專(zhuān)利名稱(chēng)：雙特異性死亡受體激動(dòng)型抗體的制作方法
雙特異性死亡受體激動(dòng)型抗體本發(fā)明涉及包含特異性針對(duì)死亡受體(death receptor)的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體，其生產(chǎn)方法，包含所述抗體的藥物組合物，及其用途。由于對(duì)癌細(xì)胞上差異表達(dá)的抗原的選擇性靶向，單克隆抗體在癌癥的治療中已證明是有效的治療劑。大多數(shù)目前開(kāi)發(fā)的單克隆抗體的治療策略包括靶向腫瘤相關(guān)的抗原， 以修飾腫瘤細(xì)胞生物學(xué)，抑制生長(zhǎng)因子受體，抑制血管生成，誘導(dǎo)凋亡和通過(guò)補(bǔ)體結(jié)合的細(xì)胞毒性或抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。一些抗體靶向?qū)Π┘?xì)胞存活極其重要的生長(zhǎng)因子受體，例如曲妥珠單抗(Herceptin )和西妥昔單抗(Erbitux )。用激動(dòng)型單克隆抗體靶向癌細(xì)胞上的TRAIL死亡受體代表了新一代單克隆抗體治療，因?yàn)槠淠軌蛑苯诱T導(dǎo)靶向的細(xì)胞的凋亡。使用針對(duì)死亡受體(而不是TRAIL)的激動(dòng)型單克隆抗體可能是有利的TRAIL靶向包括死亡受體和誘捕受體(decoy receptor)的多種受體，因此影響到選擇性。另外，相比單克隆抗體，TRAIL具有短得多的血液半衰期，這是影響劑量和時(shí)間表參數(shù)的一個(gè)因素。 相比單克隆抗體，TRAIL的非常短的血液半衰期將需要大量和頻繁的劑量。另外，生產(chǎn)重組 TRAIL是非常困難和耗時(shí)的。Michaelson J. S.等人(mAbs，卷 1，期號(hào) 2，ρ :128-141 ；2009 年 3 月 /4 月)描述了改造的I gG樣雙特異性抗體，其靶向2種TNF家族成員受體，即TRAIL-R2 (TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體- 和LT β R (淋巴毒素β受體)。Herrmann Τ.等人(Cancer Res 2008 ；68 :(4) ；ρ :1221-1227)描述了針對(duì) CD95/ Fas/Αρο-Ι細(xì)胞表面受體和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞上的3種靶抗原NG2，EGFR和⑶40的雙特異性單價(jià)化學(xué)結(jié)合的Fab分子。本發(fā)明涉及組合靶向死亡受體的抗原結(jié)合位點(diǎn)和靶向第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。由此死亡受體變得交聯(lián)并誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。這些雙特異性死亡受體激動(dòng)型抗體相比傳統(tǒng)的靶向死亡受體的抗體的優(yōu)勢(shì)在于，僅在表達(dá)第二抗原的位點(diǎn)誘導(dǎo)凋亡的特異性。在第一個(gè)方面(object)，本發(fā)明涉及包含特異性針對(duì)死亡受體抗原的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體。在雙特異性抗體的優(yōu)選實(shí)施方案中，死亡受體選自死亡受體4多肽(DR4)，死亡受體5多肽(DR5)或FAS多肽，優(yōu)選地人DR4多肽(Seq. Id. No. 1)，人DR5多肽(Seq. Id. No. 2) 或人 FAS 多肽(Seq. Id. No. 3)。在雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二抗原與腫瘤疾病或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。在雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二抗原選自癌胚抗原(CEA)多肽，CRIPTO蛋白，神奇迂回(magic roundabout)同源物4(R0B04)多肽，黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)多肽，腱生蛋白C多肽和成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)多肽，優(yōu)選地人 CEA 多肽(Seq. Id. No. 4)，人 CRIPTO 多肽(Seq. Id. No. 5)，人 R0B04 多肽(Seq. Id. No. 6)， 人MCSP多肽(Seq. Id. No. 7)，人腱生蛋白C多肽(Seq. Id. No. 8)和人FAP多肽(Seq.Id. No. 9)。在雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗體是包含第一抗體和第二抗體的二聚分子，所述第一抗體包含第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和所述第二抗體包含第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的二聚雙特異性抗體的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一和第二抗體包含抗體重鏈的Fc部分，其中第一抗體的Fc部分包含第一二聚化模塊，第二抗體的Fc部分包含第二二聚化模塊，從而允許2種抗體的異源二聚化。在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)杵臼結(jié)構(gòu)(knobs into holes)策略(見(jiàn) Carter P. ；Ridgway J. B. B. ；Presta L. G. :Immunotechnology,卷 2,號(hào) 1，1996年2月，pp. 73-73(1))，第一二聚化模塊包含杵(knob)和第二二聚化模塊包含臼
(hole) ο在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一抗體是包含輕鏈和重鏈的免疫球蛋白(Ig)分子，和第二抗體選自scFv, SCFab，F(xiàn)ab或Fv。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含相比野生型Fc部分對(duì)Fc Y受體具有降低的結(jié)合親和力的修飾的Fc部分，例如LALA修飾。在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，Ig分子包含特異性針對(duì)死亡受體的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和第二抗體包含特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。在雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，Ig分子包含特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，和第二抗體包含特異性針對(duì)死亡受體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二抗體被融合在Ig分子重鏈的N-或C-端。在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二抗體被融合在Ig分子輕鏈的N-或C-端。在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，Ig分子是IgG。在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二分子通過(guò)肽接頭，優(yōu)選地具有約10-30氨基酸長(zhǎng)度的肽接頭融合至Ig分子。在二聚雙特異性抗體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二抗體包含另外的半胱氨酸殘基以形成二硫鍵。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體至少是二價(jià)的且可為三價(jià)或多價(jià)的，例如四價(jià)或六價(jià)的。