品中sm22-alpha水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自lifespanbiosciencesinc.,seattle,wa、目錄編號ls-b2563、ls-c139114、ls-c210979的抗體；可從santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca獲得的、目錄編號sc-271719的抗體；以及可從sigma-aldrichco.llc獲得的、產(chǎn)品號碼:sab2501014的抗體?？捎糜跍y量樣品中actriia水平的分析中的單克隆抗體的實例包括來自abcam、產(chǎn)品碼ab135634的抗體。

snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的活性可以通過本領(lǐng)域已知的任何分析來測量，非限制性地包括報告基因分析(例如，分別含有snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2或sm22-alpha響應(yīng)報告基因構(gòu)建體)，或任何其他生物活性分析。

snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性可以在獲自根據(jù)本文描述的方法治療的對象的任何組織樣品中分析。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平和/或活性在獲自根據(jù)本文描述的方法治療的對象的主動脈、血清、肝臟、脾臟或骨髓的樣品中評估。在一個實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平和/或活性在獲自根據(jù)本文描述的方法治療的對象的血清的樣品中評估。在另一個實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平和/或活性在獲自根據(jù)本文描述的方法治療的對象的主動脈、脾臟的樣品中評估。在一個實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha水平和/或活性在獲自根據(jù)本文描述的方法治療的對象的骨髓的樣品中評估。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，利用本領(lǐng)域已知的和本文描述的分析測定的runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2、sm22-alpha、phosphosmad3和尿蛋白的一種或更多種的活性可以分別與相應(yīng)參考群體中的水平和/或活性來比較，例如，如上文在章節(jié)8.3.1中描述的。

在某些實施方式中，對象的組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別與如章節(jié)8.6中描述的參考群體的組織樣品中(例如，來自相同組織的樣品中)snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性比較。在某些實施方式中，對象的組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別與較早時間點(例如，疾病發(fā)作之前、治療開始之前或在治療期間)時對象的組織樣品中(例如，來自相同組織的樣品中)snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性比較。在某些實施方式中，對象的組織樣品(例如，主動脈、血清、脾臟、肝臟或血液骨髓)中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別與對象的其他組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性比較。在某些實施方式中，對象的組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性與對象的組織樣品中其他基因產(chǎn)物(例如，b-肌動蛋白、激活素a、激活素b)的水平和/或活性比較。

在某些實施方式中，對象的組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別與參考群體的組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性比較。在某些實施方式中，分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性相比、snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的升高的水平和/或活性的檢出，繼之以施用激活素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如本文描述的一種或更多種激活素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑)。在某些實施方式中，施用激活素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如本文描述的一種或更多種激活素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑)繼之以監(jiān)視snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性，任選地，將所述snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別與參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性比較。在某些實施方式中，施用第一劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如，actriia-hfc如seqidno：7)，繼之以測定snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性，如果snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性分別相比參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性升高，和/或如果klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別相比參考群體中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性降低，施用比所述第一劑量更高(例如，1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10倍高)的第二劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，如果snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性分別相比參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性降低，和/或如果klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別相比參考群體中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性升高，施用比所述第一劑量更低(例如，1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10倍低)的第二劑量的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在某些實施方式中，所述參考群體是章節(jié)8.6中描述的群體。

在某些實施方式中，治療的對象的組織樣品中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性分別與來自一個或更多個健康對象的相同組織的樣品中的snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性比較。在某些實施方式中，評估snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性的組織是主動脈、血清、骨髓、肝臟或脾臟。在一個實施方式中，評估snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性的組織是血清。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的升高的水平和/或活性分別高于參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％；和/或klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的降低的水平分別低于參考群體中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％。在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的升高的水平和/或活性分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％高于參考群體的前10％、前5％、前4％、前3％、前2％或前1％中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性；和/或klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的降低的水平分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％低于參考群體的后10％、后5％、后4％、后3％、后2％或后1％中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性。在某些實施方式中，所述參考群體是如章節(jié)8.6中描述的。

在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的升高的水平和/或活性分別是約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％大于參考群體中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性；和/或snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的降低的水平和/或活性分別是約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％低于參考群體中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性。在某些實施方式中，klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的升高的水平和/或活性分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、200％或500％高于參考群體的前10％、前5％、前4％、前3％、前2％或前1％中klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性；和/或snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的降低的水平和/或活性分別等于或約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％低于參考群體的后10％、后5％、后4％、后3％、后2％或后1％中snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的水平和/或活性。在某些實施方式中，所述參考群體是如章節(jié)8.6中描述的。

在某些實施方式中，激活素的水平是游離激活素的水平，例如，不與如卵泡抑素、卵泡抑素樣3或抑制素締合的激活素。游離激活素的水平可以通過例如(i)定量樣品中，例如血漿中激活素的濃度；(ii)定量樣品中與激活素締合的蛋白質(zhì)，例如卵泡抑素、卵泡抑素樣3和抑制素的濃度；和(iii)計算激活素濃度與激活素締合蛋白的濃度的化學(xué)計量比來確定。

本文描述的分析還可以用于測定其他的蛋白質(zhì)和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平和/或活性，例如，fgf23、卵泡抑素、卵泡抑素樣3、抑制素、涉及內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

在某些實施方式中，snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha的水平和/或活性是組織(例如，組織樣品)中的。在某些實施方式中，所述組織是主動脈。在某些實施方式中，所述組織是腎臟。在某些實施方式中，所述組織是骨骼。在某些實施方式中，所述組織是血清。在優(yōu)選的實施方式中，runx2、dkk1、alp、osterix、sm22-alpha、klotho、alpha-sma、actriia、axin2和myocd水平和/或活性是在主動脈中的。在優(yōu)選的實施方式中，phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、actriia、axin2和col1a1的水平和/或活性是在腎臟中的。在優(yōu)選的實施方式中，所述激活素水平和/或活性是在血清中的。在某些實施方式中，所述升高的激活素水平是在管周肌成纖維細(xì)胞中的。在某些實施方式中，所述升高的激活素水平不是在腎臟上皮中的。在某些實施方式中，所述升高的激活素水平是在管周肌成纖維細(xì)胞中的，并且所述升高的激活素水平不是在腎臟上皮中的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2、sm22-alpha、phosphosmad3和尿蛋白的一種或更多種的水平和/或活性可以與相應(yīng)參考群體中的水平和/或活性分別地和獨立地比較，例如，如上文在章節(jié)8.3.1中描述的。

8.6.2參考群體

在某些實施方式中，利用獲自本文描述的參考群體的數(shù)據(jù)(例如，生物標(biāo)記物水平或臨床癥狀)來確定從根據(jù)本文提供的方法治療的或要治療的對象獲得的類似數(shù)據(jù)是病理學(xué)上高的(例如，提高的)還是低的(例如，降低的)。

在某些實施方式中，參考群體的大小可以是1、5、10、25、50、75、100、200、250、300、400、500或1000個個體。在某些實施方式中，所述參考群體由隨機的志愿者組成。在某些實施方式中，所述參考群體由健康人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由與章節(jié)8.4中描述的患者群體相同年齡、體重和/或性別的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有心血管疾病的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有血管鈣化的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有心血管疾病的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有腎病的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有慢性腎病的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有動脈硬化水平病理性升高的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有l(wèi)vh的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由沒有與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾病的人組成。

在某些實施方式中，所述參考群體是指在心血管疾病的一種或更多種癥狀發(fā)作之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在血管鈣化的一種或更多種癥狀發(fā)作之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在慢性腎病的一種或更多種癥狀發(fā)作之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在動脈硬化水平升高的一種或更多種癥狀發(fā)作之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在lvh的一種或更多種癥狀發(fā)作之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的心血管疾病之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的血管鈣化之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的慢性腎病之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的1期慢性腎病之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的2期慢性腎病之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的3期慢性腎病之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的4期慢性腎病之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的5期慢性腎病之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的動脈硬化水平升高之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體是指在診斷對象的lvh之前根據(jù)本文提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，所述參考群體由在根據(jù)本文提供的方法治療之前或被診斷患有本文描述的疾病之前顯示了動脈硬化提高的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由在根據(jù)本文提供的方法治療之前或被診斷患有本文描述的疾病之前顯示了概述(參見章節(jié)6)中記載的標(biāo)志物之一的上升傾向的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由在根據(jù)本文提供的方法治療之前或被診斷患有本文描述的疾病之前顯示了提高水平的runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、phosphosmad3和/或尿蛋白的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由在根據(jù)本文提供的方法治療之前或被診斷患有本文描述的疾病之前顯示了概述(參見章節(jié)6)中記載的標(biāo)志物之一的下降傾向的人組成。在某些實施方式中，所述參考群體由在根據(jù)本文提供的方法治療之前或被診斷患有本文描述的疾病之前顯示了降低水平的alpha-sma、myocd、sm22-alpha或actriia的人組成。

8.6.3內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象中的enmt可以通過譜系跟蹤分析來監(jiān)視，以確定細(xì)胞群體的結(jié)局。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法治療的對象中的enmt可以通過定量與enmt相關(guān)的一種或更多種蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平和/或活性來監(jiān)視，例如，snai1。

8.6.4骨周轉(zhuǎn)

骨周轉(zhuǎn)的各種循環(huán)標(biāo)志物可以用于診斷骨失調(diào)，例如，低骨周轉(zhuǎn)。骨周轉(zhuǎn)的循環(huán)標(biāo)志物是骨形成的標(biāo)志物，例如，骨特異性堿性磷酸酶(bap)、osteocalcin、前膠原i型c-末端原肽(picp)和胰島素樣生長因子-1(igf-1)，一些是骨吸收的標(biāo)志物，例如，吡啶啉、脫氧吡啶啉、酒石酸抗性酸性磷酸酶(trap)、5b型trap、吡啶啉、脫氧吡啶啉和前膠原i型c-末端端肽(ictp)，血清或尿膠原蛋白交聯(lián)(n-端肽或c-端肽)和25羥基維生素d。也可以使用測量整個甲狀旁腺激素(pth)分子的分析。熟練的技術(shù)人員了解容許評估骨礦物密度(bmd)、骨體積、小梁骨體積和小梁厚度的成象方法。參見，例如tilmanb.druekeandsharonm.moe,disturbancesofboneandmineralmetabolisminchronickidneydisease:aninternationalinitiativetoimprovediagnosisandtreatment,nephroldialtransplant(2004)19:534–536；okunos,inabam.,biochemicalmarkersofboneturnover.newaspect.dialysisandbonemetabolicmarker,clincalcium.2009aug；19(8):1084-91；herberthj,monier-faugeremc,mawadhw,branscumaj,herberthz,wangg,cantort,malluchehh,thefivemostcommonlyusedintactparathyroidhormoneassaysareusefulforscreeningbutnotfordiagnosingboneturnoverabnormalitiesinckd-5subjects,clinnephrol.2009jul；72(1):5-14；lehmanng,ottu,kaemmererd,schuetzej,wolfg.,bonehistomorphometryandbiochemicalmarkersofboneturnoverinsubjectswithchronickidneydiseasestages3–5,clinnephrol.2008oct；70(4):296-305；drüeketb.,isparathyroidhormonemeasurementusefulforthediagnosisofrenalbonedisease？,kidneyint.2008mar；73(6):674-6；yamadas,inabam,kurajohm,shidarak,imanishiy,ishimurae,nishizaway.,utilityofserumtartrate-resistantacidphosphatase(tracp5b)asaboneresorptionmarkerinsubjectswithchronickidneydisease:independencefromrenaldysfunction.,clinendocrinol(oxf).2008aug；69(2):189-96.epub2008jan23。還參見，pauld.miller,diagnosisandtreatmentofosteoporosisinchronicrenaldisease,2009。

監(jiān)視患有輕微的腎臟功能障礙的ckd對象中骨吸收的另一個標(biāo)志物是i型膠原蛋白n-端肽(s-ntx)的血清濃度。參見，例如hamanot,fujiin,nagasaway,isakay,moriyamat,okadan,imaie,horiom,itot.,serumntxisapracticalmarkerforassessingantiresorptivetherapyforglucocorticoidtreatedsubjectswithchronickidneydisease.,bone.2006nov；39(5):1067-72.epub2006jun16。

定量的計算機斷層掃描(qct)也可以用于測定骨周轉(zhuǎn)。

可以評估標(biāo)志物，例如runx2和alp，來監(jiān)視對象中的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變。可以評估標(biāo)志物，例如sm22-alpha，來監(jiān)視血管平滑肌功能和分化的血管平滑肌細(xì)胞的水平。

8.6.5鈣水平

可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如，鈣離子選擇電極來分析鈣水平。在某些實施方式中，總鈣水平是在血清、血液、主動脈或尿液中測量的。

8.6.6血管鈣化

用于成像冠狀動脈鈣化程度(cac)的非對比計算機斷層掃描(ct)和用于非侵入性冠狀動脈造影(cta)的對比ct是通常用于診斷阻塞性冠心病的發(fā)展。也可以使用用于診斷性和預(yù)后性心臟評估的放射性核素強度測試、冠狀動脈鈣掃描和非侵入性冠狀動脈血管造影。參見：bermands,shawlj,hachamovitchr,friedmanjd,polkdm,hayessw,thomsonle,germanog,wongnd,kangx,rozanskia.,comparativeuseofradionuclidestresstesting,coronaryarterycalciumscanning,andnoninvasivecoronaryangiographyfordiagnosticandprognosticcardiacassessment,seminnuclmed.2007jan；37(1):2-16。

來自無癥狀對象的冠狀動脈鈣篩查結(jié)果可以用作比較。例如，當(dāng)血管鈣化與腎病相關(guān)時，在腎病發(fā)作之前獲得的鈣篩查結(jié)果可以用作比較。

用于檢測和定量冠狀動脈鈣化(cac)的可能的方法包括，但不限于，x-射線計算機斷層掃描和心肌灌流單光子發(fā)射計算機斷層照相(spect)。moserkw,o’keefejhjr,batemantm,mcghieia.,coronarycalciumscreeninginasymptomaticsubjectsasaguidetoriskfactormodificationandstressmyocardialperfusionimaging,jnuclcardiol.2003nov-dec；10(6):590-8。多檢測器計算機斷層掃描(mdct)也可以用于檢測血管鈣化(參見，例如，burrilletal.,2007,postgrad.med.j.83(985):698-704)。

血管鈣化的另一種診斷方法是聯(lián)合正電子發(fā)射斷層掃描(pet)/計算機斷層掃描(ct)在胸主動脈壁中的氟18氟脫氧葡萄糖(fdg)攝取。參見：tatsumim,cohadec,nakamotoy,wahlrl.,fluorodeoxyglucoseuptakeintheaorticwallatpet/ct:possiblefindingforactiveatherosclerosis,radiology.2003dec；229(3):831-7.epub2003oct30。

在再另一個實施方式中，超快速ct可以用于檢測動脈粥樣硬化性冠心病的存在。參見，例如breenjf,sheedypf2nd,schwartzrs,stansonaw,kaufmannrb,mollpp,rumbergerja,coronaryarterycalcificationdetectedwithultrafastctasanindicationofcoronaryarterydisease,radiology.1992nov；185(2):435-9。

電子束計算機斷層掃描也可以用于診斷冠狀動脈病。參見：schmermunda,baumgartd,sacks,s,d,seibelr,erbelr.,assessmentofcoronarycalcificationbyelectron-beamcomputedtomographyinsymptomaticsubjectswithnormal,abnormalorequivocalexercisestresstest,eurheartj.2000oct；21(20):1674-82。

血管鈣化的另一個測試涉及致叢性和血栓栓塞性肺動脈高壓中的斑塊組成。慢性血栓栓塞性肺動脈高血壓與帶有富含血型糖蛋白的松軟核心的動脈粥樣硬化斑塊相關(guān)，致叢性肺動脈高血壓與纖維狀斑塊相關(guān)。血栓栓塞材料在松軟核心的形成中起到關(guān)鍵作用，其中紅血球膜衍生的血型糖蛋白是主要成分。因而，研究了慢性血栓栓塞性和致叢性肺動脈高血壓(原發(fā)性和繼發(fā)性(eisenmenger綜合征))。參見：arbustinie,morbinip,d’arminiam,repettoa,minzionig,piovellaf,viganóm,tavazzil,plaquecompositioninplexogenicandthromboembolicpulmonaryhypertension:thecriticalroleofthromboticmaterialinpultaceouscoreformation,heart.2002aug；88(2):177-82。

agatston評分，一種基于沉積的鈣斑塊的密度測定的鈣評分系統(tǒng)，可以用于定量血管鈣化。在這一系統(tǒng)中，血管鈣化的水平可以通過多檢測器計算機斷層掃描(mdct)來測量，可以評估agatston評分中進(jìn)展速率的減弱。(參見，例如sharmaetal.,2010,vasc.healthriskmanag.6:603-611)。

進(jìn)一步的，血管鈣化可以使用adragaoetal.,2004,nephrol.dial.transplant19:1480-1488中描述的方法評估。

用于定量對象中的血管鈣化的另一種分析是病變特異性鈣評分，其包括由冠狀動脈鈣化ct檢查產(chǎn)生的鈣測量方法。這種方法由例如akramandvoros,2008,int.j.cardiovac.imaging14:743-749描述。

8.6.7心臟大小和心臟肥大

心臟大小和心臟肥大可以通過熟練的技術(shù)人員已知的任何方法來測定，例如，磁共振成象、心電圖描記術(shù)、超聲波心動描記術(shù)和非對比增強的心臟計算機斷層掃描。

8.6.8動脈硬化

動脈硬化的水平可以通過熟練的技術(shù)人員已知的任何方法來測量，例如，超聲多普勒測試，包括磁共振動脈造影的磁共振成像，包括ct血管造影的計算機斷層掃描(ct)和本領(lǐng)域已知的其他血管造影形式。

8.6.9腎臟疾病

腎小球濾過率、菊糖清除率、高磷酸血癥和bun水平可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來測定，以確定腎臟疾病。腎臟纖維化和/或腎小球硬化癥可以通過熟練的技術(shù)人員已知的任何方法診斷和/或監(jiān)視，例如，腎臟組織的活檢以及組織瘢痕形成檢查。腎臟纖維化和/或腎小球硬化癥還可以通過例如測量腎小球過濾率和/或進(jìn)行腎臟超聲來診斷和/或監(jiān)視。參見國家的腎臟基金會的網(wǎng)站。

8.6.10動物模型

動脈粥樣硬化性低密度脂蛋白受體缺陷(ldlr-/-)的雄性(c57bl/6j背景)可以購自jackson實驗室，在12周齡開始用高脂肪飲食(42％的卡路里來自脂肪)(teklad#_)飼喂。小鼠在22周齡時是肥胖的、胰島素抗性的，在28周齡時是糖尿病的，并且是高膽固醇血癥的。

早先描述了用來產(chǎn)生慢性腎病的兩步過程(davies,m.r.,etal.,2003.jamsocnephrol14:1559-1567；davies,m.r.,etal.,2005.jamsocnephrol16:917-928.)。電灼可以在出生后12周通過2厘米的側(cè)腹切口施用于右腎，隨后在14周齡左側(cè)進(jìn)行全腎切除術(shù)。改變燒灼的強度，以產(chǎn)生中度的(ckd-3)腎臟損傷，其通過20周齡時的菊糖清除率來確認(rèn)。對照組的小鼠，野生型c57bl/6j小鼠飼喂常規(guī)的飲食，其是用于使對照值標(biāo)準(zhǔn)化的正常腎功能和飲食的組。第二組是飼喂高脂肪飲食和假操作的ldlr-/-小鼠，其具有正常的腎臟功能，充當(dāng)對照組來測定腎臟疾病的作用。第三個組是具有相當(dāng)于人ckd3期的降低的gfr、飼喂高脂肪飲食(ckd-3)的ldlr-/-小鼠，在22周安樂死，是基線血管鈣化組(ckd-3)。第四個組是在22周開始每周兩次接受溶媒的皮下注射的患有ckd-3的ldlr-/-小鼠，直到第28周安樂死(ckd-3v)。第五個組是在22周開始每周兩次接受10mg/kg的mactriia-fc(celgene,summit,nj)的皮下注射的患有ckd-3的ldlr-/-小鼠，直到第28周安樂死(ckd-3mactriia-fc)。使用的劑量是早先在pk/pd研究中對于刺激骨形成有效的劑量(lotinun,s.,etal.,2010.bone46:1082-1088.)。

使用的第二個ckd的模型是x-連鎖的alport’s綜合征的鼠同源物，其在iv型膠原蛋白的α5鏈的基因上是缺陷的，col4a5(rheault,m.n.,etal.,2004.journaloftheamericansocietyofnephrology15:1466-1474.)。這是自發(fā)性腎臟疾病的模型。繁育對可以購自jackson實驗室，并繁育用于實驗。半合子雄性在出生后200天自發(fā)地發(fā)生與人3-4期ckd可比較的腎臟疾病。

第三個ckd模型是在用于細(xì)胞譜系追蹤的轉(zhuǎn)基因小鼠gnz小鼠中的腎臟消融，類似于ldlr-/-方案。gnz報告物雌性小鼠()和tek-cre轉(zhuǎn)基因雄性小鼠()可以購自jackson實驗室，并繁育產(chǎn)生gnz/tek-cre⁺小鼠用于實驗。gnz/tek-cre-同窩出生作為陰性對照?？梢酝ㄟ^使用廠家推薦用于gnz和tek-cre小鼠品系的特異性引物進(jìn)行小鼠基因分型。

8.6.11轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分析

在某些實施方式中，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分析可以用于測試actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑或snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx、osterix、klotho、actriia、axin2和/或sm22-alpha的活性。在actrii、snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、osterix、alp、bsap、ctx、klotho、actriia、axin2和/或sm22-alpha信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時，某些基因的轉(zhuǎn)錄被上調(diào)或下調(diào)。可以測量使用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(例如，通過rt-pcr)。試劑對轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的影響是其有效性或活性的度量。在某些實施方式中，已知對actrii、snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、osterix、alp、bsap、ctx、klotho、actriia、axin2和/或sm22-alpha信號轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)的啟動子區(qū)域可以被克隆到報告基因的上游。這樣，可以簡化分析，從而僅需要分析報告基因的活性。

8.6.12篩選分析

各種actrii多肽變體或可溶的actrii多肽變體，可以測試它們抑制actrii的能力。此外，化合物可以測試它們抑制actrii的能力。一旦確認(rèn)了actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑活性，這些化合物可以用于本文提供的方法。actrii可以是actriia或actriib。以下對actriia描述的分析也可以類似地對actriib進(jìn)行。

例如，可以評估actriia多肽變體對涉及骨生產(chǎn)或骨破壞的基因的表達(dá)的影響。根據(jù)需要，這可以在存在一種或更多種重組的actriia配體蛋白(例如，激活素)的情況下進(jìn)行，細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)染，以產(chǎn)生actriia多肽和/或其變體，任選地，產(chǎn)生actriia配體。同樣地，actriia多肽可以施用給小鼠或其他動物，可以評估一種或更多種骨性質(zhì)，例如密度或體積。還可以評估骨折的治愈率。雙能x射線吸收測定法(dexa)是一種用于評估動物骨密度的成熟的非侵入性定量技術(shù)。在人類中，中樞dexa系統(tǒng)可以用于評估脊柱和骨盆的骨密度。這些是總體骨密度的最佳預(yù)測值。外周dexa系統(tǒng)可以用于評估外周骨中的骨密度，包括，例如，手、腕部、踝和腳的骨骼。傳統(tǒng)的x射線成像系統(tǒng)，包括cat掃描，可以用于評估骨生長和骨折愈合。此外，骨密度可以使用定量計算機斷層掃描(qct)來測量。還可以評估骨的機械強度。

在某些方面，本文提供的是actriia多肽(例如，可溶的actriia多肽)和激活素多肽鑒定作為激活素-actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動劑或拮抗劑的化合物(試劑)的用途。可以測試通過這種篩選鑒定的化合物，來評估它們在體外調(diào)節(jié)骨生長或礦化的能力。任選地，這些化合物可以進(jìn)一步在動物模型中測試，來評估它們在體內(nèi)調(diào)節(jié)組織生長的能力。