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的雙特異性抗體的藥物組合物。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于治療癌癥或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的本發(fā)明的雙特異性抗體。在另外的方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明的雙特異性抗體重鏈的序列的核酸序列，包含編碼本發(fā)明的雙特異性抗體輕鏈的序列的核酸序列，包含本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)載體，并涉及包含本發(fā)明的載體的原核或真核宿主細(xì)胞。發(fā)明詳述本文使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指本發(fā)明的多肽，即來(lái)自任意動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物物種 (包括人)的DR4，DR5，F(xiàn)AS, CEA, CRIPT0, R0B04, MCSP，腱生蛋白C和FAP的天然氨基酸序列和序列變體?！疤烊欢嚯摹敝妇哂信c天然存在的多肽相同的氨基酸序列的多肽，不管其制備模式。術(shù)語(yǔ)“天然多肽”特別包含本發(fā)明的多肽的天然存在的截短或分泌的形式，天然存在的變體形式(例如另外的剪接形式)，和天然存在的等位基因變體。在序列表中的氨基酸序列 (Seq. Id. No. 1-9)指本發(fā)明的蛋白質(zhì)的天然人序列。術(shù)語(yǔ)“多肽變體”指在天然序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代和/或缺失和/或插入的天然序列的氨基酸序列變體。氨基酸序列變體一般與本發(fā)明的多肽的天然序列的氨基酸序列具有至少約75 %，優(yōu)選至少約80 %，更優(yōu)選至少約85 %，甚至更優(yōu)選至少約90 %， 最優(yōu)選至少約95%的序列同一性。術(shù)語(yǔ)“抗體”包含抗體結(jié)構(gòu)的多種形式，包括但不限于整個(gè)抗體和抗體片段。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選地是全人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，或其它基因改造的抗體，只要其保留根據(jù)本發(fā)明的特征性能?！翱贵w片段”包含全長(zhǎng)抗體的一部分，優(yōu)選地其可變結(jié)構(gòu)域，或至少其抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗體片段的實(shí)例包括雙抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。在例如 Houston，J. S.，Methods in Enzymol. 203(1991)46-96)中描述了 scFv 抗體。另外，抗體片段包含具有VH結(jié)構(gòu)域特征(即能夠與VL結(jié)構(gòu)域組裝在一起)，或具有VL結(jié)構(gòu)域特征 (即能夠與VH結(jié)構(gòu)域組裝在一起)，以形成功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)并因此提供全長(zhǎng)抗體的抗原結(jié)合性能的單鏈多肽。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一氨基酸組成的抗體分子的制備物。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指包含來(lái)自一種來(lái)源或物種的可變區(qū)即結(jié)合區(qū)，以及至少一部分來(lái)源于不同來(lái)源或物種的恒定區(qū)的抗體，通常通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。優(yōu)選包含鼠源可變區(qū)和人源恒定區(qū)的嵌合抗體。由本發(fā)明包括的“嵌合抗體”的其他優(yōu)選形式是其中恒定區(qū)已經(jīng)從原始抗體的恒定區(qū)得以修飾或改變，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的那些嵌合抗體。此類(lèi)嵌合抗體也稱(chēng)為“類(lèi)別轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段的免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法涉及本領(lǐng)域熟知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染方法。參見(jiàn)，例如，Morrison，S. L.等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984)6851-6855; 美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，202，238 和 5，204，244。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指這樣的抗體，其中框架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(OTR)已經(jīng)被修飾， 以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性的免疫球蛋白的CDR。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將鼠CDR移植至人抗體的框架區(qū)，以制備“人源化抗體”。參見(jiàn)例如，Riechmarm，L.等， Nature 332 (1988) 323-327 ；以及 Neuberger，Μ· S.等，Nature 314(1985068-270。特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于提供這樣序列的CDR，所述序列識(shí)別上述嵌合抗體的抗原。由本發(fā)明包括的 “人源化抗體”的其他形式是其中恒定區(qū)已經(jīng)從原始抗體的恒定區(qū)得以修飾或改變，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的那些人源化抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人抗體”旨在包括具有來(lái)源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體在本領(lǐng)域是眾所周知的(van Dijk, Μ. Α.和van de Winkel, J. G.，Curr · Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。人抗體也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)中生產(chǎn)，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)免疫后能夠生產(chǎn)全部或選擇的人抗體，而無(wú)內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變小鼠中導(dǎo)致在抗原刺激時(shí)生產(chǎn)人抗體(參見(jiàn)例如Jakobovits，A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555 Jakobovits, Α.等，Nature 362(1993)255-258 ；Bruggemann, Μ.等，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人抗體也可以在噬菌體展示文庫(kù)中生產(chǎn) (Hoogenboom, H. R.和 Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.等，J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。還可以利用Cole等及Boerner等的技術(shù)制備人單克隆抗體 (Cole Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)；禾口 Boerner，P.等，J. Immunol. 147(1991)86-95)。如已經(jīng)提及的根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體，如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“人抗體”也包含其中例如通過(guò)“類(lèi)別轉(zhuǎn)換”(即改變或突變 Fc部分，例如從IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4的突變)修飾恒定區(qū)，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的此類(lèi)抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”旨在包括通過(guò)重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的所有人抗體，例如，從宿主細(xì)胞例如NSO或CHO細(xì)胞或者從轉(zhuǎn)基因人免疫球蛋白基因的動(dòng)物 (例如小鼠)中分離的抗體或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。此類(lèi)重組人抗體具有以重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)?？梢詫⒏鶕?jù)本發(fā)明的重組人抗體進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞高度突變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是在體內(nèi)人抗體種系所有組成成分內(nèi)并不天然存在的序列，盡管其來(lái)源于并與人種系VH和VL序列有關(guān)。如本文所用的“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)、重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH))表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每一對(duì)輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域。輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，并且每一區(qū)域包含由三個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，⑶R)連接的序列廣泛保守的四個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)。該構(gòu)架區(qū)采用β折疊構(gòu)象，并且⑶R可以形成連接β折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。 每一鏈中的CDR通過(guò)構(gòu)架區(qū)固定在其三維結(jié)構(gòu)中并與來(lái)自其他鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中起著特殊的重要作用，并因此提供了本發(fā)明的另外目的。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基?？贵w的抗原結(jié)合部分包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或 “FR”區(qū)是非如本文中定義的高變區(qū)殘基的這些可變區(qū)區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域從N末端到C末端包含區(qū)域FRl、OTRl、FR2、raR2、FR3、raR3和FR4。特別地，重鏈的 ⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的和定義抗體性能的區(qū)域。⑶R和FR根據(jù)Kabat等，kquences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或來(lái)自“高變環(huán)”的殘基確定?？贵w特異性指抗體對(duì)抗原的特定表位的選擇性識(shí)別。例如天然抗體是單特異性的。根據(jù)本發(fā)明，“雙特異性抗體”是具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的抗體特異性針對(duì)兩種不同的抗原，即作為第一抗原的死亡受體抗原和第二抗原。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“單特異性”抗體指具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體，其中每一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合相同抗原的相同表位。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“雙特異性”抗體指具有至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體，其中每一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合相同抗原或不同抗原的不同表位。
如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)“價(jià)”指在抗體分子中存在的結(jié)合位點(diǎn)的具體數(shù)目。因此， 術(shù)語(yǔ)“二價(jià)的”、“四價(jià)的”和“六價(jià)的”指在抗體分子中分別存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)、四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和六個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體至少是“二價(jià)的”，且可為“三價(jià)的”或“多價(jià)的”(例如“四價(jià)的”或“六價(jià)的”)。本發(fā)明的抗體具有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且是雙特異性的。即，甚至在存在多于兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(即抗體是三價(jià)的或者多價(jià)的)的情況下，抗體也可以是雙特異性的。本發(fā)明的雙特異性抗體包括，例如多價(jià)單鏈抗體，雙抗體和三鏈抗體，以及具有全長(zhǎng)抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的抗體，其上可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)肽接頭連接另外的抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如單鏈 Fv，VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab或(Fab) 2)。抗體可為來(lái)自單個(gè)物種的全長(zhǎng)抗體，或?yàn)榍逗系幕蛉嗽椿摹！皢捂淔ab片段”是由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和接頭組成的多肽，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭從N-端至C-端方向上具有以下順序之一a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 d) VL-CHl-接頭-VH-CL ；其中所述接頭是至少30氨基酸，優(yōu)選在32和50氨基酸之間的多肽。 