有許多方法來篩選通過靶向激活素和actriia多肽調(diào)節(jié)組織生長的治療試劑。在某些實施方式中，可以進(jìn)行化合物的高通量篩選，來鑒定干擾激活素或actriia介導(dǎo)的骨影響的試劑。在某些實施方式中，進(jìn)行分析來篩選或鑒定特異性抑制或降低actriia多肽與激活素的結(jié)合的化合物。做為選擇，所述分析可以用于鑒定增強actriia多肽與激活素的結(jié)合的化合物。在進(jìn)一步的實施方式中，可以通過與激活素或actriia多肽相互作用的能力來鑒定化合物。

多種分析形式將是足夠的，根據(jù)當(dāng)前的公開，本文沒有明確描述的那些仍然可被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解。如本文描述的，本文使用的測試化合物(試劑)可以通過任何組合化學(xué)方法來創(chuàng)造。做為選擇，目標(biāo)化合物可以是體內(nèi)或體外合成的天然發(fā)生的生物分子。例如，要測試其作為組織生長調(diào)節(jié)物的能力的化合物(試劑)可以通過例如細(xì)菌、酵母、植物或其他生物體(例如，天然產(chǎn)物)產(chǎn)生，化學(xué)地產(chǎn)生(例如，小分子，包括肽模擬物)，或重組地產(chǎn)生。本文期待的測試化合物包括非肽基有機分子、肽、多肽、肽模擬物、糖類、激素和核酸分子。在具體的實施方式中，測試試劑是具有小于約2000道爾頓分子量的小的有機分子。

測試化合物可以作為單個的、離散的實體提供，或在更大復(fù)雜性的文庫中提供，例如，通過組合化學(xué)作用制備。這些文庫可以包含，例如，醇類、鹵烴類、胺類、酰胺類、酯類、醛類、醚類和其他類別的有機化合物。測試化合物向測試系統(tǒng)的呈現(xiàn)可以是分離的形式，或作為化合物的混合物，特別是在初步的篩選步驟中。任選地，化合物可以用其他化合物衍生化，并具有便于化合物分離的衍生基團(tuán)。衍生基團(tuán)的非限制性實例包括生物素、熒光素、地加氧原素、綠色熒光蛋白、同位素、多組氨酸、磁珠、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(gst)、光活化性交聯(lián)劑或其任何組合。

在測試化合物和天然提取物的庫的許多藥物篩選程序中，高通量分析是期望的，以最大化在給定時間內(nèi)調(diào)查的化合物的數(shù)量。在無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行、例如可以用純化的或半純化的蛋白質(zhì)衍生化的分析，通常優(yōu)選的作為“初級”篩選，因為它們可以被產(chǎn)生以允許快速開發(fā)和相對容易地檢測由測試化合物介導(dǎo)的分子目標(biāo)中的改變。此外，測試化合物的細(xì)胞毒性和/或生物利用率的影響一般可以在體外系統(tǒng)中忽視，該分析反而主要集中于藥物對分子目標(biāo)的影響，在actriia多肽和激活素之間結(jié)合親和性的改變方面這可能是明顯的。

僅為了說明，在示范性的篩選分析中，感興趣的化合物與分離的和純化的actriia多肽接觸，所述actriia多肽通常能夠結(jié)合激活素。然后向化合物和actriia多肽的混合物中添加含有actriia配體的組合物。actriia/激活素復(fù)合物的檢測和定量提供了一種手段來測定化合物抑制(或強化)actriia多肽與激活素之間復(fù)合物形成的能力。化合物的效力可以通過從使用各種濃度的測試化合物獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線來評定。此外，還可以進(jìn)行對照分析來提供用于對比的基線。例如，在對照分析中，分離的和純化的激活素被添加到含有actriia多肽的組合物中，在不存在測試化合物的情況下測定actriia/激活素復(fù)合物的形成。要理解的是，一般地，混合反應(yīng)物的順序可以變化，可以同時地混合。此外，代替純化的蛋白質(zhì)，細(xì)胞提取物和溶胞產(chǎn)物可以用于實現(xiàn)適合的無細(xì)胞分析系統(tǒng)。

actriia多肽與激活素之間的復(fù)合物形成可以通過多種技術(shù)來檢測。例如，使用例如可檢測地標(biāo)記的蛋白質(zhì)，例如放射性標(biāo)記的(例如，³²p、³⁵s、¹⁴c或³h)、熒光標(biāo)記的(例如，fitc)或酶標(biāo)記的actriia多肽或激活素，通過免疫分析，或通過層析檢測，可以測定復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)。

在某些實施方式中，在直接地或間接地測量actriia多肽與它的結(jié)合蛋白之間的相互作用程度時，本文期待的是使用熒光偏振分析和熒光共振能量傳遞(fret)分析。進(jìn)一步的，其他檢測方式，例如，基于光波導(dǎo)(pct公開wo96/26432和美國專利no.5,677,196)、表面胞質(zhì)團(tuán)共振(spr)、表面電荷傳感器和表面力傳感器的那些，與本文描述的許多實施方式是相容的。

此外，相互作用陷阱分析，也稱為“雙雜交分析”可以用于鑒定破壞或強化actriia多肽與它的結(jié)合蛋白之間的相互作用的試劑。參見，例如，美國專利no.5,283,317；zervosetal.(1993)cell72:223-232；maduraetal.(1993)jbiolchem268:12046-12054；barteletal.(1993)biotechniques14:920-924；和iwabuchietal.(1993)oncogene8:1693-1696)。在具體的實施方式中，本文期待的是使用反轉(zhuǎn)的雙雜交系統(tǒng)來鑒定解除actriia多肽與它的結(jié)合蛋白之間的相互作用的化合物(例如，小分子或肽)。參見，例如vidalandlegrain,(1999)nucleicacidsres27:919-29；vidalandlegrain,(1999)trendsbiotechnol17:374-81；和美國專利nos.5,525,490；5,955,280；和5,965,368。

在某些實施方式中，通過它們與actriia或激活素多肽相互作用的能力來鑒定出目標(biāo)化合物?；衔锱cactriia或激活素多肽之間的相互作用可以是共價的或是非共價的。例如，這樣的相互作用可以使用體外的生物化學(xué)方法在蛋白質(zhì)水平上鑒定，包括光交聯(lián)、放射性標(biāo)記的配體結(jié)合和親和層析(jakobywbetal.,1974,methodsinenzymology46:1)。在某些情況下，化合物可以在基于機制的分析中篩選，例如，檢測與激活素或actriia多肽結(jié)合的化合物的分析。這可以包括固相或液相的結(jié)合事件。做為選擇，編碼激活素或actriia多肽的基因可以與報告物系統(tǒng)(例如，β-半乳糖苷酶、熒光素酶或綠色熒光蛋白)一起轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，并優(yōu)選地通過高通量篩選針對文庫來篩選，或用文庫的獨立成員來篩選。可以使用其他基于機制的結(jié)合分析，例如，檢測自由能變化的分析。結(jié)合分析可以用固定在反應(yīng)孔、珠子或芯片上或通過固定化抗體捕獲的或通過毛細(xì)管電泳分辨的靶標(biāo)來進(jìn)行。結(jié)合的化合物通?？梢允褂帽壬驘晒饣虮砻姘|(zhì)團(tuán)共振來檢測。

在某些方面，本文提供的是調(diào)節(jié)(刺激或抑制)骨形成和提高骨質(zhì)量的方法和試劑。因而，所鑒定的任何化合物可以在完整細(xì)胞或組織中體外或體內(nèi)地測試，來確認(rèn)它們調(diào)節(jié)骨生長或礦化的能力。為此目標(biāo)可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法。特別地，化合物可以測試它們提高骨周轉(zhuǎn)的能力。

例如，actriia或激活素多肽或測試化合物對骨或軟骨生長的影響，可以通過在基于細(xì)胞的分析中測量msx2的誘導(dǎo)或骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化來測定(參見，例如daluiskietal.,natgenet.2001,27(1):84-8；hinoetal.,frontbiosci.2004,9:1520-9)。基于細(xì)胞的分析的其他實例包括分析目標(biāo)actriia或激活素多肽以及測試化合物在間充質(zhì)祖代和成骨細(xì)胞中的成骨活性。舉例來說，可以構(gòu)建表達(dá)激活素或actriia多肽的重組腺病毒，來感染多能的間充質(zhì)祖代c3h10t1/2細(xì)胞、前成骨細(xì)胞性c2cl2細(xì)胞以及成骨細(xì)胞性te-85細(xì)胞。然后通過測量堿性磷酸酶的誘導(dǎo)、骨鈣素和基質(zhì)礦化來確定成骨活性(參見，例如chengetal.,jbonejointsurgam.2003,85-a(8):1544-52).

本文還提供的是測量骨或軟骨生長的體內(nèi)分析。例如，公開了namkung-matthaietal.,bone,28:80-86(2001)大鼠骨質(zhì)疏松模型，在其中研究了骨折后早期的骨修復(fù)。kuboetal.,steroidbiochemistry&molecularbiology,68:197-202(1999)也公開了大鼠骨質(zhì)疏松模型，在其中研究了骨折后早期的骨修復(fù)。描述了小鼠骨質(zhì)疏松癥模型，其中小鼠是切除卵巢的，這引起小鼠丟失實質(zhì)的骨礦物含量以及骨礦物密度，其小梁骨損失大約50％的骨礦物密度。通過施用因子例如甲狀旁腺激素，切除卵巢的小鼠中的骨密度可以提高。在某些方面，可以使用本領(lǐng)域已知的骨折愈合分析。這些分析包括骨折技術(shù)、組織學(xué)分析和生物力學(xué)分析，其在例如美國專利no.6,521,750中描述了，對于它引起以及測量骨折的程度和修復(fù)過程的實驗方案公開內(nèi)容，通過將其完全引用合并在本文中。

8.7激活素ii型受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量

在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是章節(jié)8.5.1中闡述的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑。在其他實施方式中，actrii抑制劑是章節(jié)8.5.2中闡述的actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑與actriib信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的組合。

在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑以足以實現(xiàn)0.2微克/kg或更高的血清濃度的間隔和數(shù)量給藥，1微克/kg或2微克/kg或更高的血清水平對于實現(xiàn)對骨密度和強度的顯著影響是希望的。可以設(shè)計給藥方案來達(dá)到0.2到15微克/kg之間的血清濃度，任選的1到5微克/kg之間。在人類中，0.2微克/kg的血清水平可以用0.1mg/kg或更高的單次劑量來實現(xiàn)，1微克/kg的血清水平可以用0.3mg/kg或更高的單次劑量來實現(xiàn)。觀察到的分子血清半衰期在約20到30天之間，實質(zhì)上更長于大多數(shù)fc融合蛋白，因而可以實現(xiàn)持續(xù)有效的血清水平，例如，通過用0.2-0.4mg/kg每周或每兩周給藥，或者更高的劑量可以與給藥之間更長的間隔一起運用。例如，可以在每月或每兩個月的基礎(chǔ)上使用1-3mg/kg的劑量，對骨的作用可能足夠耐久，從而僅需要每3、4、5、6、9、12或更多個月給藥一次。actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的血清水平可以通過熟練的技術(shù)人員已知的任何手段來測量。例如，利用例如elisa，針對actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的抗體可以用于測定actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的血清水平。

在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量靜脈內(nèi)地是0.01到3.0mg/kg，或皮下地是0.03到0.1mg/kg。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量是約0.01mg/kg、約0.1mg/kg、約0.13mg/kg、約0.2mg/kg、約0.26mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.5mg/kg、約2.0mg/kg、約2.5mg/kg、約3.0mg/kg、約3.5mg/kg、約4.0mg/kg、約4.5mg/kg或約5.0mg/kg。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量是約10.0mg/kg、約15.0mg/kg、約20.0mg/kg、約25.0mg/kg或約30.0mg/kg。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量是在0.01mg/kg到0.1mg/kg之間、0.1mg/kg到0.3mg/kg之間、0.3mg/kg到0.5mg/kg之間、0.3mg/kg到0.8mg/kg之間、0.5mg/kg到1.0mg/kg之間、1.0mg/kg到2.0mg/kg之間、1.0mg/kg到3.0mg/kg之間、2.0mg/kg到3.0mg/kg之間、2.0mg/kg到4.0mg/kg之間、3.0mg/kg到5.0mg/kg之間、5.0mg/kg到10.0mg/kg之間、10.0mg/kg到15.0mg/kg之間、10.0mg/kg到20.0mg/kg之間、15.0mg/kg到20.0mg/kg之間或20.0mg/kg到30.0mg/kg之間。在某些實施方式中，所述劑量是約15mg、約30mg、約45mg、約60mg、約75mg、約90mg或約1g。在某些實施方式中，所述劑量是約0.1mg/kg。在某些實施方式中，所述劑量是約0.3mg/kg。在某些實施方式中，所述劑量是約0.5mg/kg。在某些實施方式中，所述劑量是約0.7mg/kg。

在某些實施方式中，所述劑量是藥學(xué)上有效的劑量。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有的效劑量是約15mg、約30mg、約45mg、約60mg、約75mg、約90mg或約1g或約0.1mg/kg、約0.13mg/kg、約0.2mg/kg、約0.26mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg或約1.5mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是約0.1mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是約0.3mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是約0.5mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是約0.7mg/kg。

在某些實施方式中，所述劑量是初始劑量。在某些實施方式中，所述初始劑量是約15mg、約30mg、約45mg、約60mg、約75mg、約90mg或約1g或約0.1mg/kg、約0.13mg/kg、約0.2mg/kg、約0.26mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg或約1.5mg/kg。在某些實施方式中，所述藥學(xué)上有效的劑量是約0.1mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.3mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.5mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.7mg/kg。在某些實施方式中，所述初始劑量是(i)每28天施用一次；或(ii)每42天施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是每14天施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是每21天施用一次。

在某些實施方式中，所述初始劑量每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量每1、2、3、4、5或6周施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量每2周施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.1mg/kg、約0.13mg/kg、約0.2mg/kg、約0.26mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg或約1.5mg/kg，并且每1、2、3、4、5或6周施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量在約0.3到約0.8mg/kg之間并且每2周施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.1mg/kg、約0.13mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg或約1.5mg/kg，并且每1、2、3、4、5或6周施用一次。。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg或約1.5mg/kg，并且每2周施用一次。。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.3mg/kg，并且每2周施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.5mg/kg，并且每2周施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.7mg/kg，并且每2周施用一次。在某些實施方式中，所述初始劑量是約0.8mg/kg，并且每2周施用一次。

在某些實施方式中，所述劑量是調(diào)整的劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量大于所述初始劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整劑量是約2.5mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg或約35mg大于所述初始劑量，或約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.15mg/kg、約0.25mg/kg、約0.3mg/kg、約0.35mg/kg、約0.4mg/kg或約0.5mg/kg大于所述初始劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量比所述初始劑量更頻繁地施用。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量每5、10、15、20、25、28、30、35或40天施用。

在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量小于所述初始劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量是約2.5mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg或約35mg小于所述初始劑量，或約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.15mg/kg、約0.25mg/kg、約0.3mg/kg、約0.35mg/kg、約0.4mg/kg或約0.5mg/kg小于所述初始劑量。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量比所述初始劑量較少頻繁地施用。在某些實施方式中，所述調(diào)整的劑量每30、35、40、42、50、60、70、80或90天施用。

在某些實施方式中，所述劑量通過注射施用。在某些實施方式中，所述劑量每28天施用一次，或每42天施用一次。在某些實施方式中，連續(xù)地和/或無限地施用所述劑量。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中激活素的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中激活素的水平和/或活性至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，所述激活素是游離激活素，例如，不與卵泡抑素、卵泡抑素樣3或抑制素締合的激活素。在某些實施方式中，所述激活素是激活素a。在某些實施方式中，激活素水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的smad依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中的smad依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，smad依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中runx2的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中runx2的水平和/或活性至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，runx2水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中alp的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中alp的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，alp水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中snai1的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中snai1的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，snai1水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中phosphosmad2的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中phosphosmad2的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，phosphosmad2水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中phosphosmad3的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中phosphosmad3的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，phosphosmad3水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中尿蛋白的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中尿蛋白的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，尿蛋白水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中dkk1的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中dkk1的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，dkk1水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中col1a1的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中col1a1的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，col1a1水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中bsap的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中bsap的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，bsap水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中ctx的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中ctx的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，ctx水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中osterix的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中osterix的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，osterix水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中actriia的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中actriia的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，actriia水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中klotho的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象中klotho的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，klotho水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中alpha-sma的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象中alpha-sma的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，alpha-sma水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中myocd的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象中myocd的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，myocd水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中axin2的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象中axin2的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，axin2水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中血管平滑肌蛋白質(zhì)水平相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象中血管平滑肌蛋白質(zhì)水平，例如，sm22-alpha。在某些實施方式中，血管平滑肌蛋白質(zhì)水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中sm22-alpha的水平和/或活性相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象中sm22-alpha的水平和/或活性達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，sm22-alpha水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的骨體積相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象中的骨體積達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，骨體積通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中破骨細(xì)胞凹陷表面相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中破骨細(xì)胞凹陷表面達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，破骨細(xì)胞凹陷表面通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的骨形成率相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以維持所述對象的骨形成率，或最低限度地提高或降低所述對象的骨形成率，例如，最多1％、2.5％、5％、10％或15％。在某些實施方式中，骨形成率通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的成骨細(xì)胞表面相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以維持所述對象的成骨細(xì)胞表面，或最低限度地提高或降低所述對象的成骨細(xì)胞表面，例如，最多1％、2.5％、5％、10％或15。在某些實施方式中，成骨細(xì)胞表面通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中主動脈的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中主動脈的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，主動脈的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的成骨細(xì)胞數(shù)量相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的成骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，成骨細(xì)胞數(shù)量通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的成骨細(xì)胞表面與骨表面比相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的成骨細(xì)胞表面與骨表面比達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，成骨細(xì)胞表面與骨表面比通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的破骨細(xì)胞數(shù)量相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，破骨細(xì)胞數(shù)量通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的破骨細(xì)胞表面與骨表面比相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的破骨細(xì)胞表面與骨表面比達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，破骨細(xì)胞表面與骨表面比通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的小梁骨體積相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象的小梁骨體積達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，小梁骨體積通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的小梁厚度相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象的小梁厚度達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，小梁厚度通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的血管平滑肌功能相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象的血管平滑肌功能達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，血管平滑肌功能通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的血管鈣化相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的血管鈣化達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，血管鈣化通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的血管鈣水平相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的血管鈣水平達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，血管鈣水平通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的主動脈鈣水平相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的主動脈鈣水平達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，主動脈鈣水平通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)的主動脈粥樣斑中的鈣沉積相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的主動脈粥樣斑中的鈣沉積達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，主動脈粥樣斑中的鈣沉積通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的enmt相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象中ckd誘導(dǎo)的內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(enmt)達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，enmt通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的心臟大小(例如，心臟重量)相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的心臟大小(例如，心臟重量)達(dá)至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或至少10％，或最多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或至少10％。在某些實施方式中，心臟大小通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的分化的血管平滑肌細(xì)胞水平相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高所述對象的分化的血管平滑肌細(xì)胞水平達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或最多500％。在某些實施方式中，血分化的血管平滑肌細(xì)胞水平通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的動脈硬化相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的動脈硬化水平升高達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，動脈硬化通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的動脈硬化相比，根據(jù)本文提供的方法施用的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的動脈硬化水平升高達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，動脈硬化通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的礦物質(zhì)合并率相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以維持所述對象的礦物質(zhì)合并率，或最低限度地提高或降低所述對象的最小合并率，例如，最多1％、2.5％、5％、10％或15％。在某些實施方式中，礦物質(zhì)合并率通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的高磷酸血癥相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以維持所述對象的高磷酸血癥，或最低限度地提高或降低所述對象的高磷酸血癥，例如，最多1％、2.5％、5％、10％或15％。在某些實施方式中，高磷酸血癥通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的fgf23水平相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以維持所述對象的fgf23水平，或最低限度地提高或降低所述對象的fgf23水平，例如，最多1％、2.5％、5％、10％或15％。在某些實施方式中，fgf水平和/或活性通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的腎臟纖維化相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的腎臟纖維化達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，腎臟纖維化通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。在某些實施方式中，與參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中的腎小球硬化癥相比，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以降低所述對象的腎小球硬化癥達(dá)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，或最多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。在某些實施方式中，腎小球硬化癥通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以歸一化本文提供的一種或更多種生物標(biāo)記物(例如，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、尿蛋白和/或actriia)的水平。例如，在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以提高或降低本文提供的一種或更多種生物標(biāo)記物(例如，runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、尿蛋白和/或actriia)的水平到參考群體(例如，如章節(jié)8.6中描述的參考群體)中相應(yīng)生物標(biāo)記物的水平。

在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以治療和/或預(yù)防所述對象的心臟肥大。在某些實施方式中，心臟肥大通過如章節(jié)8.6中描述的分析來測定。在某些實施方式中，根據(jù)本文提供的方法向?qū)ο笫┯玫腶ctrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量足以治療和/或預(yù)防所述對象的lvh。

當(dāng)與本文提供的劑量(例如，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的劑量或第二活性試劑的劑量)一起使用時，詞語“約”是指參考數(shù)量的1％、5％或10％以內(nèi)的任何數(shù)量。

在某些實施方式中，本文描述的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑根據(jù)本文提供的方法皮下地或靜脈內(nèi)地施用給對象。

在某些實施方式中，0.13mg/kg的actriia-hfc(seqidno：7)以每14天一次的間隔皮下地施用給根據(jù)所提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，0.26mg/kg的actriia-hfc(seqidno：7)以每14天一次的間隔皮下地施用給根據(jù)所提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，0.1mg/kg的actriia-hfc(seqidno：7)以每14天一次的間隔靜脈內(nèi)地施用給根據(jù)所提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，0.2mg/kg的actriia-hfc(seqidno：7)以每14天一次的間隔靜脈內(nèi)地施用給根據(jù)所提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，0.3mg/kg的actriia-hfc(seqidno：7)以每28天一次的間隔皮下地施用給根據(jù)所提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，0.5mg/kg的actriia-hfc(seqidno：7)以每28天一次的間隔皮下地施用給根據(jù)所提供的方法治療的對象。在某些實施方式中，0.7mg/kg的actriia-hfc(seqidno：7)以每28天一次的間隔皮下地施用給根據(jù)所提供的方法治療的對象。

8.8組合治療

在某些實施方式中，本文提供的方法與第二藥學(xué)活性試劑組合地進(jìn)行。這樣的組合治療可以通過治療的單獨成分的同時、連續(xù)或獨立給藥的方式來實現(xiàn)。此外，當(dāng)作為這種組合治療的成分施用時，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑與第二藥學(xué)活性試劑可以是協(xié)同的，從而與通常作為單一治療給予的每種成分的劑量相比，兩種成分的任一種或兩種的日劑量可以被降低。做為選擇，當(dāng)作為這種組合治療的成分施用時，本文提供的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑與第二藥學(xué)活性試劑可以是加成的，從而與通常作為單一治療給予的每種成分的劑量相比，每種成分的日劑量是相似的或相同的。

在某些實施方式中，本文提供的actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑與第二藥學(xué)活性試劑在同一天施用。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑在第二藥學(xué)活性試劑之前一天、兩天、三天或更多天施用。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑在第二藥學(xué)活性試劑之后一天、兩天、三天或更多天施用。在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑在第二藥學(xué)活性試劑一周、兩周、三周或更多周之內(nèi)施用。

在某些實施方式中所述第二藥學(xué)活性試劑是snai1、phosphosmad2、phosphosmad3、尿蛋白、dkk1、col1a1、激活素(例如，游離激活素)、runx2、alp、bsap、ctx和/或osterix的拮抗劑，例如抗體或其片段、小分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、反義核酸、小干擾核酸、顯性陰性蛋白或其片段。在某些實施方式中，所述第二藥學(xué)活性試劑是klotho、alpha-sma、myocd、axin2和/或sm22-alpha的激動劑，例如，抗體或其片段或小分子

在某些實施方式中，所述第二藥學(xué)活性試劑是用于治療心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病和/或與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病的活性試劑，例如，醛固酮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、血管緊張素ii受體阻斷劑、beta-阻斷劑、鈣離子通道阻斷劑、降膽固醇藥物、地高辛、利尿劑、變力性治療、鉀或鎂、血管擴張劑和/或華法林。

在某些實施方式中，所述第二藥學(xué)活性試劑是用于治療慢性腎病的活性試劑，例如，血管緊張素ii受體阻斷劑、beta-阻斷劑、鈣離子通道阻斷劑、直接腎素信號傳導(dǎo)抑制劑、利尿劑、血管舒張劑、促紅細(xì)胞生成素治療、鐵替代治療和/或維生素d.

在某些實施方式中，與治療或改善心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病和/或與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病、和/或慢性腎病的方法組合地進(jìn)行本文提供的方法。

8.9藥物組合物

在某些實施方式中，激活素-actrii拮抗劑(例如，actrii多肽)與藥學(xué)上可接受的載體一起配制用于本文描述的方法。例如，actrii多肽可以單獨施用或作為藥物制劑的成分(治療組合物)施用。目標(biāo)化合物可以被配制以用于人類或獸醫(yī)學(xué)的任何方便方式施用。actrii可以是actriia或actriib。

在某些實施方式中，本文提供的治療方法包括系統(tǒng)地或作為植入物或設(shè)備局部地施用所述組合物(包含actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑)。當(dāng)施用時，用于本文提供的用途的治療組合物是無熱原的、生理學(xué)可接受的形式。還可以任選地被包括在如上所述的組合物中的actrii拮抗劑之外的治療有用試劑，可以與目標(biāo)化合物(例如，actrii多肽，例如，actriia和/或actriib多肽(參見，章節(jié)8.5))同時地或次序地施用。

一般地，actrii拮抗劑將胃腸外施用。適合于胃腸外施用的藥物組合物可以包含一種或更多種actrii多肽，與一種或更多種藥學(xué)上可接受的無菌的等滲水性或非水性溶液、分散體、懸浮液或乳劑或無菌粉末組合，所述無菌粉末在即將使用之前可重構(gòu)為無菌可注射溶液或分散體，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使得制劑與預(yù)期的接受者的血液等滲的溶質(zhì)，或懸浮劑或增稠劑。在用于本文描述的方法中的藥物組合物中采用的適合的水性和非水性載體的實例包括，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)、以及其適合的混合物，植物油，例如橄欖油，和可注射的有機酯，例如油酸乙酯。例如，通過使用包被材料例如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持所需的粒子大小、以及通過使用表面活性劑，可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?/p>

進(jìn)一步的，所述組合物可以以用于遞送到目標(biāo)組織位點(例如，骨)的形式被膠囊化或注射。在某些實施方式中，本文描述的方法中使用的組合物可以包括基質(zhì)，其能將一種或更多種治療化合物(例如，actriia多肽)遞送到目標(biāo)組織位點(例如，骨)，提供一種結(jié)構(gòu)用于顯現(xiàn)組織以及最佳地能夠被再吸收入身體。例如，所述基質(zhì)可以提供actriia多肽的緩慢釋放。這樣的基質(zhì)可以由當(dāng)前用于其他植入醫(yī)學(xué)應(yīng)用的材料形成。

基質(zhì)材料的選擇基于生物相容性、生物降解能力、機械性質(zhì)、美容的外觀和接觸面性質(zhì)。目標(biāo)組合物的特殊的應(yīng)用將限定適當(dāng)?shù)闹苿?。組合物的可能的基質(zhì)可以是生物可降解的和化學(xué)上定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其他可能的材料是生物可降解的和生物學(xué)上明確定義的，例如骨或真皮膠原蛋白。進(jìn)一步的基質(zhì)包含純的蛋白質(zhì)或細(xì)胞外基質(zhì)成分。其他可能的基質(zhì)是非生物可降解的和化學(xué)上定義的，例如，燒結(jié)的羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其他陶瓷?；|(zhì)可以包含任何上述材料類型的組合，例如聚乳酸和羥磷灰石，或膠原蛋白和磷酸三鈣。生物陶瓷可以在組成上改變，例如在鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽中，并被加工來改變孔徑大小、顆粒大小、顆粒形狀和生物降解能力。

在某些實施方式中，用于本文描述的方法的組合物(包含actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑)可以口服施用，例如以膠囊、扁膠囊、丸劑、片劑、錠劑(使用調(diào)味的基底，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)、粉末、顆粒或作為水性或非水性液體中的溶液或懸浮液，或作為水包油或油包水液體乳劑或作為酏劑或糖漿或作為軟錠劑(使用惰性基底，例如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)和/或作為漱口劑等的形式，各自含有預(yù)定數(shù)量的試劑作為活性成分。試劑也可以作為彈丸、舔劑或糊劑來施用。

在用于口服施用的固體劑型中(膠囊、片劑、藥丸、糖衣丸、粉未、顆粒，等)，本文描述的一種或更多種治療化合物可以與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或任何以下的混合：(1)填料或膨脹劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(3)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；(3)濕潤劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，例如，石蠟；(6)吸收加速劑，例如，季銨化合物；(7)潤濕劑，例如，十六醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸附劑，例如，高嶺土和班脫土；(9)潤滑劑，例如，滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和其混合物；和(在膠囊、片劑和丸劑的情況中，藥物組合物還可以包含緩沖劑。類似類型的固體組合物也可以用作軟和硬填充膠囊中的填料，使用這樣的賦形劑如乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等等。

用于口服施用的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了活性成分之外，液體劑型可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如，水或其他溶劑、增溶劑以及乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別是，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻以及芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇類、聚乙二醇以及山梨聚醇的脂肪酸酯，和其混合物。除了惰性稀釋劑之外，口腔組合物還可以包括佐劑例如潤濕劑、乳化和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。

除了活性化合物之外，懸浮液可以含有懸浮劑，例如，乙氧基異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯，微晶纖維素、偏氫氧化鋁、斑脫土、瓊脂和黃芪膠，以及其混合物。

本文描述的組合物還可以含有佐劑，例如，防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^包含各種抗菌和抗真菌劑，例如，對羥苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸，等，來實現(xiàn)對微生物作用的保護(hù)。還可能希望的是在組合物中包括等滲試劑，例如糖類、氯化鈉等。此外，通過包含延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠，可以得到可注射藥物形式的延長吸收。

要理解的是，給藥方案將由主治醫(yī)師考慮修飾本文描述的化合物(例如，actrii多肽，例如，actriia和/或actriib多肽)的作用的各種因素來決定。所述各種因素包括但不限于，希望形成的骨重量的數(shù)量，骨密度損失程度，骨損傷部位，骨損傷狀況，對象的年齡、性別和飲食，可能導(dǎo)致骨損失的任何疾病的嚴(yán)重度，施用的時間和其他臨床因素。任選地，所述劑量可以隨重構(gòu)中使用的基質(zhì)的類型以及組合物中化合物的類型而變化。其他已知的生長因子向最終組合物中的添加也可能影響劑量。進(jìn)展可以通過周期性評估骨生長和/或修復(fù)來監(jiān)視，例如，x-射線(包括dexa)、組織形態(tài)學(xué)測定和四環(huán)素標(biāo)記。

在某些實施方式中，本文提供的是用于actrii多肽的體內(nèi)生產(chǎn)的基因治療。通過將actrii多核苷酸序列導(dǎo)入具有上文列出的失調(diào)的細(xì)胞或組織，這樣的療法將實現(xiàn)其治療效果。遞送actrii多核苷酸序列可以利用重組表達(dá)載體，例如嵌合病毒或膠態(tài)分散體系統(tǒng)來實現(xiàn)。優(yōu)選的，用于actrii多核苷酸序列的治療遞送的是使用靶向的脂質(zhì)體。actrii多肽可以是actriia和/或actriib多肽(參見，章節(jié)8.5))。

在此教導(dǎo)的可以用于基因治療的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘，或優(yōu)選地，rna病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠或禽類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。其中可以插入單個外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實例包括，但不限于，moloney鼠白血病毒(momulv)、harvey鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠類乳腺腫瘤病毒(mumtv)和勞氏肉瘤病毒(rsv)。許多其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以摻入多個基因。所有這些載體可以傳遞或摻入可選擇標(biāo)記物的基因，從而可以鑒定和產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。通過附著例如糖類、糖脂或蛋白質(zhì)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以變?yōu)槟繕?biāo)特異性的。優(yōu)選的靶向是通過使用抗體實現(xiàn)的。技術(shù)人員將認(rèn)識到，特異性多核苷酸序列可以插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中或附著于病毒包膜，以容許含有actrii多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的目標(biāo)特異性遞送。在優(yōu)選的實施方式中，所述載體被靶向骨或軟骨。

做為選擇，通過常規(guī)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染，組織培養(yǎng)細(xì)胞可以直接用編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞然后用含有感興趣基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生的細(xì)胞將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體釋放到培養(yǎng)基中。

actrii多核苷酸的另一種靶向遞送系統(tǒng)是膠態(tài)分散體系統(tǒng)。膠態(tài)分散體系統(tǒng)包括大分子復(fù)合物、納囊、微球體、珠子和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠粒團(tuán)、混合的膠粒團(tuán)和脂質(zhì)體。用于本文描述的方法的優(yōu)選的膠態(tài)系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工的膜囊，其作為體外和體內(nèi)的遞送運載體是有用的。rna、dna和完整的病毒?？梢悦芊庠谒缘膬?nèi)部，并以生物學(xué)活性形式遞送給細(xì)胞(參見，例如，fraley,etal.,trendsbiochem.sci.,6:77,1981)。利用脂質(zhì)體載體的高效的基因轉(zhuǎn)移方法是本領(lǐng)域已知的，參見，例如，mannino,etal.,biotechniques,6:682,1988。脂質(zhì)體的組成通常是磷脂類的組合，通常與類固醇，特別是膽固醇組合。也可以使用其他磷脂或其他脂質(zhì)。脂質(zhì)體的物理性質(zhì)取決于ph值、離子強度和二價陽離子的存在。

在脂質(zhì)體生產(chǎn)中有用的脂質(zhì)包括磷脂?；衔铮?，磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂類、腦苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂類。說明性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿?；诶缙鞴偬禺愋?、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性，脂質(zhì)體的靶向也是可能的，是本領(lǐng)域已知的。

在某些實施方式中，actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑在藥物組合物中是基本上純的。具體地，所述藥物組合物中的最多20％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％或最多0.05％的化合物是除了actrii信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體之外的化合物。

8.10試劑盒

本文提供的是包含一個或更多個容器的試劑盒，所述容器填充了一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的一種或更多種生物標(biāo)記物(例如runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的一種生物標(biāo)記物(例如runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中runx2的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中alp的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中snai1的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中phosphosmad2的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中dkk1的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中col1a1的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中激活素的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中bsap的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中ctx的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中osterix的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中klotho的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中alpha-sma的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中myocd的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中sm22-alpha的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中phosphosmad3的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中尿蛋白的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中actriia的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中axin2的水平。

在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的兩種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的兩種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的三種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的三種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad3、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的四種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的四種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad四、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的五種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的五種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad五個、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的六種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的六種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad六、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的七種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的七種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad七、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的八種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的八種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad八、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的九種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的九種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad九、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十一種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十一種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十二種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十二種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十三種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十三種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十四種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十四種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十五種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十五種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十六種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十六種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十七種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十七種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑，來測定獲自本文描述的對象的樣品中本文描述的十八種生物標(biāo)記物(例如選自以下構(gòu)成的組的十八種生物標(biāo)記物：runx2、alp、snai1、phosphosmad2、dkk1、col1a1、激活素、bsap、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、sm22-alpha、phosphosmad十、actriia、axin2和尿蛋白)的水平。在某些實施方式中，所述測定生物標(biāo)記物的水平的一種或更多種試劑是如章節(jié)8.6.1中描述的。在某些實施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含actriia-hfc(seqidno：7)。在某些實施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含第二容器，其包含actriia-hfc(seqidno：7)。

9.實施例

在此呈現(xiàn)的實施例表明，在某些形式的慢性腎病中runx2、alp、bsap、ctx和osterixmrna水平升高，klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和sm22-alphamrna水平可降低。這些實施例進(jìn)一步表明，用激活素配體陷阱治療降低了runx2、alp、ctx、actriia和/或osterixmrna水平，提高了klotho、alpha-sma、myocd、axin2和/或sm22-alphamrna水平，這與血管鈣化的降低相關(guān)。因而，本文提供的實施例表明runx2、alp、ctx、osterix、klotho、alpha-sma、myocd、actriia、axin2和/或sm22-alpha可以用作生物標(biāo)記物，用于治療心血管疾病、血管鈣化、與血管鈣化相關(guān)和/或由血管鈣化引起的心血管疾病、與腎病相關(guān)和/或由腎病引起的心血管疾病、動脈硬化水平升高、與動脈硬化水平升高相關(guān)和/或由動脈硬化水平升高引起的心血管疾病、lvh和/或與lvh相關(guān)和/或由lvh引起的心血管疾病。

9.1實施例1.用激活素受體2a型的配體陷阱治療ckd-mbd

ckd-mbd可以包括血管鈣化，一種骨營養(yǎng)不良，以及在它發(fā)端時對骨骼的骨細(xì)胞fgf23分泌的刺激，以及高磷酸血癥，其在進(jìn)程的晚期發(fā)生進(jìn)一步刺激血管鈣化。這個實施例表明，抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，一種由ckd誘導(dǎo)的、通過激活素iia型受體(actriia)的tgfβ超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的成員，抑制了血管鈣化并預(yù)防心臟肥大。

9.1.1方法

帶有高磷酸血癥和gfr60％降低的ckd(ckd-3)在2型糖尿病ldlr-/-小鼠、血管鈣化高脂肪飼喂模型中在14周齡誘導(dǎo)。一些ckd小鼠用激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱mactriia-fc治療，在22周齡開始每周ip注射，在28周時研究。測量了主動脈的ca²⁺水平、成骨細(xì)胞的和血管平滑肌蛋白質(zhì)的表達(dá)、骨骼組織形態(tài)和microct成像、血清化學(xué)以及fgf23和pth水平。激活素、卵泡抑素和抑制素水平通過elisa、rt-pcr和western印跡測量。

9.1.2結(jié)果

循環(huán)激活素水平在兩種不同的腎臟疾病模型中提高：間質(zhì)性纖維化和x-連鎖aiports(附圖1a和附圖1b)。此外，激活素amrna水平在ckd模型的主動脈和腎臟中提高(附圖2)。激活素水平在血管系統(tǒng)和循環(huán)中提高，而沒有卵泡抑素的改變(附圖2a、附圖2b和附圖2c)。通過用激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱(mactriia-fc；參見，例如美國專利8,173,601，其公開內(nèi)容通過完全引用合并在本文中)治療，ckd刺激的血管鈣化降低到低于22周的水平(附圖3a、附圖3b、附圖3c、附圖3d、附圖5a和附圖5b)，預(yù)防了心臟肥大。ckd誘導(dǎo)了主動脈的runx2、osterix和alp信息和蛋白質(zhì)的表達(dá)，這些被激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱mactriia-fc反轉(zhuǎn)(對于runx2和alpmrna，分別是附圖4a和附圖4b；對于runx2蛋白，附圖4f)。ckd降低了klotho和sm22-alpha信息和蛋白質(zhì)，用激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱mactriia-fc治療歸一化了klotho和sm22-alpha表達(dá)(對klotho和sm22-alphamrna分別是附圖4c和附圖4e；附圖4f為蛋白質(zhì))。此外，ckd降低了myocd信息(附圖4d)。此外，ckd降低了alpha-平滑肌肌動蛋白(肌動蛋白alpha-平滑肌)蛋白質(zhì)(附圖4f)。進(jìn)一步的，ckd刺激了鈣水平的提高，其被mactriia-fc治療降低(附圖6a)。激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱mactriia-fc治療提高了骨體積，破骨細(xì)胞凹陷表面降低，但是骨形成率和成骨細(xì)胞表面不受影響(附圖6b、附圖6c和附圖6d)。激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱mactriia-fc治療沒有改變高磷酸血癥和fgf23水平。

用激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱mactriia-fc治療抑制了骨吸收并提高了骨體積。用激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱mactriia-fc治療抑制了smad依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻斷了主動脈的成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，提高了血管平滑肌蛋白質(zhì)水平，并降低了ckd刺激的血管鈣化和心臟肥大。

9.2實施例2.慢性腎病(ckd)刺激主動脈的內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(enmt)，其引起血管鈣化并被激活素配體陷阱抑制

在慢性腎病中血管鈣化的基礎(chǔ)分子機制是不完全了解的。然而，激活素水平在ckd刺激的血管鈣化中提高。為了評估激活素在ckd刺激的血管鈣化中的作用，結(jié)合許多tgf-beta超家族配體的重組融合蛋白被用于動脈粥樣硬化和2型糖尿病的模型中的慢性腎病的小鼠模型中。actriia-fc融合蛋白由同免疫球蛋白1(igg1)fc結(jié)構(gòu)域連接的激活素受體iia(actriia)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成，該蛋白質(zhì)作為tgf-beta超家族成員如激活素a、激活素b、生長分化因子-11(gdf11)和骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白-10(bmp-10)的配體陷阱起作用。

早先已經(jīng)顯示了，通過在腎臟修復(fù)期間產(chǎn)生全身性wnt抑制，腎臟疾病引起血管鈣化。這個實施例表明，ckd刺激的wnt抑制的血管作用是刺激血管的激活素，以及誘導(dǎo)smad依賴性enmt，激活素受體配體陷阱抑制了enmt和血管鈣化。

9.2.1方法

具有升高的wnt抑制劑的ckd在譜系跟蹤和血管鈣化的小鼠模型中誘導(dǎo)。激活素、卵泡抑素和抑制素水平通過elisa、rt-pcr和western印跡測量。在繁育成內(nèi)皮特異性tie2-cre小鼠的gnz小鼠(stolleretal,genesis,2008)中進(jìn)行細(xì)胞譜系跟蹤。帶有g(shù)nz敲入的小鼠在cre介導(dǎo)的重組之后表達(dá)核gfp和lacz。

9.2.2結(jié)果

在腎臟疾病和ckd刺激的血管鈣化的小鼠模型中，激活素水平在血管系統(tǒng)和循環(huán)中提高，而沒有卵泡抑素水平的改變。在gnz的外膜和中層的細(xì)胞中ckd誘導(dǎo)gfp和lacz的表達(dá)；tie2-creckd小鼠與gnz相比較；tie2-cre小鼠具有正常的腎臟功能，其中g(shù)fp和lacz限于主動脈的內(nèi)皮。tie2是內(nèi)皮的譜系特異性受體，這表明ckd誘導(dǎo)主動脈的enmt(附圖7a、附圖7b、附圖7c和附圖7d)。ckd刺激的主動脈enmt產(chǎn)生了降低的血管平滑肌功能，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和鈣化。用激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱(mactriia-fc；參見，例如，美國專利no.8,173,601，其公開內(nèi)容通過引用全部合并在本文中)治療抑制了smad依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻斷了主動脈的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，提高了血管平滑肌功能，并降低了ckd刺激的血管鈣化。因而，ckd誘導(dǎo)血管激活素和enmt，用激活素2a型受體(mactriia)配體陷阱治療降低了激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制的血管去分化，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和血管鈣化。

9.3實施例3.以逐步提高的劑量治療的血液透析對象中骨質(zhì)量和血管鈣化的初步信號搜尋定量計算機斷層掃描結(jié)果

高周轉(zhuǎn)的腎性骨營養(yǎng)不良(rod)的標(biāo)志是提高的皮層孔隙度、更高的小梁骨質(zhì)量和提高的骨折風(fēng)險，一種在矯正血液透析(hd)對象的貧血中研究的激活素ariia-igg1融合蛋白配體陷阱actriia-fc阻斷了激活素a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以降低破骨細(xì)胞發(fā)生并促進(jìn)骨中的成骨細(xì)胞成熟。利用定量的計算機斷層照相(qct)，在hd對象中的當(dāng)前的分析評估了actriia-fc對骨礦物密度(bmd)和血管鈣化的影響。

9.3.1方法

用actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的、促紅細(xì)胞生成素刺激劑(esa)響應(yīng)性的血液透析對象被洗出esa作用直到血紅蛋白(hb)<10g/dl，然后隨機化為用以下劑量的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療：0.3mg/kg(n＝9)、0.5mg/kg(n＝8)、0.7mg/kg(n＝6)或安慰劑(pbo；n＝7)每28天皮下地，直到8個劑量周期。評估對象的hb、骨礦物密度(bmd)和骨周轉(zhuǎn)的生物標(biāo)記物的影響。治療失敗(hb<9g/dl)用esa和/或紅血細(xì)胞輸血來挽救。在基線和225天的治療期之后獲得髖部和腰脊椎的定量計算機斷層掃描(qct)。在基線和劑量周期3、5和7之后測量生物標(biāo)記物bsap和ctx。

在基線和225天的治療期之后獲得髖部、腰脊椎和腹主動脈的qct。對象仰臥在mindways校準(zhǔn)模型上(model3；mindwayssoftware,inc.,austin,tx)。使用標(biāo)準(zhǔn)軟組織核重建2.5mm和512×512矩陣的切片厚度。mindways分析軟件(版本5.0.3)用于評估體積的bmd(vbmd)。小梁的vbmd(mg/cm3)對l1-4內(nèi)的2節(jié)脊椎測定(一般l1-2)。分析左側(cè)股骨近端股骨頭皮層，骨小梁和整個髖部的整合骨區(qū)室、股骨頸和髀樞的vbmd。

使用軟件來評估腹主動脈的血管鈣化，所述軟件半自動地分段鄰近于l1頂部到l4底部的區(qū)域內(nèi)鈣化的面積和體積。在每個對象的就診之間保持了切片的數(shù)量和位置。如agatstonetal.,jamcollcardiol.1990；15:827-832andhokansonetal.,ajramjroentgenol.2004；182:1327-1332中描述的測定agatston和平方根轉(zhuǎn)化的體積得分。更低的總agatston和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分(mm3)表明更低水平的血管鈣化(vc)。

通過parexel成像(parexelinternationalcorp.waltham,ma)中央地進(jìn)行所有的圖像質(zhì)量控制和盲分析。

在基線和劑量周期1、3、5和7之后測量生物標(biāo)記物，包括骨特異性堿性磷酸酶(bsap)、前膠原蛋白1型n-末端原肽(p1np)和c-末端1型膠原蛋白端肽(ctx)。

9.3.2結(jié)果

總共31名對象隨機化，接受超過1個劑量的研究藥物。

表2.隨機化的對象和qct分析子集合

對象分布如附圖8中描述，包括在基線和225天有成對的qct測量的對象。

大多數(shù)對象在治療失敗需要挽救(一般由于hb<9g/dl)之后停止研究治療；沒有對象因為有害事件(ae)停止治療。

具有成對的qct測量的16名對象中，9人在治療期內(nèi)需要挽救療法，9人在前3個劑量周期內(nèi)需要挽救。

在具有成對的qct測量的對象中，基線的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征一般在處理組之間是相似的(表3)；然而，在安慰劑組中有實質(zhì)上更長的透析時間，這也是最年輕的組。在基線生物標(biāo)記物和agatston得分方面各組之間也存在差異(表4)。

表3.具有成對的qct測量的對象的基線人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征

表4.具有成對的qct測量的對象的平均基線生物標(biāo)記物、面積bmd和agatston得分

pth＝甲狀旁腺激素。

*更低的agatston得分表明更低水平的血管鈣化。

表5提供了髖部整體、股骨頸皮層、髖部皮層和腰椎骨面積bmd測量中距基線改變百分比。

表5.髖部整體、股骨頸皮層、髖部皮層和腰椎骨面積bmd中的基線和距基線改變百分比

皮層骨的2％提高可能降低骨折風(fēng)險。在具有股骨頸部皮層骨的大于或等于2％提高的部分對象中，actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療與劑量依賴性提高相關(guān)(表5和附圖9a)。

在高周轉(zhuǎn)rod中，相比一般群體，小梁骨質(zhì)量提高(即，不良質(zhì)量的骨)，通過腰脊椎bmd來測量，在eskd中在椎骨骨折率上沒有降低。用actriia治療預(yù)防了腰脊椎中小梁骨質(zhì)量的提高(表5和附圖9b)。

腹主動脈總計agatston得分的距基線改變在表6中提供。在總計agatston得分和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分方面改變的類別顯示在附圖9和表7中。

表6.腹主動脈總計agatston得分和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分方面的基線和距基線改變。

*更低的總計agatston和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分表明更低水平的血管鈣化。

十一位對象具有在10到10,000之間分布的基線agatston得分。五名對象可以被認(rèn)為是基線處的逸出值(低逸出值：0.0、1.1和1.4agatston得分；高逸出值：21,033和44,356agatston得分)。因此，分析沒有逸出值的agatston得分(表7和附圖10)。

表7.排除5個逸出值在總計agatston得分方面的基線和改變

*更低的總計agatston和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分表明更低水平的血管鈣化。