所述單鏈 Fab 片段 a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 和d) VL-CHl-接頭-VH-CL通過(guò)在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的天然的二硫鍵穩(wěn)定。另夕卜， 可通過(guò)半胱氨酸殘基的插入(例如，在根據(jù)Kabat編號(hào)的重鏈可變區(qū)第44位和輕鏈可變區(qū)第100位之間)形成鏈間二硫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定這些單鏈Fab分子。術(shù)語(yǔ)“N-端”指N-端的最后一個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“C-端”指C-端的最后一個(gè)氨基酸。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸分子，，旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。如在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然存在的羧基α -氨基酸組，其包括丙氨酸(三字母編碼ala，單字母編碼A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp， D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，Ε)，甘氨酸(gly，G)，組氨酸(his， H)，異亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，賴(lài)氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe， F)，脯氨酸(pro，P)，絲氨酸(ser，S)，蘇氨酸(thr，Τ)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)， 和纈氨酸(val，V)。當(dāng)核酸與另一核酸序列處于功能關(guān)聯(lián)狀態(tài)時(shí)，其“有效連接”。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA的連接表達(dá)為參與所述多肽分泌的前蛋白，則他們有效連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的連接影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則他們有效連接；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列的排置有利于翻譯，則他們有效連接。通常，“有效連接”表示連接的 DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)序列的情況下是相鄰且同讀框連接的。不過(guò)，增強(qiáng)子不必相鄰。連接通過(guò)便利的限制性位點(diǎn)處的連接實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，則按照常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸適配體(adaptor)或接頭。如本文使用的，措辭“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”是互換使用的，且所有名稱(chēng)包括其后代。因此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)染體”和“轉(zhuǎn)染細(xì)胞”包括原代對(duì)象細(xì)胞和來(lái)源于其的培養(yǎng)物，不管傳代次數(shù)。也應(yīng)當(dāng)理解，由于故意或無(wú)意突變，所有后代在DNA含量中不是精確相同的。包括與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞所篩選的功能或生物學(xué)活性具有相同功能或生物學(xué)活性的變體
8后代。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指在體外測(cè)定中，優(yōu)選在表面等離子共振(SPR，BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)測(cè)定中，抗體與抗原表位的結(jié)合。通過(guò)術(shù)語(yǔ)ka (抗體/抗原復(fù)合物中的抗體的結(jié)合速率常數(shù))，kD (解離常數(shù))和KD(kD/ka)定義結(jié)合親和力。結(jié)合或特異性結(jié)合指10_8mol/l或更低，優(yōu)選101至10_13mol/l的結(jié)合親和力(KD)?？赏ㄟ^(guò)BIAcore測(cè)定(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)研究抗體與死亡受體的結(jié)合。通過(guò)術(shù)語(yǔ)ka(抗體/抗原復(fù)合物中的抗體的結(jié)合速率常數(shù))，kD(解離常數(shù))和 KD(kD/ka)定義結(jié)合親和力。術(shù)語(yǔ)“表位”包括能夠與抗體特異性結(jié)合的任意多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中， 表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，在某些實(shí)施方案中，可以具有特殊三維結(jié)構(gòu)特征和/或特殊電荷特征。表位是抗原結(jié)合抗體的區(qū)域?？贵w的“Fe部分”不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展示多種效應(yīng)子功能?！翱贵w的Fc部分”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語(yǔ)，并基于抗體的木瓜蛋白酶切割定義。取決于抗體的重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，將抗體或免疫球蛋白分為=IgA型、IgD型、IgE型、IgG型和 IgM型，并且可以將這些的幾種進(jìn)一步分成亞型(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、 IgAl和IgA2。根據(jù)重鏈恒定區(qū)將免疫球蛋白的不同種類(lèi)分別稱(chēng)為α，δ，ε，Y和μ。抗體的Fc部分直接參與基于補(bǔ)體激活、Clq結(jié)合和Fc受體結(jié)合的ADCC (抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和⑶C(補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性)。補(bǔ)體活化(⑶C)通過(guò)補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)I gG 抗體亞型的Fc部分結(jié)合引發(fā)。盡管抗體對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的影響取決于特定的條件，通過(guò)Fc部分中的確定的結(jié)合位點(diǎn)引起與Clq的結(jié)合。這樣的結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并例如由 Boakl e 等人，Nature 282(1975)742-743, Lukas 等人，J. Immunol. 127(1981)2555-2560， Brunhouse and Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979)907-917, Burton 等人，Nature 288(1980)338-344，Thommesen 等人，Mol. Immunol. 