通過對actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的暴露持續(xù)時間分析對象。通過暴露狀態(tài)分析對象：接受達(dá)到3個劑量的actriia-fc對象，不考慮劑量水平(n＝6)，接受>3個劑量的actriia-fc接受者，不考慮劑量水平(n＝7)。安慰劑基團(tuán)(n＝3)不變。除了性別和agatston得分之外，在接受≤3個劑量的actriia-fc的對象與接受>3個劑量的對象之間，關(guān)鍵的基線特征一般是相似的，在所有actriia-fc對象中對vc的暴露影響保持完整，排除了逸出值時也是一樣(表10)。

表8.對象的基線人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征，根據(jù)actriia-fc暴露

表9.根據(jù)actriia-fc暴露，在總計agatston得分和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分方面的基線和距基線改變*

*更低的總計agatston得分和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分表明更低水平的血管鈣化。

表10.根據(jù)actriia-fc暴露，在總計agatston得分方面的基線和距基線改變，排除5個逸出值*

*更低的總計agatston得分和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分表明更低水平的血管鈣化。

評估了骨周轉(zhuǎn)生物標(biāo)記物。安慰劑組具有最高的基線處的pth、bsap、p1np和ctx水平(表4)。在磷、pth、fgf-23或硬骨素水平方面沒有觀察到一致的距基線改變，只是在安慰劑組中pth在所有時間點都低于基線(-15.2到-100.7ng/l)。對于骨生物標(biāo)記物，在形成標(biāo)志物bsap和bsapp1np方面沒有見到百分比改變中的清楚變化，在再吸收標(biāo)志物ctx中的百分比改變在附圖11中示出。

接受0.5mg/kgactriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的更多對象在再吸收標(biāo)志物ctx方面存在有意義、持續(xù)的降低。

9.3.3結(jié)論

對于30名隨機化的對象，13人具有成對的qct評估(對于pbo、0.3mg/kg和0.5mg/kg分別為n＝3、6和4)。對于pbo、0.3mg/kg和0.5mg/kg距基線的相對bmd改變分別是股骨的頸部皮層的-0.9％、-1.4％和+1.9％，以及腰脊椎的+12.6％、+8.0％和1.9％。0.5mg/kg的生物標(biāo)記物改變提示了有益的抗再吸收作用。

這些數(shù)據(jù)表明，actriia-fc0.5mg/kg的出現(xiàn)的劑量效應(yīng)，其看起來逆轉(zhuǎn)了高周轉(zhuǎn)rod對皮層骨和松質(zhì)骨的影響。pbo結(jié)果與預(yù)料相同。

9.4實施例4.腎臟疾病產(chǎn)生的循環(huán)腎臟修復(fù)因子引起心血管疾病

腎臟疾病與極其高的死亡率相關(guān)，這與它們產(chǎn)生心血管疾病相關(guān)(sarnak,m.j.etal.,2003.circulation108:2154-2169.)。一項進(jìn)行中的regards計劃的輔助研究表明，在具有持續(xù)性冠狀動脈事件(心臟缺血或非致命性心肌梗塞)的患者中，在4年的中值跟蹤中，第二心血管事件的發(fā)生率在患有腎臟疾病的患者中是35％，相比之下高風(fēng)險組(吸煙者、糖尿病、高膽固醇血癥)是19％，在高風(fēng)險組中各種原因的死亡發(fā)生率是慢性腎病(ckd)組的一半(baber,u.,etal.,2013.amheartj166:373-380.)。與腎臟疾病相關(guān)的提高的心血管風(fēng)險的原因在于2006年命名的一種綜合征——慢性腎病-骨礦物失調(diào)(ckd-mbd)(moe,s.,etal.,2006.kidneyint69:1945-1953.)。在ckd-mbd中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種新的心血管風(fēng)險因素(block,g.a.,etal.,1998.amjkidneydis31:607-617；blacher,j.,etal.,2001.hypertension38:938-942；gutierrez,o.m.,etal.,2008.newengljmed359:584-592.)，它們的風(fēng)險因素狀態(tài)在一般群體中得到確認(rèn)(dhingra,r.,etal.,2007.archinternmed167:879-885；matsushita,k.,etal.,2014.journaloftheamericansocietyofnephrology；dalal,m.,etal.,2011.europeanjournalofendocrinology165:797-803.)。這些是高磷酸血癥、血管鈣化和升高的成纖維細(xì)胞生長因子23(fgf23)水平。ckd-mbd開始于ckd的早期階段(2期)(fang,y.,etal.,2014.kidneyint85:142-150；pereira,r.c.,etal.,2009.bone45:1161-1168；fang,y.,etal.,2009.jamsocnephrol20:36a；hu,m.c.,etal.,2011.jamsocnephrol22:124-136.)由血管去分化/鈣化、骨營養(yǎng)不良、klotho損失和提高的fgf23分泌組成(fang,y.,etal.,2014.kidneyint85:142-150.)，但是在早期腎衰竭開始時進(jìn)展為ckd-mbd的原因(hu,m.c.,etal.,2011.jamsocnephrol22:124-136；fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763；deoliveira,r.b.,etal.,2013.nephrologydialysistransplantation28:2510-2517；sabbagh,y.2012.j.boneminer.r

已經(jīng)證明腎臟疾病的再激活發(fā)展程序涉及疾病刺激的腎臟修復(fù)期間的腎發(fā)生(surendran,k.,etal.,2002.amjphysiolrenalphysiol282:f431-f441；surendran,k.,etal.,2005.jamsocnephrol16:2373-2384；maeshima,a.,etal.,2001.cytokine&growthfactorreviews12:289-298；terada,y.,etal.,2003.journaloftheamericansocietyofnephrology14:1223-1233；kawakami,t.,etal.,2013.jpathol229:221-231.)。在腎臟修復(fù)中重新激活的腎產(chǎn)生的因子之中，wnt(portmanteauofwinglessandintegrated)家族對于管狀上皮重構(gòu)是關(guān)鍵的(terada,y.,etal.,2003.journaloftheamericansocietyofnephrology14:1223-1233；kawakami,t.,etal.,2013.jpathol229:221-231；rinkevich,y.,etal.,2014.cellreports7:1270-1283.).在wnt功能的控制中，典型的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄性地誘導(dǎo)wnt抑制性蛋白家族的表達(dá)，它們是分泌的蛋白，用來限制wnt對自泌性或旁泌性因子的刺激的距離(niida,a.,etal.,2004.oncogene23:8520-8526；niehrs,c.2006.oncogene25:7469-7481；reya,t.,etal.,2003.nature423:409-414；chamorro,m.n.,etal.,2004.theembojournal24:73-84；gonzalez-sancho,j.m.,2004.oncogene24:1098-1103.)。wnt抑制劑是循環(huán)的因子，wnt抑制劑家族包括dickkopfs(dkk)、分泌的卷曲相關(guān)蛋白(sfrps)、硬骨素、sostdoc1、crescent、wnt抑制劑因子1(wif1)和icat(niehrs,c.2006.oncogene25:7469-7481).variousformsofkidneydiseaseincreaserenalexpressionofwntinhibitorsandincreasetheirlevelsinthecirculation(fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763；surendran,k.,etal.,2005.jamsocnephrol16:2373-2384.)。

在ckd的循環(huán)中升高的關(guān)鍵wnt抑制劑的中和作用，dkk1，抑制ckd誘導(dǎo)的血管去分化、血管鈣化和腎性骨營養(yǎng)不良(fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763.)。這種效應(yīng)是令人驚訝的，因為血管平滑肌中的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及刺激成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和血管鈣化(al-aly,z.,etal.,2007.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology27:2589-2596；shao,j.s.,etal.,2005.journalofclinicalinvestigation115:1210-1220.)。然而，新近的研究表明，dkk1介導(dǎo)的主動脈wnt7b的抑制刺激了smad介導(dǎo)的主動脈內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(enmt)和血管鈣化(cheng,s.-l.,etal.,2013.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology33:1679-1689.)。enmt是涉及心臟瓣膜、心臟隔膜和主動脈根的發(fā)育的發(fā)育生理學(xué)的過程(eisenberg,l.m.,andmarkwald,r.r.1995.circulationresearch77:1-6；camenisch,t.d.,etal.,2002.developmentalbiology248:170-181.)，它可能(zeisberg,e.m.,etal.,2007.natmed13:952-961.)或可能不(moore-morris,t.,etal.,2014.thejournalofclinicalinvestigation124:2921-2934.)在各種成年人疾病狀態(tài)中促進(jìn)心臟纖維化。這一因素研究了是否有來自tgfβ超家族的其他因子涉及腎臟疾病期間的嘗試腎臟修復(fù)，并在ckd期間在循環(huán)中提高。

9.4.1方法

9.4.1.1動物模型的產(chǎn)生

動脈粥樣硬化性低密度脂蛋白受體缺陷(ldlr-/-)的雄性(c57bl/6j背景)購自jackson實驗室，在12周齡開始用高脂肪飲食(42％的卡路里來自脂肪)(teklad#_)飼喂。小鼠在22周齡時是肥胖的、胰島素抗性的，在28周齡時是糖尿病的，并且是高膽固醇血癥的。

早先描述了用來產(chǎn)生慢性腎病的兩步過程(davies,m.r.,etal.,2003.jamsocnephrol14:1559-1567；davies,m.r.,etal.,2005.jamsocnephrol16:917-928.)。電灼可以在出生后12周通過2厘米的側(cè)腹切口施用于右腎，隨后在14周齡左側(cè)進(jìn)行全腎切除術(shù)。改變燒灼的強度，以產(chǎn)生中度的(ckd-3)腎臟損傷，其通過20周齡時的菊糖清除率來確認(rèn)(附圖12a)。對照動物接受假操作，其中暴露并移動適當(dāng)?shù)哪I臟，但不以任何其他方式處理。五組小鼠用于這項研究(附圖15b)。第一組是飼喂常規(guī)飲食的野生型c57bl/6j小鼠(wt)。這是用于標(biāo)準(zhǔn)對照值的正常腎臟功能和飲食的組。第二組是飼喂高脂肪飲食和假操作的ldlr-/-小鼠(sham)。這一組具有正常的腎臟的功能，它充當(dāng)對照組來確定腎臟疾病的影響。第三組是具有相當(dāng)于人ckd3期的降低的gfr、飼喂高脂肪飲食的ldlr-/-小鼠(ckd-3)，在22周安樂死，是基線血管鈣化組(ckd-3)。第四組是在22周開始每周兩次接受溶媒的皮下注射的患有ckd-3的ldlr-/-小鼠，直到第28周安樂死(ckd-3v)。第五組是在22周開始每周兩次接受10mg/kg的mactriia-fc(celgene,summit,nj)的皮下注射的患有ckd-3的ldlr-/-小鼠，直到第28周安樂死(ckd-3mactriia-fc)。

使用的第二種ckd的模型是x-連鎖的alport's綜合征的鼠同族體，其在iv型膠原蛋白的α5鏈的基因col4a5上是缺陷的(rheault,m.n.,etal.,2004.journaloftheamericansocietyofnephrology15:1466-1474.)。這是自發(fā)性腎臟疾病的模型，在整個結(jié)果中使用它來確認(rèn)腎臟消融誘導(dǎo)的ckd的影響。繁育對可以購自jackson實驗室，并繁育用于實驗。半合子雄性在出生后200天自發(fā)地發(fā)生與人3-4期ckd可比較的腎臟疾病。

使用的第三種ckd模型是在用于細(xì)胞譜系追蹤的轉(zhuǎn)基因小鼠gnz小鼠中的腎臟消融，類似于ldlr-/-方案(附圖14)。gnz報告物雌性小鼠(stoller,j.z.,etal.,2008.genesis(newyork,n.y.2000)46:200-204.)和tek-cre轉(zhuǎn)基因雄性小鼠(koni,p.a.,etal.,2001.thejournalofexperimentalmedicine193:741-754.)購自jackson實驗室，并繁育產(chǎn)生gnz/tek-cre+小鼠用于實驗。gnz/tek-cre-同窩出生作為陰性對照。通過使用廠家推薦用于gnz和tek-cre小鼠品系的特異性引物進(jìn)行小鼠基因分型。在所情況中，在麻醉下進(jìn)行安樂死。腹膜腔內(nèi)麻醉(甲苯噻嗪13mg/kg和氯胺酮87mg/kg)用于所有的過程。隱靜脈的靜脈血液樣品在第二次手術(shù)后一周采集，來評估基線的術(shù)后腎臟功能。在處死時，通過心內(nèi)穿刺采集血液，心臟和主動脈整體解剖。

9.4.1.2菊糖清除

如果安樂死在28周，在20周或26周根據(jù)廠家指導(dǎo)(biopalinc.,worcester,ma)進(jìn)行菊糖清除。

9.4.1.3化學(xué)的鈣化定量

在處死時解剖主動脈和心臟，在解剖顯微鏡下通過鈍器解剖除去所有外部的組織。組織在60℃干燥20-24小時，稱重，并用缽錘和研缽碾壓成粉末。在4℃下在1nhcl中洗脫鈣持續(xù)24小時。根據(jù)廠家的指導(dǎo)使用甲酚酞絡(luò)合酮方法(sigma,stlouis)分析洗脫物的鈣含量，結(jié)果相對干燥組織重量來校正。

9.4.1.4血液測試

通過標(biāo)準(zhǔn)的自動分析儀實驗室方法，在抽血當(dāng)天分析血液的血脲氮(bun)、鈣和磷酸鹽。血漿激活素(fitzgeraldindustries,acton,ma)、卵泡抑素(mybiosourceinc.,sandiego,ca)和卵泡抑素樣3(mybiosourceinc.)水平在elisa分析中測定。血清dkk1用elisa分析r&dsystems,minn.,mn(r&dsystems,minn.,mn)。對于elisa分析，在安樂死時通過隱靜脈或心臟穿刺抽取血液。所有血液樣品在采集時置于冰上。血小板缺乏的edta血漿樣品通過在4℃6000rpm5分鐘和14000rpm2分鐘的2步離心來制備。樣品在-20℃或以下冷凍保存待用。

9.4.1.5組織學(xué)和免疫組織化學(xué)

主動脈、腎臟和心臟組織固定在10％中性緩沖的福爾馬林中過夜，然后轉(zhuǎn)移到4℃的70％乙醇中，包埋在石蠟中，制備5微米切片。切片在二甲苯中脫石蠟，在分級的乙醇系列中脫水，然后再水化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，masontrichome染色用于檢測腎臟和心臟纖維化，茜素紅染色用于檢測鈣化(gregory,c.a.,etal.,2004.analyticalbiochemistry329:77-84.)。對于免疫組織化學(xué)染色，內(nèi)源的過氧化物酶用甲醇中3％h2o2阻斷15分鐘。非特異性結(jié)合用抗生物素蛋白和生物素封閉試劑(vectorlaboratories,burlingame,ca,usa)阻斷30分鐘，然后用3％正常驢血清阻斷20分鐘。在用pbs洗滌是指，切片與初級抗體在4℃孵育過夜，然后與生物素化的次級抗體(vectorlaboratories)在室溫下孵育1小時，然后使用dab試劑盒(sk-4100,vectorlaboratories)進(jìn)行鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的過氧化物酶染色。對于雙重免疫熒光染色，切片在20％山羊血清中阻斷，用第一初級和次級抗體以及第二初級和次級抗體連續(xù)染色，根據(jù)廠家指導(dǎo)，使用山羊抗兔alexa488和alexa568次級抗體1:400(lifetechnologies,a11008anda11011)或tsa試劑盒(lifetechnologies,t20932)用于信號放大。來自同一物種的初級抗體用于雙重染色時，在第二次染色之前切片在檸檬酸鹽緩沖液中在微波中加熱5分鐘(tothandmezey,2007)。初級抗體用于這項研究中用于免疫染色：兔多克隆抗actriia抗體1:250(abcam,ab135634)、兔多克隆抗抑制素betaa抗體1:100(santacruz,sc-50288)、兔多克隆抗cd31抗體1:50(abcam,ab28364)和兔多克隆抗gfp抗體1:1000(abcam,ab6556)。

9.4.1.6rt-pcr

使用rneasymini試劑盒(qiagen,valencia,ca)從主動脈和細(xì)胞培養(yǎng)物中提取rna。1μg的總rna用dnase處理，根據(jù)廠家的指導(dǎo)使用來自bio-rad(hercules,ca)的iscriptcdna合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用vectornti(invitrogen,grandisland,ny)或primerexpress軟件設(shè)計引物。perkin-elmerdna熱循環(huán)儀用于進(jìn)行反應(yīng)。在如上述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄之后，使用steponeplus實時pcr儀(ab)、來自sigma(st.louis)的sybrgreen和來自invitrogen的pcr試劑盒進(jìn)行實時。每個反應(yīng)在95℃45秒、和60℃30秒和72℃60秒一式三份進(jìn)行40個循環(huán)。隨后是熔化循環(huán)，由60℃到95℃逐步提高的溫度組成。在每個基因的解離曲線中觀察到單一優(yōu)勢峰，支持了pcr產(chǎn)物的特異性。ct數(shù)(閾值)在pcr的指數(shù)期內(nèi)設(shè)置，用于計算目標(biāo)基因的表達(dá)水平。b2m用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物，用于歸一化所述值。由ct對比logcdna稀釋度(相應(yīng)于log拷貝數(shù))組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過擴增與未知數(shù)量的擴增子相應(yīng)的cdna的連續(xù)稀釋物來產(chǎn)生。通過在rt-pcr之前煮沸5分鐘來確?；蚪Mdna不被擴增，通過滅活逆轉(zhuǎn)錄酶來進(jìn)行陰性對照。

9.4.1.7免疫印跡(western分析)

使用含有蛋白酶抑制劑混合物(santacruz)的ripa裂解緩沖液(thermoscientific)，從小鼠的腎臟和主動脈制備全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物蛋白.溶胞產(chǎn)物(20μg)裝載到8-12％sds-page凝膠中，用針對抑制素β-a(santacruz)、α-微管蛋白(santacruz)、snai1(cellsignaling)、alpha-sma(sigma)、runx2(cellsignaling)、myocd(santacruz)、acvrl1(origene)、acvr1(cellsignaling)、erk1/2(cellsignaling)、磷酸-erk1/2(cellsignaling)、acvr1b(origene)、col1a1(santacruz)、smad2/3(cellsignaling)或磷酸-smad2/3(cellsignaling)的抗體進(jìn)行免疫印跡。在免疫沉淀(ip)分析中，使用相同的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物蛋白。為了降低非特異性結(jié)合，使用預(yù)洗滌的蛋白a瓊脂糖珠子(cellsignaling)預(yù)先清洗樣品。預(yù)清洗的樣品與磷酸絲氨酸抗體(abcam)孵育過夜。然后在蛋白a瓊脂糖珠子上捕獲ip-抗體復(fù)合物，通過免疫印跡分析檢測蛋白質(zhì)。

9.4.1.8人類研究

根據(jù)來自赫爾辛基聲明的指南在給與知情同意之后將對象加入。如果大于18歲并患有3期ckd(估計的gfr30-59ml/分鐘/1.73m²)使用腎病研究方程中的飲食修改(levey,a.s.,etal.,1999.anninternmed130:461-470.)，對象是合格的。排除指標(biāo)包括妊娠、骨疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、心臟舒張功能障礙或嚴(yán)重的高血壓。研究組的成員確定他們的臨床患者滿足包含指標(biāo)并對研究感興趣。在參與之前回顧醫(yī)療記錄來確定最終的合格。在基線就診時和治療12個月后從每個對象獲得血液樣品。在獲得血液樣品的當(dāng)天存在患者內(nèi)的變異。從每份樣品產(chǎn)生血漿等分量，直接用于生物化學(xué)測試或在-80℃冷凍。使用商業(yè)上可獲得的elisa試劑盒根據(jù)廠家的說明(r&dsystems,minneapolis,mn)雙份地測量激活素的血漿水平。

9.4.1.9統(tǒng)計

使用anova進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±sd，觸發(fā)在附圖圖例中另外指定。在使用fisherlsd法之后評估各組之間的差異，p<0.05認(rèn)為是顯著的。使用sigmastat統(tǒng)計軟件(pointrichmond，ca)進(jìn)行分析。所有組的數(shù)據(jù)有7-15的“n”。對于實時pcr分析，每個實驗組中使用最少3個樣品。不成對的t-測驗用于比較mactriia-fc治療的ckd-3小鼠和溶媒治療的ckd-3v小鼠或假(sham-operated)操作的小鼠。在附圖6中，方框代表中值和百分位范圍(25^th到75^th百分位數(shù))，誤差線代表低于25^th和高于75^th百分位數(shù)的百分位范圍的1.5倍。使用用于多重比較的anovaholm–sidak方法比較平均值，p<0.05作為顯著差異的臨界水平。

9.4.2結(jié)果

9.4.2.1ckd模型中的腎功能

在三個實驗?zāi)Ｐ椭姓T導(dǎo)類似于人3期ckd(ckd-3)的ckd。第一個模型是ckd刺激的動脈粥樣硬化性血管鈣化的模型：ldlr-/-高脂肪飼喂的小鼠(fang,y.,etal.,2014.kidneyint85:142-150；fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763；davies,m.r.,etal.,2003.jamsocnephrol14:1559-1567；davies,m.r.,etal.,2005.jamsocnephrol16:917-928；lund,r.j.,etal.,2004.jamsocnephrol15:359-369；mathew,s.,etal.,2008.jamsocnephrol19:1092-1105.pmcid:pmc2396927；mathew,s.,etal.,2007.jamsocnephrol18:122-130；mathew,s.,etal.,2008.jamsocnephrol19:1509-1519.pmcid:pmc2488263.)。通過菊糖清除和通過bun水平測量的腎臟功能在ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中降低到人3期ckd的水平，如章節(jié)9.4.1.1中描述的，這些小鼠此后稱為ckd-3(附圖12a和附圖12b)。此外，ckd-3小鼠是高磷酸鹽血的(表11)，這與人3b-4ckd一致。第二個ckd模型是自發(fā)性ckd，其在iv型膠原蛋白的α5鏈(col4α5)缺陷(alport’s綜合征)的小鼠和人中發(fā)生(rheault,m.n.,etal.,2004.journaloftheamericansocietyofnephrology15:1466-1474.)。200天齡的col4α5缺陷小鼠具有相當(dāng)于人3-4期ckd的菊糖清除降低和bun升高(附圖12c和附圖12d)。第三個模型，gnz小鼠中的ckd-3在章節(jié)9.4.1.1和下文中描述。

表11.各組動物的血清生化參數(shù)

9.4.2.2激活素水平和主動脈激活素iia型受體(actriia)

研究了ckd中的腎臟修復(fù)刺激tgfβ超家族成員的循環(huán)水平的能力。在ckd的模型中循環(huán)激活素水平提高(附圖13a和附圖13b)。分析腎臟和主動脈組織的激活素a(抑制素betaa的同二聚體(inhba))的mrna。在腎臟和主動脈中inhbamrna被ckd誘導(dǎo)(附圖13c)，在腎臟中蛋白質(zhì)水平提高(附圖13d)。分析來自患有ckd-3的小鼠的主動脈中tgfβ超家族ii型受體的誘導(dǎo)，所述受體是由ii型和i型(alk)受體組成的超家族受體雜多聚體的配體結(jié)合部件。ldlr-/-高脂肪飼喂的小鼠中產(chǎn)生的ckd-3誘導(dǎo)了主動脈血管平滑肌中的激活素ii型受體a(actriia)的上調(diào)(附圖13e)。與調(diào)節(jié)的抑制因子卵泡抑素和卵泡抑素樣3(fstl3)相關(guān)的激活素(welt,c.,etal.,2002.experimentalbiologyandmedicine227:724-752.)，其循環(huán)水平(附圖13f和附圖13g)和組織水平不受ckd-3影響。在循環(huán)中卵泡抑素、fstl3和抑制素(總和620pg/ml加400pg/ml的未測出的抑制素)(sharpe,r.m.,etal.,1999.journalofandrology20:94-101.))對激活素a水平(>5000pg/ml)的化學(xué)當(dāng)量表明，ckd產(chǎn)生了顯著的游離激活素水平，是ckd中使得激活素a成為循環(huán)因子的病理事件。