37(2000)995-1004, Idusogie 等人， J. Immunol. 164(2000)4178-4184, Hezareh 等人，J. Virology 75(2001) 12161-12168, Morgan 等人，Immunology 86 (1995) 319-324，EP 03074 描述。這樣的結(jié)合位點(diǎn)是，例如， L234、L235、D270、擬97、E318、K320、K322、P331 和 (根據(jù) Kabat 的 EU 索引編號(hào)，見(jiàn)下)。 IgGl, IgG2和IgG3亞類(lèi)的抗體通常顯示補(bǔ)體激活和Clq和C3結(jié)合，而IgG4不激活補(bǔ)體系統(tǒng)且不結(jié)合Clq和C3。根據(jù)本發(fā)明的抗體通過(guò)重組手段生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的核酸，且進(jìn)一步的方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的所述核酸的細(xì)胞。用于重組產(chǎn)生的方法在本領(lǐng)域廣為人知，并且包括在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，隨后分離抗體多肽，并通常純化至可藥用的純度。為在宿主細(xì)胞中表達(dá)如前所述的抗體，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將各自編碼修飾的輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體中。在合適的原核或真核宿主細(xì)胞如 CHO 細(xì)胞、NSO 細(xì)胞、SP2/0 細(xì)胞、HEK293(包括 HEK293 EBNA)細(xì)胞、COS 細(xì)胞、PER. C6 細(xì)胞、 酵母或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從細(xì)胞(裂解后的上清液或細(xì)胞)中回收抗體。用于抗體的重組生產(chǎn)的一般方法在本領(lǐng)域眾所周知，并描述于例如Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183—202 ；Geisse, S.等，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman,R. J.，Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 的綜
述文章中?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化方法例如，如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)胤蛛x根據(jù)本發(fā)明的抗體。編碼單克隆抗體的DNA和RNA利用常規(guī)方法很容易分離，并進(jìn)行測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可用作為此類(lèi)DNA和RNA 的來(lái)源。DNA —經(jīng)分離，即可將DNA插入到表達(dá)載體中，隨之轉(zhuǎn)染到否則將不生產(chǎn)免疫球蛋白的宿主細(xì)胞例如HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞中重組單克隆抗體的合成。通過(guò)將合適的核苷酸改變引入到抗體DNA中，或者通過(guò)核苷酸合成制備根據(jù)本發(fā)明的抗體的氨基酸序列變體(或突變體)?？梢赃M(jìn)行此類(lèi)修飾，然而，僅以非常有限的范圍， 例如，如上所述。例如，修飾并不改變上述的抗體特征，例如IgG同種型和抗原結(jié)合，但可以改進(jìn)重組產(chǎn)物的產(chǎn)率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或有助于純化。如在本申請(qǐng)中所有，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指可以工程改造以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體的任一類(lèi)型的細(xì)胞系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞用作為宿主細(xì)胞。如本文使用的，措辭“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”是互換使用的，且所有名稱(chēng)包括其后代。因此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)染體”和“轉(zhuǎn)染細(xì)胞”包括原代對(duì)象細(xì)胞和來(lái)源于其的培養(yǎng)物，不管傳代次數(shù)。也應(yīng)當(dāng)理解，由于故意或無(wú)意突變，所有后代在DNA含量中不是精確相同的。包括與用于篩選原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞的功能或生物學(xué)活性具有相同功能或生物學(xué)活性的變體后代。在NSO 細(xì)胞中表達(dá)由例如，Barnes, L. Μ.等，Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ； Barnes, L. Μ.等，Biotech. Bioeng. 73 Q001)洸1_270 描述。瞬時(shí)表達(dá)由例如，Durocher, Y.等，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 描述?？勺儏^(qū)的克隆由 Orlandi，R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289 ；和 Norderhaug，L.等，J. Immunol. Methods 204(1997)77-87 描述。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK 293)由 khlaeger，Ε. -J.，and Christensen, K.， 在 Cytotechnology 30(1999)71—83 中禾口由 Schlaeger，Ε.-J.，在 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199 中描述。適合于原核生物的調(diào)控元件序列，例如，包括啟動(dòng)子，備選的操縱序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。真核細(xì)胞已知利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多聚腺苷化作用信號(hào)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括本領(lǐng)域眾所周知的堿/SDS處理、氯化銫分帶(CsClbanding)、 柱層析、瓊脂糖凝膠電泳等等進(jìn)行抗體的純化，以除去其他細(xì)胞組分或其他雜質(zhì)，如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)(參見(jiàn)Ausubel，F(xiàn).等編輯Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987))。已經(jīng)建立了不同的方法并廣泛用于蛋白質(zhì)純化，例如使用微生物蛋白質(zhì)的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如陽(yáng)離子交換(羧甲基樹(shù)脂)、陰離子交換(氨乙基樹(shù)脂)和混合模式交換)、親硫吸附(例如用β -巰基乙醇和其他SH配體)、疏水作用或芳族吸附層析(例如用苯基瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹(shù)脂或間-氨基苯基硼酸 (m-aminophenylboronic acid))、金屬螯合親和層析(例如用Ni(II)和Cu(II)親和材料)大小排阻層析和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi，Μ. A. App 1. Biochem. Biotech. 75(1998)93—102)。
如本文中所用，“藥物載體”包括生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、 抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。優(yōu)選載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊錐(spinal)或表皮給藥(例如通過(guò)注射或輸注)。本發(fā)明的組合物可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法給藥。正如技術(shù)人員將會(huì)理解的那樣，給藥路徑和/或方式將隨期望的結(jié)果而變動(dòng)。為通過(guò)某些給藥路徑給藥本發(fā)明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料對(duì)其進(jìn)行包衣，或化合物與之共給藥。例如，可以向受試者給藥處于適宜載體例如脂質(zhì)體或稀釋劑中的化合物。可藥用稀釋劑包括鹽溶液和水性緩沖溶液?？伤幱幂d體包括無(wú)菌水性溶液或分散液，以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散液的無(wú)菌粉劑。此類(lèi)介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。如本文所用的短語(yǔ)“腸胃外給藥”和“經(jīng)腸胃外給藥”，表示不同于腸和局部給藥的給藥方式，通常是通過(guò)注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)癌癥指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、非小細(xì)胞肺(NSCL)癌、細(xì)支氣管細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸的癌、皮的或眼內(nèi)的黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)的癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、 結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管的癌、子宮內(nèi)膜的癌、子宮頸的癌、陰道的癌、外陰的癌、霍奇金病、食管的癌、小腸的癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌、甲狀腺的癌、甲狀旁腺的癌、腎上腺的癌、軟組織的肉瘤、尿道的癌、陰莖的癌、前列腺癌、膀胱的癌、腎或輸尿管的癌、腎細(xì)胞癌、腎盂的癌、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的瘤、脊椎軸腫瘤(spinal axis tumor)、 腦干膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤、斯萬(wàn)細(xì)胞瘤、室管膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細(xì)胞癌、垂體腺瘤和尤文肉瘤，包括任一上述癌的難治類(lèi)型或者一種或多種上述癌的組合。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。通過(guò)前述滅菌操作，以及通過(guò)納入多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，均可以確保防止微生物的存在。還可能期望在組合物中納入等滲劑，如糖、氯化鈉等。另外，可注射藥物形式的延遲吸收可以通過(guò)納入延遲吸收的藥劑如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)。無(wú)論所選的施用路徑如何，可以以適宜水合物形式使用的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法配制為可藥用劑型。根據(jù)本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可有變動(dòng)，以獲得有效量的活性成分，從而對(duì)于特定的患者、組合物和給藥方式實(shí)現(xiàn)期望的治療反應(yīng)，而對(duì)患者沒(méi)有毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明特定組合物的活性、給藥路徑、給藥時(shí)間、所采用特定化合物的排泄速率、與所采用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健康和既往病史、 以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類(lèi)似因素。組合物必需是無(wú)菌和流動(dòng)的，從而組合物可以通過(guò)注射器遞送。除了水之外，載體還可以是等滲緩沖鹽溶液。例如，可以通過(guò)使用包衣如卵磷脂，分散劑的情況下通過(guò)維持所需的顆粒大小，通過(guò)使用表面活性劑，來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中納入等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化鈉。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的方法。如果將沒(méi)有堅(jiān)固的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞用作為宿主細(xì)胞，例如通過(guò)如Graham，F(xiàn). L.，和van der Eb, A.J.，Virology 52 (1973) 456-467所述的磷酸鈣沉淀方法實(shí)施轉(zhuǎn)染。然而，也可以使用將DNA引入細(xì)胞的其他方法，例如通過(guò)核注射或通過(guò)原生質(zhì)體融合。如果使用含有堅(jiān)固的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的原核細(xì)胞或細(xì)胞，例如，轉(zhuǎn)染的一種方法是使用如由Cohen，S.N.等， PNAS. 69 (197 2110-2114所述的氯化鈣的鈣處理。如本文中所用，“表達(dá)”指核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA的過(guò)程和/或所述轉(zhuǎn)錄的mRNA (也稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄物)隨后翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽都稱(chēng)為基因產(chǎn)物。如果多核苷酸來(lái)源于基因組DNA，那么在真核細(xì)胞中表達(dá)包括mRNA的剪接?！拜d體”是將核酸分子插入到宿主細(xì)胞中和/或之間的，特別是自復(fù)制的核酸分子。 該術(shù)語(yǔ)包括主要用于將DNA或RNA插入到細(xì)胞中(例如，染色體整合)的載體，載體的復(fù)制主要用于DNA或RNA的復(fù)制，以及用于DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的表達(dá)載體。也包括提供一個(gè)以上的如上所述功能的載體。“表達(dá)載體”是當(dāng)將其引入到合適的宿主細(xì)胞時(shí)，能轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的多核苷酸。“表達(dá)系統(tǒng)”通常指包含可以用于產(chǎn)生想要的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體的合適宿主細(xì)胞。