9.4.2.3ckd中的主動脈內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變

ckd的第三個實驗?zāi)Ｐ陀糜谶@些研究中。gnz小鼠被用于細(xì)胞譜系追蹤(stoller,j.z.,etal.,2008.genesis(newyork,n.y.:2000)46:200-204.)，一旦上游loxp側(cè)翼的stop序列被移除，gnz小鼠表達(dá)核定位的綠色熒光蛋白和β半乳糖苷酶(gfp/lacz)(附圖14a)。為了除去gnz小鼠中的loxp位點，它們與在酪氨酸激酶tek(tie2)啟動子/增強子的指導(dǎo)下表達(dá)cre重組酶的tek-cre繁育。由于tie2是內(nèi)皮譜系特異性血管生成素受體，gnz/tek-cre+小鼠在內(nèi)皮譜系細(xì)胞中表達(dá)核的和細(xì)胞質(zhì)的gfp(附圖14a)(moore-morris,t.,etal.,2014.thejournalofclinicalinvestigation124:2921-2934.)。在gnz/tek-cre+小鼠中，與核dapi染色共同定位的主動脈gfp限于用cd31生物標(biāo)記物標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞(附圖14b，見箭頭)。當(dāng)在gnz/tek-cre+小鼠中產(chǎn)生ckd-3時，除了內(nèi)皮細(xì)胞之外，主動脈中層和外膜中的細(xì)胞顯現(xiàn)gfp染色，顯示了這些細(xì)胞通過內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(enmt)來源于內(nèi)皮譜系(附圖14c、14d，見箭頭)。為了進(jìn)一步分析ckd是否刺激enmt，在自發(fā)性ckd的模型、alports’s綜合征小鼠中檢查了涉及enmt的轉(zhuǎn)錄因子snai1的表達(dá)。在ckd的過程中snai1在早期是被上調(diào)的(75doa)(附圖14e)，與峰值激活素水平的時機一致(見下文)。

9.4.2.4ckd中抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的血管作用

使用配體陷阱(附圖23a)，其包含與igg1的fc結(jié)構(gòu)域融合的actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(在此稱為mactriia-fc)。附圖23b描繪了在血管鈣化模型中使用mactriia-fc的實驗設(shè)計，使用一治療方案，其容許在研究mactriia-fc之前八周發(fā)生ckd-3刺激的血管鈣化。使用這一方案，用actriia配體陷阱治療ckd-3小鼠降低了ldlr-/-高脂肪飼喂ckd-3小鼠中ckd-3刺激的主動脈runx2表達(dá)和主動脈堿性磷酸酶(alp)表達(dá)(附圖25a)。runx2和alp表達(dá)都代表了actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能的下游效應(yīng)，主動脈中成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變的生物標(biāo)記物被mactriia-fc治療逆轉(zhuǎn)。主動脈平滑肌22α(sm22-alpha)，一種分化的血管平滑肌細(xì)胞的生物標(biāo)記物，被ckd-3降低，被mactriia-fc刺激。ckd-3引起降低的主動脈心肌素(myocd)表達(dá)，是血管平滑肌細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，但是心肌素不受mactriia-fc治療的影響。相比腎臟，已與血管鈣化相關(guān)聯(lián)的(lim,k.,etal.,2012.circulation125:2243-2255.)主動脈klotho表達(dá)是極低的(數(shù)據(jù)未顯示)。就附圖25a中ckd-3和mactriia-fc治療對mrna的主動脈蛋白質(zhì)水平的影響而言，ckd提高主動脈runx2水平，mactriia-fc歸一化主動脈runx2水平(附圖25b)。ckd降低alpha平滑肌肌動蛋白(αsma)的主動脈水平，這是分化的血管平滑肌細(xì)胞的另一種生物標(biāo)記物，mactriia-fc治療提高αsma的主動脈水平(附圖25b)。心肌素水平不被ckd或mactriia-fc治療改變。

9.4.2.5降低的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對血管鈣化的影響

血管鈣化的ckd刺激在動脈粥樣硬化和2型糖尿病的模型中研究(al-aly,z.,etal.,2007.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology27:2589-2596；towler,d.a.,etal.,1998.journalofbiologicalchemistry273:30427-30434.)，患有消融性ckd的ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠，如上文所描述的。在ckd-3溶媒治療的小鼠(ckd-3v)中ckd-3引起主動脈粥樣斑中鈣沉積的積累(附圖15a)，其在用mactriia-fc治療的ckd-3小鼠(ckd-3r)中不存在，主動脈組織鈣含量降低到野生型小鼠中觀察到的水平，顯著低于開始mactriia-fc治療之時表現(xiàn)的水平，ckd-3(附圖15b)。

9.4.2.6降低的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對ckd刺激的心臟疾病的影響

在血管鈣化模型中研究心臟疾病的ckd刺激。ckd-3v小鼠具有提高的心臟重量，其被mactriia-fc治療逆轉(zhuǎn)(附圖16a)，但是不被碳酸鑭治療(ckd-3l(fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763.))逆轉(zhuǎn)，ckd-3v誘導(dǎo)輕微的心臟肥大(附圖16b)。然而，雖然沒有心臟纖維化的證據(jù)(附圖16c)，存在肌細(xì)胞過度生長的證據(jù)，其被mactriia-fc治療逆轉(zhuǎn)。

由于ckd中血管鈣化和心臟肥大相關(guān)性的一種機制是大動脈硬化，使用早先報道的方法(wagenseil,j.e.,etal.,2009.circulationresearch104:1217-1224；wagenseil,j.e.,etal.,2005.ajp-heartandcirculatoryphysiology289:h1209-h1217.)測量了血管硬化和血壓。ldlr-/-高脂肪飼喂動脈粥樣硬化的小鼠中的ckd-3不產(chǎn)生頸動脈或主動脈的血管硬化(附圖19a和19b)或血壓升高(表12)。此外，在不存在提高的硬化的情況下，在用針對dkk1的中和抗體(fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763.)治療的ckd-3小鼠中的dkk1中和對于主動脈硬化沒有作用。

表12.28周齡小鼠的生理學(xué)心血管參數(shù)

sbp＝收縮壓，dbp＝舒張壓。值表示為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤。每組n＝4-6只小鼠。

9.4.2.7主動脈和腎臟中的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與腎臟纖維化

通過tgfβ超家族的典型的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及結(jié)合ii型受體的配體活化它們的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性并刺激i型受體、alk激酶的締合與磷酸化(參見附圖20中的示意圖)。存在七種alk激酶被tgfβ超家族利用，alk4(actrib)是最常與激活素/actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的i型受體(abey,etal.,2004.growthfactors(chur,switzerland)22:105-110.)。在來自ckd-3小鼠模型的腎臟組織勻漿中，alk4磷酸化沒有提高，與早先的研究一致(antsiferova,m.,andwerner,s.2012.journalofcellscience125:3929-3937.)(附圖18a)。相比之下，phosphosmad2被ckd-3提高，被mactriia-fc降低(附圖18a)，表明另一種alk受體在ckd中腎臟激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。在由間質(zhì)性腎炎的患病的ckd-3腎臟中，col1a1被上調(diào)，mactriia-fc降低了col1a1水平(附圖18a)，與由mactriia-fc誘導(dǎo)的phosphosmad2降低一致。此外，在ckd-3v小鼠中誘導(dǎo)的腎臟klotho表達(dá)方面存在較大的降低，其被mactriia-fc矯正(附圖18b)。結(jié)果，分析了在ckd-3v中表達(dá)激活素的腎臟區(qū)室，鑒定出在管周肌成纖維細(xì)胞中的重表達(dá)，而不在上皮中表達(dá)。

在主動脈平滑肌中，檢測出alk4和alk1(附圖18a)，而沒有alk5或alk2。alk4和alk1的水平不受ckd-3的影響。然而，ckd-3不提高主動脈phosphosmad2/3水平，mactriia-fc也不降低它們(附圖18a)。然而，非經(jīng)典actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分析(附圖20)表明，map激酶(phosphoerk1/2)既不被ckd活化也不受mactriia-fc抑制，p38和jnk的血管平滑肌水平是非常低的。主動脈actin2水平也是非常低的，其不是ckd-3刺激的。axin2是典型的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物。然而，由于dkk1是典型的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄靶點，分析了腎臟和主動脈中的dkk1水平作為wnt活性的生物標(biāo)志物，表明在ckd-3小鼠中mactriia-fc治療降低了腎臟dkk1水平(附圖18c)，產(chǎn)生血漿dkk1水平的顯著降低(附圖18c)。此外，主動脈dkk1水平被ckd-3提高，被mactriia-fc抑制(附圖18c)。這表明腎臟和血管平滑肌的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及dkk1的全身性釋放受到激活素抑制的抑制。因而，ckd中升高的循環(huán)激活素通過提高的血管actriia發(fā)信號，活化wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并刺激動脈粥樣硬化性鈣化。

9.4.2.8臨床前研究向人類病理生理學(xué)和臨床的轉(zhuǎn)變

如附圖19中所示，與健康對照相比，血清激活素水平在患有3期ckd的患者群組中提高。

9.4.3結(jié)論

這個實施例表明，激活素是涉及腎臟修復(fù)的第二種因子，其在ckd期間在循環(huán)中提高。不受理論的限制，結(jié)果表明，激活素表達(dá)在患病腎臟中提高，被釋放到循環(huán)中，并刺激主動脈血管平滑肌去分化和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，這受到內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的促進(jìn)，這些作用導(dǎo)致ckd刺激的動脈粥樣硬化性鈣化和心臟肥大。ckd上調(diào)了肌成纖維細(xì)胞中的腎臟激活素表達(dá)，通過提高腎臟纖維化刺激腎臟疾病的發(fā)展。抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了主動脈中的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和動脈粥樣硬化性鈣化。抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了心臟肥大和腎臟纖維化。actriia配體陷阱mactriia-fc對早期ckd-mbd綜合征的作用類似于ckd刺激的血管鈣化中針對dkk1的單克隆抗體的作用(fang,y.,etal.,2014.jamsocnephrol25:1760-1763.)。這些數(shù)據(jù)表明，在患病腎臟中抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低了wnt活化和循環(huán)wnt抑制劑。此外，在血管平滑肌中，激活素刺激了wnt活性，其受到mactriia-fc的抑制。因而，兩種腎臟發(fā)育因子wnts和激活素激活素的重激活在ckd中產(chǎn)生了循環(huán)wnt抑制劑和激活素，引起血管和心臟疾病。這是腎臟疾病直接導(dǎo)致心血管疾病的證明，腎病過程的考慮不能與腎臟修復(fù)和后續(xù)的心血管疾病刺激相分離。

進(jìn)一步的，這個實施例表明，腎臟的激活素表達(dá)在三種慢性腎病模型中提高，產(chǎn)生了提高的循環(huán)激活素，其超過了循環(huán)中激活素抑制劑的水平。循環(huán)激活素刺激了通過actriia受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生主動脈血管平滑肌去分化、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和動脈粥樣硬化斑塊的鈣化。這些效應(yīng)是由于循環(huán)激活素，得到了主動脈中不存在提高的激活素蛋白質(zhì)水平、而ckd誘導(dǎo)提高的主動脈激活素mrna的支持(附圖13b)。不受理論的限制，這些數(shù)據(jù)表明，血管的激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過腎臟的內(nèi)分泌性激活素產(chǎn)生而被ckd刺激。

由于enmt是smad介導(dǎo)的過程(cooley,b.c.,etal.,2014.sciencetranslationalmedicine6:227ra234.)，被tgfβ超家族的成員，包括tgfβ、骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)、激活素/抑制素以及生長與分化因子(gdf)活化(piek,e.,etal.,1999.thefasebjournal13:2105-2124.)，分析了患有ckd-3的血管鈣化模型的主動脈中tgfβ超家族的ii型受體水平的改變，其是受體的配體結(jié)合部件。激活素iia型受體(actriia)在主動脈血管平滑肌中被上調(diào)。施用與igg1的fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白中的actriia細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(mactriia-fc)表明，抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生了在ckd刺激動脈粥樣硬化模型中主動脈平滑肌細(xì)胞中成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變的抑制，血管平滑肌細(xì)胞基因表達(dá)的刺激，以及主動脈鈣化的逆轉(zhuǎn)。此外，ckd刺激了譜系跟蹤小鼠模型中的enmt。然而，激活素功能的主要位點看起來在血管平滑肌中，在此actriia表達(dá)提高。

心臟肥大，特別是左室性的，在ckd中是高度普遍的(moran,a.,etal.,2008.americanjournalofkidneydiseases52:839-848；park,m.,etal.,2012.journaloftheamericansocietyofnephrology23:1725-1734.)。此外，動脈粥樣硬化性血管鈣化模型的特征在于心臟肥大(附圖16)。然而，模型中心臟肥大的產(chǎn)生在機制上不同于ckd刺激的血管硬化(townsend,r.r.2015.currentopinioninnephrologyandhypertension24:47-5310.1097/mnh.0000000000000086；merx,m.w.,etal.,2005.journaloftheamericansocietyofnephrology16:3357-3364.)、高血壓和心臟再成型中的常見范式，高血壓和心臟再成型，因為動脈粥樣硬化的ckd-3小鼠(ldlr-/-高脂肪飼喂的糖尿病小鼠)不展現(xiàn)血管硬化也不展現(xiàn)高血壓。由于mactriia-fc在不存在fgf23水平改變的情況下矯正了心臟肥大(附圖19)，ckd-3小鼠中的心臟肥大不太可能是由于fgf23(faul,c.,etal.,2011.jclininvest121:4393-4408.)。

總之，不受理論的限制，這個實施例表明，涉及腎臟修復(fù)的第二種因子在ckd期間在循環(huán)中提高，并引起心血管疾病。不受理論的限制，該實施例表明，激活素表達(dá)在患病腎臟中提高，被釋放到循環(huán)中，并刺激主動脈血管平滑肌去分化和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，這受到內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的促進(jìn)，這些作用導(dǎo)致ckd刺激的動脈粥樣硬化性鈣化和心臟肥大。ckd上調(diào)了肌成纖維細(xì)胞中的腎臟激活素表達(dá)，通過提高腎臟纖維化刺激腎臟疾病的發(fā)展。抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了主動脈中的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和動脈粥樣硬化性鈣化。抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了心臟肥大和腎臟纖維化。actriia配體陷阱mactriia-fc對早期ckd-mbd綜合征的影響顯示，抑制患病腎臟中的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低了wnt活化和循環(huán)wnt抑制劑。因而，不受理論的限制，兩種腎臟發(fā)育因子wnts和激活素的重激活在ckd中產(chǎn)生了循環(huán)wnt抑制劑和激活素；因而，腎臟疾病引起心血管疾病。

9.5實施例5：腎臟損傷/修復(fù)通過全身性wnt抑制和激活素刺激血管疾病

9.5.1背景

這個實施例中呈現(xiàn)的結(jié)果涉及實施例4中呈現(xiàn)的結(jié)果(章節(jié)9.4)。

通過在腎臟修復(fù)期間產(chǎn)生全身性wnt抑制和激活素分泌，腎臟疾病導(dǎo)致動脈粥樣硬化性血管鈣化。慢性腎病(ckd)的血管效應(yīng)是wnt抑制與激活素誘導(dǎo)的激活素受體功能調(diào)節(jié)的相互作用。

9.5.2方法

具有升高的wnt抑制劑特別是dkk1的ckd和激活素在譜系跟蹤和血管鈣化的小鼠模型中誘導(dǎo)，容許在alport’s小鼠中自發(fā)地發(fā)展。激活素、dkk1、激活素2a型受體(actriia)、phosphosmad2/3和膠原蛋白水平通過elisa、rt-pcr和western印跡來測量。血管平滑肌功能通過壓力誘導(dǎo)的動脈擴張術(shù)來測量。在繁育成內(nèi)皮特異性tie2-cre小鼠的rosa-tdt小鼠中進(jìn)行細(xì)胞譜系跟蹤。攜帶rosa--tdt的小鼠在攜帶cre重組酶的細(xì)胞中表達(dá)蕃茄紅。mactriia-fc是指激活素a配體陷阱(參見，例如，美國專利no.8,173,601和carrancioetal.,2014,britishjournalofhaematology,165:870-882)。

9.5.3結(jié)果

ckd提高循環(huán)dkk1和激活素水平。在患病腎臟中，激活素在肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)，通過phosphosmad3的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被提高。在患病腎臟中，actriia配體陷阱mactriia-fc抑制了腎臟的psmad3、col1a1表達(dá)、尿蛋白水平和dkk1水平，并提高了klotho水平。在血管系統(tǒng)中，actriia水平和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到ckd的損害，伴隨降低的血管平滑肌分化和功能。在ckd小鼠血管系統(tǒng)中，mactriia-fc提高了血管平滑肌細(xì)胞分化，并抑制成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和血管鈣化。在循環(huán)中，mactriia-fc降低dkk1水平。對比具有正常腎臟功能的tek-cre/rosa-tdt小鼠，在tek-cre/rosa-tdtckd小鼠的受損的股骨動脈的外膜的細(xì)胞中ckd誘導(dǎo)蕃茄紅表達(dá)，其中番茄紅限于股動脈內(nèi)皮，表明在血管損傷期間ckd誘導(dǎo)tie2陽性細(xì)胞。

9.5.4結(jié)論

ckd降低血管平滑肌功能并刺激成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和血管鈣化。使用mactriia-fc降低ckd中升高的激活素的作用，抑制了smad依賴性腎臟纖維化，阻斷了主動脈成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，提高了血管平滑肌分化，并降低了血管鈣化。

9.6實施例6：在ckd-mbd的腎性骨營養(yǎng)不良的病理中激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用

9.6.1.1引言

慢性腎病-礦物質(zhì)/骨失調(diào)(ckd-mbd)包括血管鈣化和骨營養(yǎng)不良。ckd提高循環(huán)激活素(tgfβ超家族的配體)和激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(附圖21a)。用激活素iia型受體(actriia)配體陷阱(mactriia-fc)抑制actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了血管鈣化并防止心臟肥大。這個實施例表明激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腎性骨營養(yǎng)不良的病理中的作用。

9.6.1.2方法

假操作的ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠(sham；n＝12)顯現(xiàn)糖尿病和高膽固醇血癥。具有高磷酸血癥、升高的fgf-23和腎小球過濾率60％降低的ckd(ckd-3)通過在ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中在14周齡的5/6腎切除術(shù)來誘導(dǎo)，是動脈粥樣硬化性血管鈣化的模型。ckd-3小鼠用mactriia-fc10mg/kg(mactriia-fc；n＝15)或溶媒(veh；n＝13)治療，在22周齡開始每周腹膜內(nèi)注射，在28周通過骨組織形態(tài)學(xué)和微計算機斷層掃描來研究。ckd-3的結(jié)果與野生型(wt；n＝5)小鼠和sham比較。

9.6.2結(jié)果

相對于wt(松質(zhì)骨體積/組織體積(bv/tv)：12.90％)，sham小鼠展現(xiàn)了與衰弱性骨疾病相關(guān)的降低的bv/tv(10.92％)ckd-3的誘導(dǎo)在veh小鼠中導(dǎo)致高周轉(zhuǎn)骨疾病，和更低的bv/tv(11.22％)；這被六周的mactriia-fc治療逆轉(zhuǎn)(13.28％)。ckd-3的誘導(dǎo)引起小梁厚度降低，這被6周的mactriia-fc治療逆轉(zhuǎn)。ckd-3veh治療的小鼠展現(xiàn)了更高的侵蝕表明/骨表面和更高的破骨細(xì)胞數(shù)量/100mm骨長度(分別為1.83％和62.32/100mm)，相比sham(1.05％和33.40/100mm)，這被mactriia-fcmactriia-fc緩解(1.23％和38.37/100mm)。當(dāng)與wt或sham(分別為附圖21b和21c)相比時，ckd-3veh治療的小鼠還導(dǎo)致更高的成骨細(xì)胞表面/骨表面和更高的成骨細(xì)胞數(shù)量/100mm骨長度(分別為1.58％和110.63/100mm；p<0.05)。與veh相比，mactriia-fc顯著地降低成骨細(xì)胞表面/骨表面和成骨細(xì)胞數(shù)量/100mm骨長度(0.68％和43.18/100mm；p<0.05)。盡管相對于veh在成骨細(xì)胞數(shù)量方面明顯降低，用mactriia-fc治療的礦物質(zhì)合并率被維持(分別為0.42和0.40μm³/天)，伴有顯著更高的骨形成率/成骨細(xì)胞(分別為0.17vs.0.48μm³/100個細(xì)胞/年；p<0.05vs.veh)，這類似于wt(0.42μm³/100個細(xì)胞/年)(附圖21d)。

表13.組織形態(tài)學(xué)結(jié)果(平均+sem)

sem＝平均標(biāo)準(zhǔn)誤

mactriia-fc不影響高磷酸血癥和fgf-23水平。

9.6.3結(jié)論

提高的循環(huán)激活素促進(jìn)了與ckd-3相關(guān)的高周轉(zhuǎn)骨營養(yǎng)不良。用actriia配體陷阱mactriia-fc抑制激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過抑制骨吸收和歸一化礦物質(zhì)合并率以及骨形成率/成骨細(xì)胞、對抗ckd的負(fù)面效果，提高了ckd-3中的骨體積。

9.7實施例7：在用逐步升高的hactriia-fc劑量水平治療的血液透析對象中對骨質(zhì)量和腹部主動脈血管鈣化的定量計算機斷層掃描結(jié)果

9.7.1引言

高周轉(zhuǎn)腎性骨營養(yǎng)不良的標(biāo)志是降低的皮層骨質(zhì)量和提高的小梁骨質(zhì)量，引起骨折風(fēng)險提高。根據(jù)體外數(shù)據(jù)，激活素ii型受體-igg1融合蛋白hactriia-fc阻斷了激活素a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以降低破骨細(xì)胞發(fā)生，促進(jìn)骨中的成骨細(xì)胞成熟。使用定量計算機斷層掃描(qct)在血液透析(hd)的對象中當(dāng)前的分析評估了hactriia-fc對骨礦物密度(bmd)和腹部主動脈血管鈣化的影響。

9.7.2方法

在用于矯正貧血的hd的對象中對hactriia-fc的研究中，促紅細(xì)胞生成素刺激劑(esa)響應(yīng)性的對象被洗出他們的esa效應(yīng)直到血紅蛋白(hb)<10g/dl，任何隨機化到每28天皮下施用直到8個劑量周期的hactriia-fc0.3mg/kg(n＝9)、0.5mg/kg(n＝8)、0.7mg/kg(n＝9；7例完成，2例進(jìn)行中)或安慰劑(pbo；n＝9)中。利用14天劑量周期的劑量組是當(dāng)前參與的。評估對象的對hb、安全性參數(shù)、bmd、血管鈣化和骨周轉(zhuǎn)的生物標(biāo)記物的影響。治療失敗(hb<9g/dl)用esa/輸血來挽救。在基線和225天的治療期之后獲得髖部、腰脊椎和腹主動脈的qct掃描。

9.7.3結(jié)果

在該項研究中被隨機化的35名對象中，20名具有成對的qct評估(pbo:n＝3；0.3mg/kg:n＝6；0.5mg/kg:n＝5和0.7mg/kg:n＝6)。一些具有成對的qct的對象由于治療失敗而對hactriia-fc的暴露有限。表14展現(xiàn)了pbo和每個hactriia-fc劑量組的bmd和血管鈣化結(jié)果。與pbo相比，hactriia-fc看起來緩解了高周轉(zhuǎn)腎性骨營養(yǎng)不良對皮層和小梁bmd的影響，并減慢了血管鈣化的發(fā)展。

表14

cfb＝距基線改變。

9.7.4結(jié)論

這些數(shù)據(jù)表明，hactriia-fc以劑量依賴性的方式逆轉(zhuǎn)了高周轉(zhuǎn)腎性骨營養(yǎng)不良對皮層和小梁骨的影響，減慢了血管鈣化的發(fā)展。

9.8實施例8.用逐步升高的actriia-hfc(seqidno：7；“sotatercept”)劑量水平治療的血液透析對象中骨質(zhì)量和腹部主動脈血管鈣化的定量計算機斷層掃描結(jié)果

9.8.1引言

參見實施例6(章節(jié)9.7)的引言(章節(jié)9.7.1)和方法(章節(jié)9.7.2)。這個實施例呈現(xiàn)了在研究的較晚時間獲得的、實施例6(章節(jié)9.7)中進(jìn)行的研究的其他數(shù)據(jù)。

9.8.2結(jié)果

總共35名對象進(jìn)行隨機化，接受至少一劑的安慰劑或actriia-hfc(seqidno：7；“sotatercept”)，如表15中標(biāo)明的。