提供如下實(shí)施例、序列列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍闡釋在所附權(quán)利要求書(shū)中。應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)所示的操作進(jìn)行改動(dòng)而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神。附圖簡(jiǎn)述圖 1:在不同人細(xì)胞系(Lovo, 0VCAR-3, AsPC-1，BxPC3, LS174T 和 MKN-45)中的CEA，DR5和FAS表達(dá)水平的FACS結(jié)合分析，使用未標(biāo)記的市售鼠IgGl抗體(CEA Abcam# 11330 ；DR5 :R&D#MAB631 ；FAS :BD#555671)和常用的山羊抗小鼠 FITC 標(biāo)記的 IgG (Serotec Starl05F)檢測(cè)。使用僅包含細(xì)胞或包含細(xì)胞和僅第二抗體的樣品作為對(duì)照。 除了 Lovo細(xì)胞以外，所有檢測(cè)的細(xì)胞系在表面上表達(dá)大量的DR5和FAS。與這相比，CEA表達(dá)非常低。當(dāng)用針對(duì)3種抗原的其他抗體檢測(cè)相同的細(xì)胞時(shí)，Lovo細(xì)胞也在FACS分析中為DR5，F(xiàn)AS和CEA表達(dá)陽(yáng)性的(數(shù)據(jù)未顯示)。圖2 在與市售的能夠在溶液中誘導(dǎo)凋亡的無(wú)交聯(lián)的抗體(DR5 :R&D#MAB631 ；FAS Millipore/Ups tate =CHll)孵育4小時(shí)后，不同細(xì)胞系的凋亡誘導(dǎo)(DNA片段化測(cè)定)分析。為了檢測(cè)凋亡，使用用于分析組蛋白相關(guān)的DNA片段化的細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISAPLUS試劑盒。在BxPC-3，Lovo和LS174T細(xì)胞中，通過(guò)DR5和FAS可明顯地誘導(dǎo)凋亡，而ASPC-I細(xì)胞完全沒(méi)有經(jīng)歷凋亡。相比其他細(xì)胞系，MKN-45細(xì)胞對(duì)DR5更具抗性。圖3 與ApomAM白色條)、與抗人Fc抗體交聯(lián)的ApomAb (陰影線灰色條)、 ApomAb_Sm;3e_A(黑色條)和ApomAb_Sm;3e_Al (帶點(diǎn)灰色條)雙特異性分子孵育4小時(shí)后 LS174T細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡(DNA片段化測(cè)定)?？蓹z測(cè)通過(guò)雙特異性抗體靶向的高度交聯(lián)的 CEA結(jié)合依賴(lài)的凋亡的誘導(dǎo)。此作用與通過(guò)ApomAb的交聯(lián)誘導(dǎo)的凋亡在相同的范圍內(nèi)，并可通過(guò)與過(guò)量的sm;3e IgG的預(yù)孵育完全消除。在對(duì)照(僅有細(xì)胞或Sm;3e IgG)中未觀察到凋亡，且單獨(dú)的ApomAb在使用的濃度(lyg/ml)上沒(méi)有誘導(dǎo)凋亡。圖4 在使用與凋亡誘導(dǎo)劑孵育4小時(shí)的LS174T細(xì)胞的DNA片段化測(cè)定中，相比單獨(dú)的ApomAb (白色條)或與抗人Fc抗體交聯(lián)的ApomAb (陰影線灰色條)，不同的ApomAb_ Sm;3e雙特異性分子的凋亡誘導(dǎo)活性的比較。大體上，其中sm;3e scFv與ApomAb重鏈的C-端融合的分子(形式A，黑色條)似乎比其中Sm;3e scFv與ApomAb輕鏈的C-端融合的構(gòu)建體 (形式B，灰色條)活性高。此外，包含二硫化物穩(wěn)定的scFv的雙特異性抗體(形式Al，帶點(diǎn)灰色條和Bi，小網(wǎng)格條)似乎比具有野生型scFv的分子活性略差。圖5 與ApomAM白色條)、與抗人Fc抗體交聯(lián)的ApomAb (陰影線灰色條)或 ApomAb_PRlA3_A雙特異性構(gòu)建體(黑色條)孵育4小時(shí)后的LS174T細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)分析 (DNA片段化測(cè)定)。在每種情況下，凋亡誘導(dǎo)都依賴(lài)于使用的抗體濃度。單獨(dú)的ApomAb 也在高濃度下誘導(dǎo)了低水平的凋亡，但通過(guò)交聯(lián)凋亡水平顯著提高了。雙特異性ApomAb_ PR1A3_A分子在沒(méi)有第二交聯(lián)劑時(shí)甚至比交聯(lián)的ApomAb活性更高。圖6 與ApomAb (白色條)、與抗人Fc抗體交聯(lián)的ApomAb (灰色條)或ApomAb_ PR1A3_A雙特異性構(gòu)建體(黑色條)孵育4小時(shí)后的Lovo細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)分析(DNA片段化測(cè)定)。在每種情況下，凋亡誘導(dǎo)都依賴(lài)于使用的抗體濃度。單獨(dú)的ApomAb也在高濃度下誘導(dǎo)了低水平的凋亡(如上所述)，但通過(guò)交聯(lián)凋亡水平顯著提高了。雙特異性ApomAb_ PR1A3_A分子自身與交聯(lián)的ApomAb —樣有活性。圖7 在與不同凋亡誘導(dǎo)雙特異性抗體孵育4小時(shí)后，在LS174T細(xì)胞中的DNA片段化的比較。使用的分子是ApomAb_PRlA3雙特異性分子，其中PRlA3scFV(Wt = Α/Β或二硫化物穩(wěn)定的=Α1/Β1)與重鏈(Α，陰影線灰色條)或輕鏈(B，帶點(diǎn)條)的C端融合。盡管在此情況下scFv的融合位置似乎就凋亡誘導(dǎo)而言沒(méi)有區(qū)別，使用的融合scFv的類(lèi)型卻是重要的相比包含與ApomAb融合的wt scFv,使用二硫化物穩(wěn)定的scFv幾乎完全消除了凋亡的誘導(dǎo)(分別是灰色和黑色條)。由于PR1A3相比Sm;3e的較低的親和力，用包含raiA3 的雙特異性分子的整體凋亡誘導(dǎo)也較低。圖8 =ApomAb-CEA (PR1A3)雙特異性構(gòu)建體在MKN-45細(xì)胞上的FACS結(jié)合分析。比較了具有野生型㈧或二硫化物穩(wěn)定的scFv(Al)的ApomAb_PRlA3雙特異性構(gòu)建體。兩種雙特異性構(gòu)建體都以濃度依賴(lài)的方式與靶細(xì)胞結(jié)合，但包含野生型scFv形式的PR1A3的分子比包含二硫化物穩(wěn)定的raiA3scFv的分子以高得多的親和力結(jié)合抗原。圖9 在NCCIT和重組的表達(dá)CRIPTO的HEK293細(xì)胞上通過(guò)FACS結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 CRIPTO, FAS和DR5表面表達(dá)分析。相比重組的HEK293-CRIPT0細(xì)胞，NCCIT細(xì)胞不表達(dá) FAS，僅表達(dá)少量的CRIPTO但表達(dá)類(lèi)似量的DR5。后一種細(xì)胞顯示了低水平的FAS，顯著水平的DR5和相當(dāng)高水平的CRIPTO表達(dá)。

圖10 使用FAS (HFE7A IgG)，通過(guò)抗人Fc抗體交聯(lián)的FAS (HFE7A IgG)和 FAS-CRIPTO雙特異性分子(HFE7A_LC020H3L2Dl，其中wt(A)或二硫化物穩(wěn)定的(Al)CRIPTO scFv與HFE7A重鏈的C端融合)的凋亡誘導(dǎo)比較(在HEK293-CRIPT0細(xì)胞中的DNA片段化)。單獨(dú)的FAS IgG，單獨(dú)的CRIPTO IgG和FAS-MCSP雙特異性分子不誘導(dǎo)凋亡，而交聯(lián)的FAS和HFE7A-CRIPT0雙特異性分子在4小時(shí)的孵育后顯示了 DNA片段化，所述DNA片段化可通過(guò)與過(guò)量的抗CRIPTO IgG預(yù)孵育部分消除。圖11 相比重組的HEK293_FAP(成纖維細(xì)胞活化蛋白)細(xì)胞(白色條)，在重組的 HEK293-CRIPT0細(xì)胞(黑色條)中通過(guò)HFE7A-CRIPT0雙特異性分子的凋亡誘導(dǎo)(DNA片段化測(cè)定)。在兩種細(xì)胞系中，可使用誘導(dǎo)凋亡的市售抗體(CHll)和使用通過(guò)第二種Fc特