表15.隨機化的對象和qct分析子集合

對象分布在附圖22a中描繪，包括在基線和225天有成對的qct測量的對象。停止研究治療的大多數(shù)對象具有需要挽救的治療識別，一般是因為血紅蛋白濃度低于9g/dl。停止研究治療的大多數(shù)對象接受了安慰劑或0.3mg/kg的sotatercept。沒有對象因為有害事件停止治療。進(jìn)一步的，在具有成對的qct測量的21名對象中，12名由于在治療期內(nèi)的血紅蛋白治療失敗而需要挽救治療，需要挽救的人中的9人處于前3個劑量周期內(nèi)。

在具有成對的qct測量的對象中，基線的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征在治療組之間是一般相似的(表16)。然而，在安慰劑組中存在著實質(zhì)上更久的在透析時間，這也是最年輕的組。在基線生物標(biāo)記物和agatston得分方面各組之間也存在差異(表17)。

表16.具有成對的qct測量的對象的基線人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征

*對象可以接受多種類型的結(jié)合劑

表17.具有成對的qct測量的對象的平均基線生物標(biāo)記物、體積bmd和agatston得分

注意:n反映了具有成對的qct評定的隨機化對象的數(shù)量；對每個參數(shù)可用的對象的實際數(shù)量可能變化。pth＝甲狀旁腺激素。

^a骨＝特異性堿性磷酸酶(bsap)參考范圍：男性，6-30；女性(絕經(jīng)前)，3-19；女性(絕經(jīng)后)，6-26。

^b1型前膠原n-原肽(p1np)參考范圍：男性，30-110；女性20-108

^cc-末端端肽(ctx)參考范圍：男性，0-854，女性(絕經(jīng)前)，26-573；女性(絕經(jīng)后)，104-1,008

^d更低的agatston得分表明更低水平的血管鈣化。

嚴(yán)重有害事件一般被認(rèn)為是與sotatercept不相關(guān)的，不引起停止，由繼續(xù)治療來解決。在sotatercept治療組中沒有報告死亡。有害事件在嚴(yán)重度上大多數(shù)是輕微的或中度的，與研究藥物不相關(guān)，在治療組之間是相對相似的，一般與對象的醫(yī)學(xué)史一致。在前28天的劑量周期中和在225天治療期期間，在任何治療組的對象中，家庭血壓測量值沒有顯示距基線的一致性或劑量依賴性的改變。

腹主動脈總計agatston得分的距基線改變在表18中提供。在腹主動脈總計agatston得分方面有<15％進(jìn)展的對象的比例在附圖22b中顯示。

表18.在腹主動脈總計agatston得分和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分方面的基線和距基線改變*

注意:n反映了具有成對的qct評定的隨機化對象的數(shù)量；對每個參數(shù)可用的對象的實際數(shù)量可能變化。

*更低的總計agatston和平方根轉(zhuǎn)化的總體積得分表明低水平的血管鈣化。

進(jìn)一步的，表19提供了股骨頸部皮層和平均腰脊椎小梁體積bmd測量的距基線改變百分比。分析了在股骨頸部皮層bmd中具有>2％增進(jìn)的對象的比例，確定了用sotatercept治療與股骨頸部皮層骨的≥2％提高的對象的比例提高相關(guān)(參見表19和附圖22c)。還參見mallucheetal.,2014,clin.j.am.soc.nephrol.,9:1254-1262。此外，在高周轉(zhuǎn)rod中，相比一般群體，通過腰椎小梁bmd測量的，小梁骨質(zhì)量提高(即，不良質(zhì)量的骨)，在eskd中在椎骨骨折率上沒有降低(參見，leonardmb,2009,semin.nephrol.,29:133-143,和duanetal.,1999,j.clin.endocrinol.metab.84:718-722)。在這個場景中，提高的小梁骨質(zhì)量是品質(zhì)不良的(參見mallucheetal,2012,j.am.soc.nephrol.23:525-532。用sotatercept治療減慢了腰椎中小梁骨質(zhì)量的提高(表19)。

表19.股骨頸部皮層和平均腰椎(l1、l2)小梁bmd的基線和距基線改變百分比

注意：n反映了具有成對的qct評定的隨機化對象的數(shù)量；對每個參數(shù)可用的對象的實際數(shù)量可能變化。

9.8.3結(jié)論

根據(jù)基線生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)，這個實施例中的對象傾向于具有高周轉(zhuǎn)rod。安慰劑組具有降低的皮層骨質(zhì)量，提高的小梁骨質(zhì)量和提高的血管鈣化，其以與eskd中其他大研究相似的比例發(fā)生(raggietal.,2011,nephrol.dial.transplant.26:1327-1339)，如對高周轉(zhuǎn)rod所預(yù)計的。

在基線和225天(其是在達(dá)到八個28天劑量周期之后)測量的qct數(shù)據(jù)表明，用sotatercept治療高周轉(zhuǎn)rod引起了對多種ckd-mbd參數(shù)的影響，包括血管鈣化的減慢的發(fā)展，提高的股骨頸部皮層骨質(zhì)量，和腰脊椎骨質(zhì)量的減慢的提高。血管鈣化的降低和骨質(zhì)量的提高與用于血管鈣化的ldlr-/-高脂肪飼喂的、5/6腎切除術(shù)的小鼠模型中的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)是一致的(fangetal.,2014,abstract,asnkidneyweek2014,november11-16,2014,philadelphia,pa)。

9.9實施例9：actriia-hfc(seqidno：7，“sotatercept”)影響終末期腎病的多種表現(xiàn)

9.9.1背景

這個實施例呈現(xiàn)了來自臨床研究的數(shù)據(jù)。實施例7和8(章節(jié)9.7和章節(jié)9.8)也呈現(xiàn)了來自這項研究的數(shù)據(jù)。

這項進(jìn)行中的、隨機、單盲、安慰劑對照的研究評估了一種用于矯正血液透析對象的貧血的actriia-igg1融合蛋白配體陷阱actriia-hfc(seqidno：7；“sotatercept”)的藥物動力學(xué)、安全性和血紅蛋白作用，并使用定量計算機斷層掃描探索它對血管鈣化和骨礦物密度的影響。這個實施例提供了0.3、0.5和0.7mg/kg劑量組的中間的結(jié)果。

9.9.2方法

促紅細(xì)胞生成素刺激劑(esa)響應(yīng)性對象洗出esa效應(yīng)直到血紅蛋白<10g/dl，并隨機化到每28天皮下施用安慰劑或sotatercept中持續(xù)≤8個劑量周期。治療失敗(血紅蛋白<9g/dl)用esa或輸血挽救；對象內(nèi)的劑量遞增不被允許。在基線和225天的治療期之后獲得髖部、腰脊椎和腹主動脈的定量計算機斷層掃描掃描。報告的是藥物動力學(xué)、安全性、家庭血壓、血紅蛋白、血管鈣化和骨礦物密度作用的中間結(jié)果。

9.9.3結(jié)果

在用安慰劑(n＝9)或sotatercept0.3mg/kg(n＝9)、0.5mg/kg(n＝8)和0.7mg/kg(n＝9)治療的對象中，有害事件大多數(shù)是輕微/中度的，與研究藥物不相關(guān)，在各組之間在類型/嚴(yán)重度方面相對相似，一般與對象的醫(yī)學(xué)史一致。在安慰劑組中發(fā)生兩起死亡。在家庭血壓方面沒有劑量依賴性改變。在225天治療期中，在用安慰劑或sotatercept0.3、0.5或0.7mg/kg治療的對象中分別有33％、33％、63％和78％的血紅蛋白>10g/dl。在分別用安慰劑或sotatercept0.3、0.5或0.7mg/kg治療的4、6、5和6名對象中獲得的成對的定量計算機斷層照相顯示在33％、80％、80％和100％對象中有<15％的血管鈣化發(fā)展，在0％、20％、40％和75％的對象中有股骨頸部皮層骨礦物密度>2％提高。

9.9.4結(jié)論

sotatercept是耐受的，在血液透析中有可接受的安全性分布，在家庭血壓方面沒有提高。在血紅蛋白、血管鈣化和骨礦物密度方面存在著對sotatercept的劑量依賴性反應(yīng)。

9.10實施例10：ckd中失調(diào)的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)動脈粥樣硬化性鈣化和腎臟纖維化

這個實施例涉及本文的其他實施例中描述和進(jìn)行的實驗，包括實施例4。

9.10.1方法

9.10.1.1動物模型的產(chǎn)生

動脈粥樣硬化性低密度脂蛋白受體缺陷(ldlr-/-)的雄性(c57bl/6j背景)購自jackson實驗室，在12周齡開始飼喂高脂肪飲食(42％的卡路里來自脂肪)。小鼠在22周齡時是肥胖的、胰島素抗性的，在28周齡時是糖尿病的，并且是高膽固醇血癥的。

早先描述了用來產(chǎn)生慢性腎病的兩步過程(daviesmr,etal.jamsocnephrol2003；14:1559-1567；daviesmr,etal.jamsocnephrol2005；16:917-928)。電灼可以在出生后12周通過2厘米的側(cè)腹切口施用于右腎，隨后在14周齡左側(cè)進(jìn)行全腎切除術(shù)。改變燒灼的強度，以產(chǎn)生中度的(ckd-3)腎臟損傷，其通過20周齡時的菊糖清除來確認(rèn)(附圖33a、b)。對照動物接受假操作，其中暴露并移動適當(dāng)?shù)哪I臟，但不以任何其他方式處理。五組小鼠用于這項研究(附圖23b)。第一組是飼喂常規(guī)飲食的野生型c57bl/6j小鼠(wt)。這是用于標(biāo)準(zhǔn)對照值的正常腎臟功能和飲食的組。第二組是飼喂高脂肪飲食和假操作的ldlr-/-小鼠(sham)。這一組充當(dāng)對照組來確定腎臟疾病的影響。第三組是具有相當(dāng)于人ckd3期的降低的gfr、飼喂高脂肪飲食的ldlr-/-小鼠(ckd-3)，在22周安樂死，是附圖25a、b中使用的基線血管鈣化組(ckd-3)。第四組是在22周開始每周兩次接受溶媒(磷酸鹽緩沖鹽水)的皮下注射的患有ckd-3的ldlr-/-小鼠，直到第28周安樂死(ckd-3v)。第五組是在22周開始每周兩次接受10mg/kg的mactriia-fc(celgene,summit,nj)的皮下注射的患有ckd-3的ldlr-/-小鼠，直到第28周安樂死(ckd-3r)。使用的劑量是早先在pk/pd研究中顯示對于刺激骨形成有效的劑量。

使用的第二個ckd模型是x-連鎖的alport’s綜合征的鼠同族體，其在iv型膠原蛋白的α5鏈col4a5的基因中是缺陷的。(rheaultmn,etal.j.theam.soc.neph.2004；15:1466-1474)。這是自發(fā)性腎臟疾病的模型，在整個結(jié)果中使用它來確認(rèn)腎臟消融誘導(dǎo)的ckd的影響。繁育對可以購自jackson實驗室，并繁育用于實驗。半合子雄性在出生后150天自發(fā)地發(fā)展與人ckd3-4期可比較的腎臟疾病，在生命第75天發(fā)展血尿癥。

在所情況中，在麻醉下進(jìn)行安樂死。腹膜腔內(nèi)麻醉(甲苯噻嗪13mg/kg和氯胺酮87mg/kg)用于所有的過程。隱靜脈的靜脈血液樣品在第二次手術(shù)后一周采集，來評估基線的術(shù)后腎臟功能。在處死時，通過心內(nèi)穿刺采集血液，心臟和主動脈整體解剖。

9.10.1.2菊糖清除

如果安樂死在28周，在20周或26周根據(jù)廠家指導(dǎo)(biopalinc.,worcester,ma)進(jìn)行菊糖清除。

9.10.1.3化學(xué)的鈣化定量

在處死時解剖主動脈，在解剖顯微鏡下通過鈍器解剖除去所有外部的組織。組織在60℃干燥20-24小時，稱重，并用缽錘和研缽碾壓成粉末。鈣在4℃在1nhcl中洗脫24小時。根據(jù)廠家的指導(dǎo)使用甲酚酞絡(luò)合酮方法(sigma,stlouis,mo)分析洗脫物的鈣含量，結(jié)果相對干燥組織重量來校正。

9.10.1.4血液測試

通過由動物機構(gòu)進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)自動分析儀實驗室方法，在抽血當(dāng)天分析血液的血脲氮(bun)、鈣和磷酸鹽。血漿激活素(fitzgeraldindustries,acton,ma)、卵泡抑素(mybiosourceinc.,sandiego,ca)和卵泡抑素樣3(mybiosourceinc.)水平在elisa分析中測定。血清dkk1用elisa分析(r&dsystems,minn.,mn)。對于elisa分析，在安樂死時通過隱靜脈或心臟穿刺抽取血液。所有血液樣品在采集時置于冰上。血小板缺乏的edta血漿樣品通過在4℃6000rpm5分鐘和14000rpm2分鐘的2步離心來制備。樣品在-20℃或以下冷凍保存待用。

9.10.1.5組織學(xué)和免疫組織化學(xué)

主動脈和腎臟組織固定在10％中性緩沖的福爾馬林中過夜，然后轉(zhuǎn)移到4℃的70％乙醇中，包埋在石蠟中，制備5微米切片。切片在二甲苯中脫石蠟，在分級的乙醇系列中脫水，然后再水化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，masontrichome染色用于檢測腎臟和心臟纖維化，茜素紅染色用于檢測鈣化。(gregoryca,etal.analyticalbiochem.2004；329:77-84)。對于免疫染色，切片在20％正常的山羊血清中阻斷20分鐘，與初級抗體在4℃孵育過夜。切片在pbs中洗滌，在20％正常的山羊血清中阻斷20分鐘，之后與山羊抗兔alexa488次級抗體1:400(lifetechnologies,a11008)在室溫下孵育30分鐘，或根據(jù)廠家指導(dǎo)(lifetechnologies,t20932)使用tsa試劑盒用于信號放大。對于雙重免疫熒光染色，切片在20％山羊血清中阻斷，用第一初級和次級抗體以及第二初級和次級抗體連續(xù)染色，根據(jù)廠家指導(dǎo)，使用山羊抗兔alexa488和alexa568次級抗體1:400(lifetechnologies,a11008和a11011)或tsa試劑盒(lifetechnologies,t20932和t20934)用于信號放大。來自同一物種的初級抗體用于雙重染色時，在第二次染色之前切片在檸檬酸鹽緩沖液中在微波中加熱5分鐘。(tóthze,j.histochem.&cytochem.2007；55:545-554)。初級抗體用于這項研究中用于免疫染色：兔多克隆抗actriia抗體1:250(abcam,ab135634)、兔多克隆抗抑制素betaa抗體1:100(santacruz,sc-50288)、兔多克隆抗cd31抗體1:50(abcam,ab28364)和兔多克隆抗β連環(huán)蛋白抗體1:500(abcam,ab32572)。

9.10.1.6rt-pcr

使用rneasymini試劑盒(qiagen,valencia,ca)從主動脈和腎臟中提取rna。根據(jù)廠家的指導(dǎo)在verititermal循環(huán)儀(appliedbiosystems)上，1μg的總rna進(jìn)行dnase處理，使用來自bio-rad(hercules,ca)的iscriptcdna合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用vectornti(invitrogen,grandisland,ny)或primerexpress(lifetechnologies,grandisland,ny)軟件設(shè)計引物。在逆轉(zhuǎn)錄之后，使用steponeplus實時pcr儀(appliedbiosystems)、來sigma(st.louis)的sybrgreen和來自invitrogen的pcr試劑盒進(jìn)行實時。每個反應(yīng)在95℃45秒、和60℃30秒和72℃60秒一式三份進(jìn)行40個循環(huán)。隨后是熔化循環(huán)，由60℃到95℃逐步提高的溫度組成。在每個基因的解離曲線中觀察到單一優(yōu)勢峰，支持了pcr產(chǎn)物的特異性。ct數(shù)(閾值)在pcr的指數(shù)期內(nèi)設(shè)置，用于計算目標(biāo)基因的表達(dá)水平。b2m用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物，歸一化所述值。由ct對比logcdna稀釋度(相應(yīng)于log拷貝數(shù))組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過擴增與未知數(shù)量的擴增子相應(yīng)的cdna的連續(xù)稀釋物來產(chǎn)生。通過在rt-pcr之前煮沸5分鐘來確?；蚪Mdna不被擴增，通過滅活逆轉(zhuǎn)錄酶來進(jìn)行陰性對照。

9.10.1.7免疫印跡(western分析)

使用含有蛋白酶抑制劑混合物(santacruz)的ripa裂解緩沖液(thermoscientific)，從小鼠的腎臟和主動脈制備全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物蛋白.溶胞產(chǎn)物(20μg)裝載到8-12％sds-page凝膠中，用針對抑制素β-a(santacruz)、α-微管蛋白(santacruz)、actin-α平滑肌(sigma)、runx2(cellsignaling)、myocd(santacruz)、acvrl1(origene)、acvr1(cellsignaling)、erk1/2(cellsignaling)、磷酸-erk1/2(cellsignaling)、acvr1b(origene)、col1a1(santacruz)、smad2/3(cellsignaling)或磷酸-smad2/3(cellsignaling)的抗體進(jìn)行免疫印跡。免疫沉淀(ip)分析使用相同的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物蛋白。為了降低非特異性結(jié)合，使用預(yù)洗滌的蛋白a瓊脂糖珠子(cellsignaling)預(yù)先清洗樣品。預(yù)清潔的樣品與磷酸絲氨酸抗體(abcam)孵育過夜。然后在蛋白a瓊脂糖珠子上捕獲ip-抗體復(fù)合物，通過免疫印跡分析檢測蛋白質(zhì)。

使用anova進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±sd，除非附圖圖例中另外指定。在使用fisherlsd法之后評估各組之間的差異，p<0.05認(rèn)為是顯著的。所有組的數(shù)據(jù)有7-15的“n”。對于實時pcr分析，每個實驗組中使用最少3個樣品。對于附圖26c中的血管鈣化數(shù)據(jù)，方框代表中值和百分位范圍(25th到75th百分位數(shù))，誤差線代表低于25th和高于75th百分位數(shù)的百分位范圍的1.5倍。使用用于多重比較的anovaholm-sidak方法比較中值，p<0.05作為顯著差異的臨界水平。

9.10.2結(jié)果

9.10.2.1實驗設(shè)計，以及ckd模型中的腎臟

高脂肪飼喂的ldlr-/-小鼠是動脈粥樣硬化性血管鈣化的模型，需要飲食和基因型兩者來產(chǎn)生動脈粥樣硬化性血管鈣化。(daviesmr,etal.jamsocnephrol2003；14:1559-1567；towlerda,etal.j.biologicalchem.1998；273:30427-30434)。通過腎臟皮層損傷和對側(cè)腎切除，在ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中腎臟功能類似于人3期ckd(ckd-3)降低(附圖33a、b)。ckd-3小鼠是高磷酸鹽血的(表20)，這與人3b-4期ckd中的高磷酸血癥發(fā)作一致。(isakovat,etal.kidneyint2011；79:1370-1378)。

表20:測試的動物中的血清生化參數(shù)

*:<0.05，與組2比較的組3和4。

9.10.2.2ckd中的iia型激活素受體(actriia)水平

分析來自患有ckd-3的高脂肪飼喂ldlr-/-小鼠的主動脈中的tgfβ超家族ii型受體，它們是由ii型和i型(alk)受體組成的超家族受體雜多聚物的一個配體結(jié)合部件。激活素ii型受體a(actriia)在主動脈血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)中表達(dá)(附圖24a、b)。ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠中產(chǎn)生的ckd-3誘導(dǎo)主動脈中的actriia被下調(diào)(附圖24a)。不受任何特定理論的限制，這與其他組織中報告的高循環(huán)配體水平產(chǎn)生的actriia內(nèi)在化和降解一致。(simonend,etal.endocrinology1998；139:1147-1155；liuzh,etal.j.endocrinology2006；189:409-421).通過免疫化學(xué)和免疫熒光檢測沒有檢出內(nèi)皮細(xì)胞actriia(附圖24b)。

9.10.2.3ckd中actriia配體陷阱的血管作用

在用溶媒或actriia配體陷阱(mactriia-fc)治療的ckd-3小鼠的主動脈組織勻漿中分析ckd誘導(dǎo)的actriia水平抑制的影響(附圖25a、b)。通過ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠的主動脈中runx2和堿性磷酸酶(alpl)的mrna表達(dá)來評估ckd-3刺激的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變。ckd-3刺激了它們的表達(dá)，mactriia-fc治療逆轉(zhuǎn)了ckd的影響(附圖25a)。runx2和alpl表達(dá)都代表了主動脈中成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變的生物標(biāo)記物，其被mactriia-fc治療逆轉(zhuǎn)。主動脈的平滑肌22α或轉(zhuǎn)膠蛋白(tagln)的mrna，分化血管平滑肌細(xì)胞的生物標(biāo)志物(lil,miano,etal.circulationres.1996；78:188-195)，被ckd-3降低，并被mactriia-fc刺激。ckd-3還引起降低的主動脈心肌素(myocd)mrna表達(dá)，其是血管平滑肌細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，但是心肌素不受mactriia-fc治療的影響。就ckd-3和mactriia-fc治療對附圖25a中研究的相應(yīng)mrna的主動脈蛋白質(zhì)水平的影響而言，ckd提高主動脈runx2和alpl水平，mactriia-fc歸一化它們(附圖25b，alpl的數(shù)據(jù)未顯示)。ckd降低tagln和alpha平滑肌肌動蛋白(αsma)的主動脈水平，其是分化的血管平滑肌細(xì)胞的另一種生物標(biāo)志物，mactriia-fc治療提高它們它們(附圖25b，tagln的數(shù)據(jù)未顯示)。心肌素水平不被ckd或mactriia-fc治療改變。

ldlr-/-高脂肪飼喂小鼠是動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化性鈣化和2型糖尿病的模型。(al-alyz,etal.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiol.2007；27:2589-2596；towlerda,etal.j.biologicalchem.1998；273:30427-30434)。鑒定出的，特別是，ckd-3引起ckd-3溶媒治療的小鼠(ckd-3v)的主動脈粥樣斑中鈣沉積的積累(附圖26a)，并提高總組織鈣水平(附圖26b)。在用mactriia-fc治療的ckd-3小鼠(ckd-3mactriia-fc)中不存在可見的鈣沉積。此外，，mactriia-fc將主動脈組織鈣含量降低到如同野生型和sham小鼠中觀察到的水平，以及比ckd-3組中mactriia-fc治療開始時表現(xiàn)的水平顯著低的水平(附圖26b)。

9.10.2.4主動脈中的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

tgfβ超家族的典型的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及結(jié)合ii型受體的配體活化它們的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性并刺激i型受體alk激酶的締合與磷酸化(參見附圖34中的示意圖)。存在七種被tgfβ超家族利用的alk激酶，alk4(actrib)是與actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最常相關(guān)的i型受體。(abeymt,etal.growthfactors(chur,switzerland)2004；22:105-110)。如附圖24中證明的，在從ckd-3小鼠分離的主動脈組織勻漿中actriia沒有降低，并且與alk4和alk1的降低的組織水平不相關(guān)(附圖27a)。與actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的其他1型受體，alk5和alk2是不可檢測的。通過測量受體雜多聚化效應(yīng)(例如，調(diào)節(jié)性smads的磷酸化)來評估actriia活性。ckd-3降低主動脈phosphosmad2/3水平(活化的smad2/3)，mactriia-fc相比ckd-3v提高它們(附圖27a、b)。還分析了非經(jīng)典的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(附圖34)：(1)map激酶(磷酸-erk1/2)被ckd降低，沒有進(jìn)一步受到mactriia-fc的影響(附圖27a)，(2)p38和jnk的血管平滑肌水平是非常低的。并且，mactriia-fcp-akt水平保持不受影響，表明主動脈akt/pi3激酶不受actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。主動脈actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(phosphosmad3)被ckd降低，被與actriia配體陷阱在動脈粥樣硬化性主動脈中抑制成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變相關(guān)的actriia配體陷阱刺激(附圖25a、b、c)。

檢查了另一種非典型的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，wnt途徑(附圖34)。wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)顯現(xiàn)了在主動脈內(nèi)皮和vsmc之間的差異性調(diào)節(jié)。主要的典型wnt誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子主動脈β-連環(huán)蛋白被免疫熒光定位至內(nèi)皮細(xì)胞，在vsmc中是不可檢測的(附圖28a、b)。分析了vsmc中的dkk1水平作為wnt活性的生物標(biāo)志物。在ckd-3小鼠中，ckd提高vsmcdkk1水平，mactriia-fc治療降低dkk1水平(附圖28d)。主動脈dkk1水平被mactriia-fc降低表明血管平滑肌wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到actriia配體陷阱的抑制。此外，如下文顯示的actriia配體陷阱降低腎臟wnt活性的效應(yīng)引起了循環(huán)dkk1水平的較大的降低(附圖28e)。全身性dkk1的降低最有可能影響內(nèi)皮。這引起內(nèi)皮中提高的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中beta-連環(huán)蛋白被表達(dá)，如主動脈axin2水平的提高或顯示的(附圖28c)。axin2是beta-連環(huán)蛋白刺激的即時早期基因，常用于評估wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。(maoj,wangj,liub,etal.mol.cell2001；7:801-809)。

9.10.2.5actriia配體陷阱對αklotho和腎臟actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

檢查了腎臟αklotho水平以及ckd-3和mactriia-fc治療的影響。如附圖29a所示，mactriia-fc治療誘導(dǎo)了腎臟αklotho水平的顯著提高。檢查了腎臟actriia水平和actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。腎臟actriia水平不受ckd-3的影響(附圖29b)。主要的actriia配體，激活素a，在ckd-3小鼠中被強烈地誘導(dǎo)，被mactriia-fc治療抑制(附圖31a-d)。缺少可以的磷酸-alk抗體影響了i型受體活化的檢測，作為替代需要磷酸絲氨酸抗體來免疫沉淀。用抗alk抗體進(jìn)行沉淀的免疫印跡。在ckd-3模型的患病腎臟中或通過mactriia-fcmactriia-fc治療，alk4磷酸化沒有顯著改變(附圖29b)。然而，腎臟的phosphosmad2/3被ckd-3提高，被mactriia-fc降低，表明在ckd通過actriia的介導(dǎo)中腎臟smad2/3活化的部件涉及不同于alk4的alk(附圖29c)。

檢測了actriia配體陷阱對腎臟纖維化的影響。附圖30a-d顯示了相比ckd-3v治療的小鼠(附圖30a和附圖30b)，在來自ckd-3mactriia-fc治療的小鼠三色染色的腎臟皮層切片中(附圖30c和附圖30d)降低的腎臟纖維化。附圖35a-d顯示了低放大率的冠狀的腎臟切片，箭頭指出了在附圖30a-d中采集高功率切片的位置，箭頭頭部描繪了來自電灼腎臟損傷的瘢痕反應(yīng)。mactriia-fc降低了瘢痕反應(yīng)，與激活素在傷口愈合中的作用一致。此外，mactriia-fc降低了ckd-3刺激的蛋白尿(附圖30e)，與mactriia-fc治療誘導(dǎo)腎臟phosphosmad2/3和纖維化的降低一致。

9.10.2.6ckd中可能的actriia配體

存在多種可能的actriia配體，包括激活素a和b，生長和分化因子11(gdf11)，骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白9和10(bmp9和10)，以及其他bmp，例如bmp7，它們具有對受體的更低的親和力。但是主要的actriia配體是激活素。使用兩種ckd模型，鑒定出全身性循環(huán)激活素a水平在ldlr-/-消融性ckd模型中有10倍升高，在col4a5alport’s綜合征小鼠模型中有5倍提高(附圖31a、b)。在這些模型中，激活素b、gdf11和bmp9水平不受ckd影響。生理學(xué)上，認(rèn)為在循環(huán)中存在少量游離的激活素。不受任何特定理論的限制，這可能是有感于化學(xué)計量地相等于激活素水平的抑制劑水平。激活素與循環(huán)抑制因子卵泡抑素和卵泡抑素樣3(fstl3)相關(guān)(weltc,etal.experimentalbiol.andmed.2002；227:724-752)以及與循環(huán)水平和組織水平不受ckd-3的影響或降低的抑制素相關(guān)(附圖36a、b)在循環(huán)中卵泡抑素、fstl3和抑制素(例如，620pg/ml的總和，加上400pg/ml未測出的抑制素(sharperm,etal.j.andrology1999；20:94-101)與激活素a水平(>5000pg/ml)的化學(xué)當(dāng)量表明，ckd產(chǎn)生顯著的游離激活素水平，是一種使得激活素a成為ckd中的活性循環(huán)因子的病理事件。這一數(shù)據(jù)表明，腎臟疾病產(chǎn)生一種或更多種循環(huán)actriia配體，它們可能下調(diào)血管的actriia。

分析來自ldlr-/-動脈粥樣硬化性鈣化模型的腎臟組織的激活素a(抑制素betaa的同二聚體(inhba))來鑒定提高的循環(huán)激活素的來源。在腎臟中inhbamrna被ckd提高(附圖31c)，激活素(抑制素β-a)蛋白質(zhì)水平提高(附圖31d)。腎臟的激活素表達(dá)定位于ckd-3小鼠的管周肌成纖維細(xì)胞中(附圖32a、b)。

9.10.3結(jié)論

這個實施例表明，mactriia-fc提高通過磷酸化的smad2/3的水平評估的主動脈actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外mactriia-rc治療逆轉(zhuǎn)了ckd誘導(dǎo)的血管平滑肌去分化、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和新內(nèi)膜斑塊鈣化。在患病腎臟中，mactriia-fc抑制了，而不是刺激了actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并降低腎臟纖維化和蛋白尿。mactriia-fc治療降低腎臟和循環(huán)dkk1水平，表明wnt活化在actriia下游。這個實施例表明，ckd中失調(diào)的actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)了ckd-mbd和腎臟纖維化，將actriia信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鑒定為ckd的治療靶點，并表明激活素配體陷阱(例如，mactriia-fc)可以用于ckd的治療。

10.序列的說明

表21：序列信息

11.等同

雖然參考具體實施方式詳細(xì)描述了本發(fā)明，要理解的是功能上等價的變體處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實際上，根據(jù)以上的說明和附圖，除了在此顯示和描述的之外，本發(fā)明的各種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。這種修改也將落在附隨的權(quán)利要求的范圍之中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到或能夠利用不超出常規(guī)的實驗來確定本文描述的本發(fā)明的具體實施方式的許多等同形式。這樣的等同形式預(yù)期由以下權(quán)利要求涵蓋。

在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請通過引用合并到本說明書中，達(dá)到如同每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埍痪唧w和分別地指明通過引用完全合并在此的相同程度。

序列表

<110>細(xì)胞基因公司

華盛頓大學(xué)

<120>利用actrii配體陷阱治療心血管疾病

<130>12827-934-228

<150>62/062,021

<151>2014-10-09

<150>62/078,321

<151>2014-11-11

<150>62/103,515

<151>2015-01-14

<150>62/167,052

<151>2015-05-27

<150>62/170,015

<151>2015-06-02

<160>87

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>513

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>人actriia前體多肽

<400>1

metglyalaalaalalysleualaphealavalpheleuilesercys

151015

serserglyalaileleuglyargsergluthrglnglucysleuphe

202530

pheasnalaasntrpglulysaspargthrasnglnthrglyvalglu

354045

procystyrglyasplysasplysargarghiscysphealathrtrp

505560

lysasnileserglyserilegluilevallysglnglycystrpleu

65707580

aspaspileasncystyraspargthraspcysvalglulyslysasp

859095

serprogluvaltyrphecyscyscysgluglyasnmetcysasnglu

100105110

lysphesertyrpheproglumetgluvalthrglnprothrserasn

115120125

provalthrprolysproprotyrtyrasnileleuleutyrserleu

130135140

valproleumetleuilealaglyilevalilecysalaphetrpval

145150155160

tyrarghishislysmetalatyrproprovalleuvalprothrgln

165170175

aspproglyproproproproserproleuleuglyleulysproleu

180185190

glnleuleugluvallysalaargglyargpheglycysvaltrplys

195200205

alaglnleuleuasnglutyrvalalavallysilepheproilegln

210215220

asplysglnsertrpglnasnglutyrgluvaltyrserleuprogly

225230235240

metlyshisgluasnileleuglnpheileglyalaglulysarggly

245250255

thrservalaspvalaspleutrpleuilethralaphehisglulys

260265270

glyserleuserasppheleulysalaasnvalvalsertrpasnglu

275280285

leucyshisilealagluthrmetalaargglyleualatyrleuhis

290295300

gluaspileproglyleulysaspglyhislysproalaileserhis

305310315320

argaspilelysserlysasnvalleuleulysasnasnleuthrala

325330335

cysilealaasppheglyleualaleulyspheglualaglylysser

340345350

alaglyaspthrhisglyglnvalglythrargargtyrmetalapro

355360365

gluvalleugluglyalaileasnpheglnargaspalapheleuarg

370375380

ileaspmettyralametglyleuvalleutrpgluleualaserarg

385390395400

cysthralaalaaspglyprovalaspglutyrmetleupropheglu

405410415

glugluileglyglnhisproserleugluaspmetglngluvalval

420425430

valhislyslyslysargprovalleuargasptyrtrpglnlyshis

435440445

alaglymetalametleucysgluthrilegluglucystrpasphis

450455460

aspalaglualaargleuseralaglycysvalglygluargilethr

465470475480

glnmetglnargleuthrasnileilethrthrgluaspilevalthr

485490495

valvalthrmetvalthrasnvalasppheproprolysgluserser

500505510

leu

<210>2

<211>115

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>人actriia可溶的(細(xì)胞外的),加工的多肽序列

<400>2

ileleuglyargsergluthrglnglucysleuphepheasnalaasn

151015

trpglulysaspargthrasnglnthrglyvalgluprocystyrgly

202530

asplysasplysargarghiscysphealathrtrplysasnileser

354045

glyserilegluilevallysglnglycystrpleuaspaspileasn

505560

cystyraspargthraspcysvalglulyslysaspserprogluval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnmetcysasnglulysphesertyr

859095

pheproglumetgluvalthrglnprothrserasnprovalthrpro

100105110

lyspropro

115

<210>3

<211>100

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriia可溶的(細(xì)胞外的),c-末端15個氨基酸刪除的加工的多肽

序列

<400>3

ileleuglyargsergluthrglnglucysleuphepheasnalaasn

151015

trpglulysaspargthrasnglnthrglyvalgluprocystyrgly

202530

asplysasplysargarghiscysphealathrtrplysasnileser

354045

glyserilegluilevallysglnglycystrpleuaspaspileasn

505560

cystyraspargthraspcysvalglulyslysaspserprogluval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnmetcysasnglulysphesertyr

859095

pheproglumet

100

<210>4

<211>1542

<212>dna

<213>智人

<220>

<223>編碼人actriia前體蛋白的核酸序列

<400>4

atgggagctgctgcaaagttggcgtttgccgtctttcttatctcctgttcttcaggtgct60

atacttggtagatcagaaactcaggagtgtcttttctttaatgctaattgggaaaaagac120

agaaccaatcaaactggtgttgaaccgtgttatggtgacaaagataaacggcggcattgt180

tttgctacctggaagaatatttctggttccattgaaatagtgaaacaaggttgttggctg240

gatgatatcaactgctatgacaggactgattgtgtagaaaaaaaagacagccctgaagta300

tatttttgttgctgtgagggcaatatgtgtaatgaaaagttttcttattttccagagatg360

gaagtcacacagcccacttcaaatccagttacacctaagccaccctattacaacatcctg420

ctctattccttggtgccacttatgttaattgcggggattgtcatttgtgcattttgggtg480

tacaggcatcacaagatggcctaccctcctgtacttgttccaactcaagacccaggacca540

cccccaccttctccattactagggttgaaaccactgcagttattagaagtgaaagcaagg600

ggaagatttggttgtgtctggaaagcccagttgcttaacgaatatgtggctgtcaaaata660

tttccaatacaggacaaacagtcatggcaaaatgaatacgaagtctacagtttgcctgga720

atgaagcatgagaacatattacagttcattggtgcagaaaaacgaggcaccagtgttgat780

gtggatctttggctgatcacagcatttcatgaaaagggttcactatcagactttcttaag840

gctaatgtggtctcttggaatgaactgtgtcatattgcagaaaccatggctagaggattg900

gcatatttacatgaggatatacctggcctaaaagatggccacaaacctgccatatctcac960

agggacatcaaaagtaaaaatgtgctgttgaaaaacaacctgacagcttgcattgctgac1020

tttgggttggccttaaaatttgaggctggcaagtctgcaggcgatacccatggacaggtt1080

ggtacccggaggtacatggctccagaggtattagagggtgctataaacttcgaaagggat1140

gcatttttgaggatagatatgtatgccatgggattagtcctatgggaactggcttctcgc1200

tgtactgctgcagatggacctgtagatgaatacatgttgccatttgaggaggaaattggc1260

cagcatccatctcttgaagacatgcaggaagttgttgtgcataaaaaaaagaggcctgtt1320

ttaagagattattggcagaaacatgctggaatggcaatgctctgtgaaaccattgaagaa1380

tgttgggatcacgacgcagaagccaggttatcagctggatgtgtaggtgaaagaattacc1440

cagatgcagagactaacaaatattattaccacagaggacattgtaacagtggtcacaatg1500

gtgacaaatgttgactttcctcccaaagaatctagtctatga1542

<210>5

<211>345

<212>dna

<213>智人

<220>

<223>編碼人actriia可溶的(細(xì)胞外的)多肽的核酸序列

<400>5

atacttggtagatcagaaactcaggagtgtcttttctttaatgctaattgggaaaaagac60

agaaccaatcaaactggtgttgaaccgtgttatggtgacaaagataaacggcggcattgt120

tttgctacctggaagaatatttctggttccattgaaatagtgaaacaaggttgttggctg180

gatgatatcaactgctatgacaggactgattgtgtagaaaaaaaagacagccctgaagta240

tatttttgttgctgtgagggcaatatgtgtaatgaaaagttttcttattttccagagatg300

gaagtcacacagcccacttcaaatccagttacacctaagccaccc345

<210>6

<211>228

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的actriia的可溶細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白

<220>

<221>misc_feature

<222>(44)..(44)

<223>xaa=asp或ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(102)..(102)

<223>xaa=lys或ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(215)..(215)

<223>xaa=asn或ala

<400>6

thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro

151015

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

202530

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspxaavalserhisglu

354045

aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis

505560

asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg

65707580

valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys

859095

glutyrlyscyslysxaavalserasnlysalaleuprovalproile

100105110

glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval

115120125

tyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalser

130135140

leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu

145150155160

trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro

165170175

valleuaspseraspglyprophepheleutyrserlysleuthrval

180185190

asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet

195200205

hisglualaleuhisasnxaahistyrthrglnlysserleuserleu

210215220

serproglylys

225

<210>7

<211>344

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>與人fc結(jié)構(gòu)域融合的人actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域

<400>7

ileleuglyargsergluthrglnglucysleuphepheasnalaasn

151015

trpglulysaspargthrasnglnthrglyvalgluprocystyrgly

202530

asplysasplysargarghiscysphealathrtrplysasnileser

354045

glyserilegluilevallysglnglycystrpleuaspaspileasn

505560

cystyraspargthraspcysvalglulyslysaspserprogluval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnmetcysasnglulysphesertyr

859095

pheproglumetgluvalthrglnprothrserasnprovalthrpro

100105110

lysproprothrglyglyglythrhisthrcysproprocysproala

115120125

progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro

130135140

lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

145150155160

valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval

165170175

aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln

180185190

tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln

195200205

asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala

210215220

leuprovalproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro

225230235240

arggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthr

245250255

lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser

260265270

aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr

275280285

lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr

290295300

serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe

305310315320

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

325330335

serleuserleuserproglylys

340

<210>8

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蜜蜂蜂毒（hbml）的前導(dǎo)序列

<400>8

metlyspheleuvalasnvalalaleuvalphemetvalvaltyrile

151015

sertyriletyrala

20

<210>9

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>組織纖溶酶原激活物（tpa）的前導(dǎo)序列

<400>9

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserpro

20

<210>10

<211>20

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>天然actriia前導(dǎo)區(qū)

<400>10

metglyalaalaalalysleualaphealavalpheleuilesercys

151015

serserglyala

20

<210>11

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>actriia-hfc和mactriia-fcn-末端序列

<400>11

ileleuglyargsergluthrglnglu

15

<210>12

<211>329

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>具有actriia的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的c-末端15個氨基酸刪除的actriia-fc蛋白

<400>12

ileleuglyargsergluthrglnglucysleuphepheasnalaasn

151015

trpglulysaspargthrasnglnthrglyvalgluprocystyrgly

202530

asplysasplysargarghiscysphealathrtrplysasnileser

354045

glyserilegluilevallysglnglycystrpleuaspaspileasn

505560

cystyraspargthraspcysvalglulyslysaspserprogluval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnmetcysasnglulysphesertyr

859095

pheproglumetthrglyglyglythrhisthrcysproprocyspro

100105110

alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys

115120125

prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval

130135140

valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr

145150155160

valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu

165170175

glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis

180185190

glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys

195200205

alaleuprovalproileglulysthrileserlysalalysglygln

210215220

proarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumet

225230235240

thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro

245250255

seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn

260265270

tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu

275280285

tyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnval

290295300

phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln

305310315320

lysserleuserleuserproglylys

325

<210>13

<211>369

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>帶有tpa前導(dǎo)序列的未加工的actriia-hfc

<400>13

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproglyalaalaileleuglyargsergluthr

202530

glnglucysleuphepheasnalaasntrpglulysaspargthrasn

354045

glnthrglyvalgluprocystyrglyasplysasplysargarghis

505560

cysphealathrtrplysasnileserglyserilegluilevallys

65707580

glnglycystrpleuaspaspileasncystyraspargthraspcys

859095

valglulyslysaspserprogluvaltyrphecyscyscysglugly

100105110

asnmetcysasnglulysphesertyrpheproglumetgluvalthr

115120125

glnprothrserasnprovalthrprolysproprothrglyglygly

130135140

thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro

145150155160

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

165170175

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

180185190

progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

195200205

alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval

210215220

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

225230235240

tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuprovalproileglulys

245250255

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

260265270

leuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthr

275280285

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

290295300

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

305310315320

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

325330335

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

340345350

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

355360365

lys

<210>14

<211>1113

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼帶有tpa前導(dǎo)序列的未加工的actriia-hfc的核酸序列

<400>14

atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt60

tcgcccggcgccgctatacttggtagatcagaaactcaggagtgtctttttttaatgcta120

attgggaaaaagacagaaccaatcaaactggtgttgaaccgtgttatggtgacaaagata180

aacggcggcattgttttgctacctggaagaatatttctggttccattgaatagtgaaaca240

aggttgttggctggatgatatcaactgctatgacaggactgattgtgtagaaaaaaaaga300

cagccctgaagtatatttctgttgctgtgagggcaatatgtgtaatgaaaagttttctta360

ttttccggagatggaagtcacacagcccacttcaaatccagttacacctaagccacccac420

cggtggtggaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtc480

agtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt540

cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgt600

ggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcac660

gtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagta720

caagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagc780

caaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgac840

caagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgt900

ggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgga960

ctccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagca1020

ggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaa1080

gagcctctccctgtctccggtaaatgagaattc1113

<210>15

<211>106

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端4個氨基酸刪除（seqidno：28的氨基酸25-130）、具有l(wèi)79d突變的加工的多肽序列

<400>15

gluthrargglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluarg

151015

thrasnglnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysarg

202530

leuhiscystyralasertrpargasnserserglythrilegluleu

354045

vallyslysglycystrpaspaspasppheasncystyrasparggln

505560

glucysvalalathrglugluasnproglnvaltyrphecyscyscys

65707580

gluglyasnphecysasngluargphethrhisleuproglualagly

859095

glyprogluvalthrtyrglupropropro

100105

<210>16

<211>512

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>人actriib前體蛋白序列(a64)

<400>16

metthralaprotrpvalalaleualaleuleutrpglyserleutrp

151015

proglyserglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyr

202530

asnalaasntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluarg

354045

cysgluglygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpala

505560

asnserserglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuasp

65707580

asppheasncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasn

859095

proglnvaltyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluarg

100105110

phethrhisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglupro

115120125

proprothralaprothrleuleuthrvalleualatyrserleuleu

130135140

proileglyglyleuserleuilevalleuleualaphetrpmettyr

145150155160

arghisarglysproprotyrglyhisvalaspilehisgluasppro

165170175

glyproproproproserproleuvalglyleulysproleuglnleu

180185190

leugluilelysalaargglyargpheglycysvaltrplysalagln

195200205

leumetasnaspphevalalavallysilepheproleuglnasplys

210215220

glnsertrpglnsergluarggluilepheserthrproglymetlys

225230235240

hisgluasnleuleuglnpheilealaalaglulysargglyserasn

245250255

leugluvalgluleutrpleuilethralaphehisasplysglyser

260265270

leuthrasptyrleulysglyasnileilethrtrpasngluleucys

275280285

hisvalalagluthrmetserargglyleusertyrleuhisgluasp

290295300

valprotrpcysargglygluglyhislysproserilealahisarg

305310315320

aspphelysserlysasnvalleuleulysseraspleuthralaval

325330335

leualaasppheglyleualavalargphegluproglylyspropro

340345350

glyaspthrhisglyglnvalglythrargargtyrmetalaproglu

355360365

valleugluglyalaileasnpheglnargaspalapheleuargile

370375380

aspmettyralametglyleuvalleutrpgluleuvalserargcys

385390395400

lysalaalaaspglyprovalaspglutyrmetleuprophegluglu

405410415

gluileglyglnhisproserleuglugluleuglngluvalvalval

420425430

hislyslysmetargprothrilelysasphistrpleulyshispro

435440445

glyleualaglnleucysvalthrilegluglucystrpasphisasp

450455460

alaglualaargleuseralaglycysvalglugluargvalserleu

465470475480

ileargargservalasnglythrthrseraspcysleuvalserleu

485490495

valthrservalthrasnvalaspleuproprolysgluserserile

500505510

<210>17

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），加工的多肽序列（seqidno：16的氨基酸19-134）

<400>17

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglupropropro

100105110

thralaprothr

115

<210>18

<211>101

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），c-末端15個氨基酸刪除的加工的多肽序列（seqidno：16的氨基酸19-119）

<400>18

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuprogluala

100

<210>19

<211>1539

<212>dna

<213>智人

<220>

<223>編碼人actriib(a64)前體蛋白的核酸序列

<400>19

atgacggcgccctgggtggccctcgccctcctctggggatcgctgtggcccggctctggg60

cgtggggaggctgagacacgggagtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgc120

accaaccagagcggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctac180

gcctcctgggccaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagat240

gacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtac300

ttctgctgctgtgaaggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctggg360

ggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccccaccctgctcacggtgctggcc420

tactcactgctgcccatcgggggcctttccctcatcgtcctgctggccttttggatgtac480

cggcatcgcaagcccccctacggtcatgtggacatccatgaggaccctgggcctccacca540

ccatcccctctggtgggcctgaagccactgcagctgctggagatcaaggctcgggggcgc600

tttggctgtgtctggaaggcccagctcatgaatgactttgtagctgtcaagatcttccca660

ctccaggacaagcagtcgtggcagagtgaacgggagatcttcagcacacctggcatgaag720

cacgagaacctgctacagttcattgctgccgagaagcgaggctccaacctcgaagtagag780

ctgtggctcatcacggccttccatgacaagggctccctcacggattacctcaaggggaac840

atcatcacatggaacgaactgtgtcatgtagcagagacgatgtcacgaggcctctcatac900

ctgcatgaggatgtgccctggtgccgtggcgagggccacaagccgtctattgcccacagg960

gactttaaaagtaagaatgtattgctgaagagcgacctcacagccgtgctggctgacttt1020

ggcttggctgttcgatttgagccagggaaacctccaggggacacccacggacaggtaggc1080

acgagacggtacatggctcctgaggtgctcgagggagccatcaacttccagagagatgcc1140

ttcctgcgcattgacatgtatgccatggggttggtgctgtgggagcttgtgtctcgctgc1200

aaggctgcagacggacccgtggatgagtacatgctgccctttgaggaagagattggccag1260

cacccttcgttggaggagctgcaggaggtggtggtgcacaagaagatgaggcccaccatt1320

aaagatcactggttgaaacacccgggcctggcccagctttgtgtgaccatcgaggagtgc1380

tgggaccatgatgcagaggctcgcttgtccgcgggctgtgtggaggagcgggtgtccctg1440

attcggaggtcggtcaacggcactacctcggactgtctcgtttccctggtgacctctgtc1500

accaatgtggacctgccccctaaagagtcaagcatctaa1539

<210>20

<211>344

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的actriib的可溶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（a64；seqidno：17）的融合蛋白

<400>20

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglupropropro

100105110

thralaprothrglyglyglythrhisthrcysproprocysproala

115120125

progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro

130135140

lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

145150155160

valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval

165170175

aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln

180185190

tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln

195200205

asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala

210215220

leuprovalproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro

225230235240

arggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthr

245250255

lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser

260265270

aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr

275280285

lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr

290295300

serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe

305310315320

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

325330335

serleuserleuserproglylys

340

<210>21

<211>329

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的、帶有c-末端15個氨基酸刪除的（seqidno：18）actriib的可溶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（a64）的融合蛋白

<400>21

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuproglualaglyglyglythrhisthrcysproprocyspro

100105110

alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys

115120125

prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval

130135140

valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr

145150155160

valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu

165170175

glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis

180185190

glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys

195200205

alaleuprovalproileglulysthrileserlysalalysglygln

210215220

proarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumet

225230235240

thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro

245250255

seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn

260265270

tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu

275280285

tyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnval

290295300

phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln

305310315320

lysserleuserleuserproglylys

325

<210>22

<211>105

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端5個氨基酸刪除（seqidno：28的氨基酸25-129）且具有l(wèi)79d突變的加工的多肽序列

<400>22

gluthrargglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluarg

151015

thrasnglnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysarg

202530

leuhiscystyralasertrpargasnserserglythrilegluleu

354045

vallyslysglycystrpaspaspasppheasncystyrasparggln

505560

glucysvalalathrglugluasnproglnvaltyrphecyscyscys

65707580

gluglyasnphecysasngluargphethrhisleuproglualagly

859095

glyprogluvalthrtyrglupropro

100105

<210>23

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端3個氨基酸刪除（seqidno：28的氨基酸25-131）、具有l(wèi)79d突變的加工的多肽序列

<400>23

gluthrargglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluarg

151015

thrasnglnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysarg

202530

leuhiscystyralasertrpargasnserserglythrilegluleu

354045

vallyslysglycystrpaspaspasppheasncystyrasparggln

505560

glucysvalalathrglugluasnproglnvaltyrphecyscyscys

65707580

gluglyasnphecysasngluargphethrhisleuproglualagly

859095

glyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105

<210>24

<211>360

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端3個氨基酸刪除（seqidno：28的氨基酸25-131）、具有l(wèi)79d突變并具有tpa前導(dǎo)序列的未加工的actriib-fc融合蛋白

<400>24

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproglyalaalagluthrargglucysiletyr

202530

tyrasnalaasntrpgluleugluargthrasnglnserglyleuglu

354045

argcysgluglygluglnasplysargleuhiscystyralasertrp

505560

argasnserserglythrilegluleuvallyslysglycystrpasp

65707580

aspasppheasncystyraspargglnglucysvalalathrgluglu

859095

asnproglnvaltyrphecyscyscysgluglyasnphecysasnglu

100105110

argphethrhisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglu

115120125

proproprothrglyglyglythrhisthrcysproprocysproala

130135140

progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro

145150155160

lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

165170175

valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval

180185190

aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln

195200205

tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln

210215220

asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala

225230235240

leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro

245250255

arggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthr

260265270

lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser

275280285

aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr

290295300

lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr

305310315320

serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe

325330335

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

340345350

serleuserleuserproglylys

355360

<210>25

<211>335

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端3個氨基酸刪除（seqidno：28的氨基酸25-131）、具有l(wèi)79d突變的加工的actriib-fc融合蛋白

<400>25

gluthrargglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluarg

151015

thrasnglnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysarg

202530

leuhiscystyralasertrpargasnserserglythrilegluleu

354045

vallyslysglycystrpaspaspasppheasncystyrasparggln

505560

glucysvalalathrglugluasnproglnvaltyrphecyscyscys

65707580

gluglyasnphecysasngluargphethrhisleuproglualagly

859095

glyprogluvalthrtyrgluproproprothrglyglyglythrhis

100105110

thrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproserval

115120125

pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr

130135140

progluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspproglu

145150155160

vallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalys

165170175

thrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalser

180185190

valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys

195200205

cyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrile

210215220

serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro

225230235240

proserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleu

245250255

vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn

260265270

glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser

275280285

aspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserarg

290295300

trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu

305310315320

hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

325330335

<210>26

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），加工的多肽序列（seqidno：16的氨基酸20-134）

<400>26

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105110

alaprothr

115

<210>27

<211>100

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），c-末端15個氨基酸刪除的加工的多肽序列（seqidno：16的氨基酸20-119）

<400>27

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuprogluala

100

<210>28

<211>512

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>人actriib前體蛋白序列(r64)

<400>28

metthralaprotrpvalalaleualaleuleutrpglyserleutrp

151015

proglyserglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyr

202530

asnalaasntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluarg

354045

cysgluglygluglnasplysargleuhiscystyralasertrparg

505560

asnserserglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuasp

65707580

asppheasncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasn

859095

proglnvaltyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluarg

100105110

phethrhisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglupro

115120125

proprothralaprothrleuleuthrvalleualatyrserleuleu

130135140

proileglyglyleuserleuilevalleuleualaphetrpmettyr

145150155160

arghisarglysproprotyrglyhisvalaspilehisgluasppro

165170175

glyproproproproserproleuvalglyleulysproleuglnleu

180185190

leugluilelysalaargglyargpheglycysvaltrplysalagln

195200205

leumetasnaspphevalalavallysilepheproleuglnasplys

210215220

glnsertrpglnsergluarggluilepheserthrproglymetlys

225230235240

hisgluasnleuleuglnpheilealaalaglulysargglyserasn

245250255

leugluvalgluleutrpleuilethralaphehisasplysglyser

260265270

leuthrasptyrleulysglyasnileilethrtrpasngluleucys

275280285

hisvalalagluthrmetserargglyleusertyrleuhisgluasp

290295300

valprotrpcysargglygluglyhislysproserilealahisarg

305310315320

aspphelysserlysasnvalleuleulysseraspleuthralaval

325330335

leualaasppheglyleualavalargphegluproglylyspropro

340345350

glyaspthrhisglyglnvalglythrargargtyrmetalaproglu

355360365

valleugluglyalaileasnpheglnargaspalapheleuargile

370375380

aspmettyralametglyleuvalleutrpgluleuvalserargcys

385390395400

lysalaalaaspglyprovalaspglutyrmetleuprophegluglu

405410415

gluileglyglnhisproserleuglugluleuglngluvalvalval

420425430

hislyslysmetargprothrilelysasphistrpleulyshispro

435440445

glyleualaglnleucysvalthrilegluglucystrpasphisasp

450455460

alaglualaargleuseralaglycysvalglugluargvalserleu

465470475480

ileargargservalasnglythrthrseraspcysleuvalserleu

485490495

valthrservalthrasnvalaspleuproprolysgluserserile

500505510

<210>29

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），加工的多肽序列（seqidno：28的氨基酸19-134）

<400>29

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglupropropro

100105110

thralaprothr

115

<210>30

<211>101

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），c-末端15個氨基酸刪除的加工的多肽序列（seqidno：28的氨基酸19-119）

<400>30

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuprogluala

100

<210>31

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），加工的多肽序列（seqidno：28的氨基酸20-134）

<400>31

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105110

alaprothr

115

<210>32

<211>100

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），c-末端15個氨基酸刪除的加工的多肽序列（seqidno：28的氨基酸20-119）

<400>32

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuprogluala

100

<210>33

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端3個氨基酸刪除（seqidno：16的氨基酸25-131）、具有l(wèi)79d突變的加工的多肽序列

<400>33

gluthrargglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluarg

151015

thrasnglnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysarg

202530

leuhiscystyralasertrpalaasnserserglythrilegluleu

354045

vallyslysglycystrpaspaspasppheasncystyrasparggln

505560

glucysvalalathrglugluasnproglnvaltyrphecyscyscys

65707580

gluglyasnphecysasngluargphethrhisleuproglualagly

859095

glyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105

<210>34

<211>360

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端3個氨基酸刪除（seqidno：16的氨基酸25-131）、具有l(wèi)79d突變并具有tpa前導(dǎo)序列的未加工的actriib-fc融合蛋白

<400>34

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproglyalaalagluthrargglucysiletyr

202530

tyrasnalaasntrpgluleugluargthrasnglnserglyleuglu

354045

argcysgluglygluglnasplysargleuhiscystyralasertrp

505560

alaasnserserglythrilegluleuvallyslysglycystrpasp

65707580

aspasppheasncystyraspargglnglucysvalalathrgluglu

859095

asnproglnvaltyrphecyscyscysgluglyasnphecysasnglu

100105110

argphethrhisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglu

115120125

proproprothrglyglyglythrhisthrcysproprocysproala

130135140

progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro

145150155160

lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

165170175

valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval

180185190

aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln

195200205

tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln

210215220

asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala

225230235240

leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro

245250255

arggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthr

260265270

lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser

275280285

aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr

290295300

lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr

305310315320

serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe

325330335

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

340345350

serleuserleuserproglylys

355360

<210>35

<211>335

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ec結(jié)構(gòu)域的n-末端6個氨基酸刪除、ec結(jié)構(gòu)域的c-末端3個氨基酸刪除（seqidno：16的氨基酸25-131）、具有l(wèi)79d突變的加工的actriib-fc融合蛋白

<400>35

gluthrargglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluarg

151015

thrasnglnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysarg

202530

leuhiscystyralasertrpalaasnserserglythrilegluleu

354045

vallyslysglycystrpaspaspasppheasncystyrasparggln

505560

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65707580

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859095

glyprogluvalthrtyrgluproproprothrglyglyglythrhis

100105110

thrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproserval

115120125

pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr

130135140

progluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspproglu

145150155160

vallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalys

165170175

thrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalser

180185190

valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys

195200205

cyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrile

210215220

serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro

225230235240

proserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleu

245250255

vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn

260265270

glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser

275280285

aspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserarg

290295300

trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu

305310315320

hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

325330335

<210>36

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有l(wèi)79d突變的加工的多肽序列（seqidno：28的氨基酸20-134）

<400>36

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpaspaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105110

alaprothr

115

<210>37

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有l(wèi)79d突變的加工的多肽序列（seqidno：16的氨基酸20-134）

<400>37

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpaspaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105110

alaprothr

115

<210>38

<211>343

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有通過ggg接頭與fc結(jié)構(gòu)域融合的l79d突變的加工的多肽序列（seqidno：28的氨基酸20-134）

<400>38

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpaspaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105110

alaprothrglyglyglythrhisthrcysproprocysproalapro

115120125

gluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

130135140

aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval

145150155160

aspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalasp

165170175

glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyr

180185190

asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp

195200205

trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleu

210215220

proalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg

225230235240

gluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlys

245250255

asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp

260265270

ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys

275280285

thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser

290295300

lysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalpheser

305310315320

cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser

325330335

leuserleuserproglylys

340

<210>39

<211>343

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有與fc結(jié)構(gòu)域融合的l79d突變的加工的多肽序列（seqidno：16的氨基酸20-134）

<400>39

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpalaasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpaspaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluvalthrtyrgluproproprothr

100105110

alaprothrglyglyglythrhisthrcysproprocysproalapro

115120125

gluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

130135140

aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval

145150155160

aspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalasp

165170175

glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyr

180185190

asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp

195200205

trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleu

210215220

proalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg

225230235240

gluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlys

245250255

asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp

260265270

ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys

275280285

thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser

290295300

lysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalpheser

305310315320

cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser

325330335

leuserleuserproglylys

340

<210>40

<211>368

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有與fc結(jié)構(gòu)域融合的l79d突變和tpa前導(dǎo)序列的加工的多肽序列（seqidno：28的氨基酸20-134）

<400>40

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproglyalaserglyargglyglualagluthr

202530

argglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluargthrasn

354045

glnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysargleuhis

505560

cystyralasertrpargasnserserglythrilegluleuvallys

65707580

lysglycystrpaspaspasppheasncystyraspargglnglucys

859095

valalathrglugluasnproglnvaltyrphecyscyscysglugly

100105110

asnphecysasngluargphethrhisleuproglualaglyglypro

115120125

gluvalthrtyrgluproproprothralaprothrglyglyglythr

130135140

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

145150155160

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

165170175

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

180185190

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

195200205

lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval

210215220

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

225230235240

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

245250255

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

260265270

proproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcys

275280285

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

290295300

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

305310315320

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

325330335

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

340345350

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

355360365

<210>41

<211>368

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有與fc結(jié)構(gòu)域融合的l79d突變和tpa前導(dǎo)序列的加工的多肽序列（seqidno：16的氨基酸20-134）

<400>41

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproglyalaserglyargglyglualagluthr

202530

argglucysiletyrtyrasnalaasntrpgluleugluargthrasn

354045

glnserglyleugluargcysgluglygluglnasplysargleuhis

505560

cystyralasertrpalaasnserserglythrilegluleuvallys

65707580

lysglycystrpaspaspasppheasncystyraspargglnglucys

859095

valalathrglugluasnproglnvaltyrphecyscyscysglugly

100105110

asnphecysasngluargphethrhisleuproglualaglyglypro

115120125

gluvalthrtyrgluproproprothralaprothrglyglyglythr

130135140

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

145150155160

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

165170175

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

180185190

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

195200205

lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval

210215220

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

225230235240

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

245250255

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

260265270

proproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcys

275280285

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

290295300

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

305310315320

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

325330335

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

340345350

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

355360365

<210>42

<211>141

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有變體c-末端序列的加工的多肽序列（wo2007/053775中公開的）

<400>42

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluglyprotrpalaserthrthrile

100105110

proserglyglyproglualathralaalaalaglyaspglnglyser

115120125

glyalaleutrpleucysleugluglyproalahisglu

130135140

<210>43

<211>141

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有帶l79d突變的變體c-末端序列的加工的多肽序列（wo2007/053775中公開的）

<400>43

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpaspaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluglyprotrpalaserthrthrile

100105110

proserglyglyproglualathralaalaalaglyaspglnglyser

115120125

glyalaleutrpleucysleugluglyproalahisglu

130135140

<210>44

<211>370

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人actriib可溶的（細(xì)胞外的），具有用tggg接頭融合到fc結(jié)構(gòu)域的l79d突變的變體c-末端序列的加工的多肽序列（wo2007/053775中公開的）

<400>44

glyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnalaasn

151015

trpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglugly

202530

gluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnserser

354045

glythrilegluleuvallyslysglycystrpaspaspasppheasn

505560

cystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnproglnval

65707580

tyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethrhis

859095

leuproglualaglyglyprogluglyprotrpalaserthrthrile

100105110

proserglyglyproglualathralaalaalaglyaspglnglyser

115120125

glyalaleutrpleucysleugluglyproalahisgluthrglygly

130135140

glythrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly

145150155160

proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile

165170175

serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu

180185190

aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis

195200205

asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg

210215220

valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys

225230235240

glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu

245250255

lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr

260265270

thrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleu

275280285

thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp

290295300

gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval

305310315320

leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp

325330335

lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis

340345350

glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro

355360365

glylys

370

<210>45

<211>1083

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼seqidno:24的核酸序列

<400>45

atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt60

tcgcccggcgccgccgaaacccgcgaatgtatttattacaatgctaattgggaactcgaa120

cggacgaaccaatccgggctcgaacggtgtgagggggaacaggataaacgcctccattgc180

tatgcgtcgtggaggaactcctccgggacgattgaactggtcaagaaagggtgctgggac240

gacgatttcaattgttatgaccgccaggaatgtgtcgcgaccgaagagaatccgcaggtc300

tatttctgttgttgcgaggggaatttctgtaatgaacggtttacccacctccccgaagcc360

ggcgggcccgaggtgacctatgaacccccgcccaccggtggtggaactcacacatgccca420

ccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccc480

aaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagc540

cacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc600

aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc660

gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcc720

ctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag780

gtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgc840

ctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg900

gagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctat960

agcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtg1020

atgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaa1080

tga1083

<210>46

<211>344

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的actriib的可溶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（r64；seqidno：29）的融合蛋白

<400>46

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuproglualaglyglyprogluvalthrtyrglupropropro

100105110

thralaprothrglyglyglythrhisthrcysproprocysproala

115120125

progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro

130135140

lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

145150155160

valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval

165170175

aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln

180185190

tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln

195200205

asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala

210215220

leuprovalproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro

225230235240

arggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthr

245250255

lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser

260265270

aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr

275280285

lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr

290295300

serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe

305310315320

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

325330335

serleuserleuserproglylys

340

<210>47

<211>329

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的、帶有c-末端15個氨基酸刪除的（seqidno：30）actriib的可溶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（r64）的融合蛋白

<400>47

serglyargglyglualagluthrargglucysiletyrtyrasnala

151015

asntrpgluleugluargthrasnglnserglyleugluargcysglu

202530

glygluglnasplysargleuhiscystyralasertrpargasnser

354045

serglythrilegluleuvallyslysglycystrpleuaspaspphe

505560

asncystyraspargglnglucysvalalathrglugluasnprogln

65707580

valtyrphecyscyscysgluglyasnphecysasngluargphethr

859095

hisleuproglualaglyglyglythrhisthrcysproprocyspro

100105110

alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys

115120125

prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval

130135140

valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr

145150155160

valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu

165170175

glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis

180185190

glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys

195200205

alaleuprovalproileglulysthrileserlysalalysglygln

210215220

proarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumet

225230235240

thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro

245250255

seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn

260265270

tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu

275280285

tyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnval

290295300

phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln

305310315320

lysserleuserleuserproglylys

325

<210>48

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>runx2qrt-pcr引物1

<400>48

ccgcacgacaaccgcaccat20

<210>49

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>runx2qrt-pcr引物2

<400>49

cgctccggcccacaaatctc20

<210>50

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>alpqrt-pcr引物1

<400>50

acgtggctaagaatgtcatc20

<210>51

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>alpqrt-pcr引物2

<400>51

ctggtaggcgatgtcctta19

<210>52

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>osterixqrt-pcr引物1

<400>52

tagtggtttggggtttgtttaccgc25

<210>53

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>osterixqrt-pcr引物2

<400>53

aaccaaataactcttattccctaagt26

<210>54

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>klothoqrt-pcr引物1

<400>54

gctctcaaagcccacatactg21

<210>55

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>klothoqrt-pcr引物1

<400>55

gcagcataacgatagaggcc20

<210>56

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sm22-alphaqrt-pcr引物1

<400>56

gttccagactgttgacctcttt22

<210>57

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sm22-alphaqrt-pcr引物2

<400>57

ctgcgctttcttcataaacc20

<210>58

<211>5553

<212>dna

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859095

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115120125

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130135140

asngluvalthrserileleuargtrpalalysaspalaglylysser

145150155160

valglyilevalthrthrthrargvalasnhisalathrproserala

165170175

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275280285

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dkk1引物2

<400>81

caatggtctggtacttattcccg23

<210>82

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>col1a1引物1

<400>82

gagggccaagacgaagacatc21

<210>83

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>col1a1引物2

<400>83

cagatcacgtcatcgcacaac21

<210>84

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>activin引物1

<400>84

tcatcacgtttgccgagtca20

<210>85

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>activin引物2

<400>85

gctagtccgctaccatcacc20

<210>86

<211>4241

<212>dna

<213>智人

<220>

<223>人axin2mrna

<400>86

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cctggcaactcagtaacagcccgagagccgggaaataaaaataacccctcagagcgatgg120

atttcggggccgcccggcggccgaggcgcccgccgaaggccctgctgtaaaagagaggag180

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aactggaagaagaaaaattcccagactcagtgggaagagctccctcaccatgagtagcgc300

tatgttggtgacttgcctcccggaccccagcagcagcttccgtgaggatgccccgcggcc360

cccagtgccaggggaagaaggggagaccccaccgtgtcagccaggggtgggcaagggcca420

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cttattgggcgatcaagacggtgcttacctgttccgaactttcctggagagggagaaatg600

cgtggataccttagacttctggtttgcctgcaatggattcaggcagatgaacctgaagga660

taccaaaactttacgagtagccaaagcgatctacaaaaggtacattgagaacaacagcat720

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gcagattgattccatcatgtttgaccaggcgcagaccgagatccagtcggtgatggagga840

aaatgcctaccagatgtttttgacttctgatatatacctcgaatatgtgaggagtggggg900

agaaaacacagcttacatgagtaatgggggactcgggagcctaaaggtcgtgtgtggcta960

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ggaaactgttgacagtggatacaggtccttcaagaggagcgatcctgttaatccttatca1140

cataggttctggctatgtctttgcaccagccaccagcgccaacgacagtgagatatccag1200

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ttatcgtgtgggcagtaagaaacagctccagagagaaatgcatcgcagtgtgaaggccaa1320

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gttggagagccgccacagcctggaggagcgcctgcagcagatccgagaggatgaagagag1500

agagggctccgagctcacactcaattcgcgggagggggcgcccacgcagcaccccctctc1560

cctactgccctccggcagctacgaggaagacccgcagacgatactggacgatcacctgtc1620

cagggtcctcaagacccctggctgccagtctccaggcgtaggccgctatagcccccgctc1680

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ctaaggaagaatcggccagtgggccttcgggagggcggggggaggttgattttcatgatt3000

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tgtagcctttattaaaattttatatttttcaaaaaaaaaaa4241

<210>87

<211>843

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>人axin2氨基酸序列

<400>87

metserseralametleuvalthrcysleuproaspproserserser

151015

phearggluaspalaproargproprovalproglyglugluglyglu

202530

thrproprocysglnproglyvalglylysglyglnvalthrlyspro

354045

metprovalserserasnthrargargasngluaspglyleuglyglu

505560

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65707580

serleuhisserleuleuglyaspglnaspglyalatyrleuphearg

859095

thrpheleugluargglulyscysvalaspthrleuaspphetrpphe

100105110

alacysasnglypheargglnmetasnleulysaspthrlysthrleu

115120125

argvalalalysalailetyrlysargtyrilegluasnasnserile

130135140

valserlysglnleulysproalathrlysthrtyrileargaspgly

145150155160

ilelyslysglnglnileaspserilemetpheaspglnalaglnthr

165170175

gluileglnservalmetglugluasnalatyrglnmetpheleuthr

180185190

seraspiletyrleuglutyrvalargserglyglygluasnthrala

195200205

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210215220

leuprothrleuasngluglugluglutrpthrcysalaaspphelys

225230235240

cyslysleuserprothrvalvalglyleuserserlysthrleuarg

245250255

alathralaservalargserthrgluthrvalaspserglytyrarg

260265270

serphelysargseraspprovalasnprotyrhisileglysergly

275280285

tyrvalphealaproalathrseralaasnaspsergluileserser

290295300

aspalaleuthraspaspsermetsermetthraspserservalasp

305310315320

glyileproprotyrargvalglyserlyslysglnleuglnargglu

325330335

methisargservallysalaasnglyglnvalserleuprohisphe

340345350

proargthrhisargleuprolysglumetthrprovalgluproala

355360365

thrphealaalagluleuileserargleuglulysleulysleuglu

370375380

leugluserarghisserleuglugluargleuglnglnileargglu

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aspglugluarggluglysergluleuthrleuasnserargglugly

405410415

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420425430

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435440445

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450455460

argserproasphishishishishishisserglntyrhisserleu

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leuproproglyglylysleuproproalaalaalaserproglyala

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cysproleuleuglyglylysglyphevalthrlysglnthrthrlys

500505510

hisvalhishishistyrilehishishisalavalprolysthrlys

515520525

glugluileglualaglualathrglnargvalhiscysphecyspro

530535540

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545550555560

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565570575

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proargglugluglyaspargserglnaspvaltrpglntrpmetleu

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glusergluargglnserlysprolysprohisseralaglnserthr

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alaserarghishisleutrpglyglyasnserglyhisproargthr

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thrproargalahisleuphethrglnaspproalametproproleu

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glnargaspargasnhisseralathrvalglnthrglyalathrpro

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phephecysglyglugluileprotyrargargmetleulysalagln

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tyrargtyrtyrphelyslysalaseraspgluphealacysglyala

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glyargileleuglylysvalgluargileasp

835840