13異性抗體交聯(lián)的HFE7A IgG誘導(dǎo)凋亡，而單獨(dú)的HFE7A在所使用條件下不誘導(dǎo)凋亡。使用雙特異性FAS-CRIPT0分子的凋亡誘導(dǎo)比用交聯(lián)的HFE7A IgG更高，但不能通過(guò)與過(guò)量的抗 CRIPTO IgG預(yù)孵育被完全抑制。在HEK293-FAP細(xì)胞中可觀察到一定的低背景凋亡，這也不能被過(guò)量的CRIPTO IgG完全競(jìng)爭(zhēng)(out-competed)。甚至陰性對(duì)照分子(其中二硫化物穩(wěn)定的MCSP特異性scFv與HFE7A重鏈的C端融合)在HEK293-FAP細(xì)胞中顯示了低程度的凋亡。圖12 使用2種不同抗體在不同細(xì)胞系(MCF7，SkBr3, A431，A549, HCT-116和 U87-MG)上測(cè)定MCSP表面表達(dá)水平的FACS結(jié)合分析。使用2種抗體都可檢測(cè)到相同水平的MCSP表達(dá)，表明U87-MG顯示了最高的MCSP表達(dá)，HCT-116具有低MCSP表達(dá)，而所有其他檢測(cè)的細(xì)胞系為MCSP陰性的(在陰性對(duì)照例如未染色細(xì)胞的范圍中)。圖13 使用可溶的和交聯(lián)的ApomAb (黑色條)和HFE7A(灰色條)和相關(guān)對(duì)照分子(單獨(dú)的抗FAS_CH11，抗DR5_R2和抗Fc-IgG)評(píng)估U87_MG(A)和HCT-116 (B)細(xì)胞的凋亡能力。盡管在HCT-116細(xì)胞中僅可通過(guò)DR5受體在4小時(shí)后誘導(dǎo)凋亡且不通過(guò)FAS誘導(dǎo)凋亡，在U87-MG細(xì)胞中則不同。這里，在M小時(shí)后才觀察到顯著的凋亡。與HCT-116細(xì)胞相反，通過(guò)交聯(lián)的HFE7A的U87-MG凋亡誘導(dǎo)效率是使用交聯(lián)的ApomAb的2倍。已經(jīng)在溶液中賦予凋亡的對(duì)照抗體甚至更有效。圖14 與雙特異性HFE7A-MCSP抗體(mAb 9. 2. 27)(其中野生型(A形式)或二硫化物穩(wěn)定的MCSP scFv (Al形式)與ApomAb重鏈的C-端融合)孵育M小時(shí)后在U87-MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)分析。在此情況中，包含二硫化物穩(wěn)定的scFv的構(gòu)建體證明了比包含野生型scFv的分子顯著更高的凋亡(盡管通過(guò)DNA片段化測(cè)量的凋亡量相對(duì)低)。 然而，在兩種情況下，可通過(guò)細(xì)胞與過(guò)量競(jìng)爭(zhēng)MCSP IgG的預(yù)孵育完全消除凋亡的誘導(dǎo)。圖15 2種不同細(xì)胞系(SW872和GM05389)的人成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)表達(dá)水平的FACS結(jié)合分析(A)。使用不同濃度的抗FAP抗體測(cè)量的熒光強(qiáng)度在3個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍上顯示(黑色、灰色和陰影線條)。僅有第二抗體和細(xì)胞的陰性對(duì)照反應(yīng)分別以帶點(diǎn)條和白色條顯示。盡管GM05389細(xì)胞在所有檢測(cè)的抗體濃度上展示了高于背景的FAP表達(dá)，在 SW872細(xì)胞中僅在使用的最高抗體濃度(10 μ g/ml)上可檢測(cè)到FAP表達(dá)，表明這些細(xì)胞不適合用于基于FAP的結(jié)合/凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。另外顯示，此細(xì)胞系幾乎不經(jīng)歷ApomAb介導(dǎo)的凋亡(B)。單獨(dú)的ApomAb或另一種市售的抗DR5抗體沒(méi)有誘導(dǎo)相關(guān)的DNA片段化。只有當(dāng) ApomAb與抗人Fc抗體交聯(lián)時(shí)，可觀察到可檢測(cè)的低水平的凋亡誘導(dǎo)。圖16 相比共同培養(yǎng)兩種細(xì)胞系(黑色條)，單獨(dú)的GM05389(白色條)和 MDA-MB-231(灰色條)的凋亡誘導(dǎo)分析。在所有細(xì)胞系中，單獨(dú)的ApomAb僅具有微弱的作用，而ApomAb的交聯(lián)導(dǎo)致在MDA-MB-231細(xì)胞中的顯著的凋亡誘導(dǎo)。用死亡受體激動(dòng)型雙特異性構(gòu)建體(ApomAb-FAP)誘導(dǎo)的DNA片段化僅在共同培養(yǎng)兩種細(xì)胞系時(shí)出現(xiàn)高水平。這里，單獨(dú)ApomAb交聯(lián)沒(méi)有在相同的范圍中提高凋亡，表明為了最佳的誘導(dǎo)凋亡，兩種細(xì)胞系是必需的一種表達(dá)死亡受體和第二種表達(dá)FAP抗原。圖17 使用四價(jià)雙特異性ApomAb_PRlA3_scFab分子(其中scFab與ApomAb (A 形式)重鏈的C-端融合)在MKN-45細(xì)胞上的凋亡誘導(dǎo)測(cè)定(M小時(shí))的結(jié)果。與 ApomAM+/-與10倍過(guò)量的抗人Fc抗體交聯(lián))和陰性對(duì)照比較凋亡誘導(dǎo)。以0. 1和l.Oyg/ ml的濃度使用所有構(gòu)建體。在使用的測(cè)定條件下，雙特異性Ap0mAb_PRlA3_SCFab構(gòu)建體(黑色條)清楚顯示了濃度依賴(lài)的凋亡誘導(dǎo)，其與高度交聯(lián)的ApomAb(灰色條)所觀察到的在相同的范圍中，且其顯著高于使用單獨(dú)的ApomAb(陰影線條)誘導(dǎo)的凋亡。圖18 相比雙特異性三價(jià)構(gòu)建體(ApomAb_Sm;3e_SCFab ；2x1價(jià)，黑色條)和陰性對(duì)照，通過(guò)ApomAb (單獨(dú)的，陰影線條或高度交聯(lián)的，灰色條)的LS174T細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)分析。使用0. 1和1. O μ g/ml濃度的構(gòu)建體進(jìn)行4小時(shí)測(cè)定。雙特異性ApomAb_sm;3e_scFab 構(gòu)建體能夠以濃度依賴(lài)的方式誘導(dǎo)凋亡，所述凋亡與高度交聯(lián)的ApomAb誘導(dǎo)的凋亡在相同范圍中。圖19 相比載體對(duì)照，ApomAb和雙特異性DR5激動(dòng)型抗體ApomAb_sm;3e_Al在使用人結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T的脾內(nèi)轉(zhuǎn)移模型中的體內(nèi)效力分析。用PBS(黑色線)、ApomAb (黑色圓圈)或ApomAb-Sm;3e_Al雙特異性抗體(黑色方塊)處理每組10只小鼠的隨機(jī)組。將存活百分比對(duì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間進(jìn)程作圖。
實(shí)施例實(shí)施例1 識(shí)別人死亡受體5和人CEA的雙特異性抗體的設(shè)計(jì)以下描述了四價(jià)雙特異性抗體，其包含與第一抗原(人死亡受體，DR5)結(jié)合的全長(zhǎng)抗體和與第二抗原(人癌胚抗原，CEA)結(jié)合的2條單鏈Fv片段的組合，所述單鏈Fv片段通過(guò)肽接頭與所述全長(zhǎng)抗體的重或輕鏈的C-端融合。在所述單鏈Fv中的抗體結(jié)構(gòu)域和接頭具有以下方向VH-接頭-VL。使用Adams在US2007/0031414A1中描述的ApomAb抗體的序列作為DR5識(shí)別抗體
的輕和重鏈可變區(qū)。用于結(jié)合CEA 抗原的 scFv，使用 PR1A3 (Bodmer 等人，I"9 ；US5965710)和 sm;3e (Begent等人，2003 ；US7232888B2)的輕和重鏈可變區(qū)的序列。通過(guò)基因合成和重組DNA技術(shù)，通過(guò)甘氨酸-絲氨酸(G4Q 4接頭連接對(duì)應(yīng)的CEA 抗體的VH和VL以產(chǎn)生單鏈Fv，所述單鏈Fv通過(guò)(G4S)n連接頭(其中η = 2或4)與ApomAb IgGl的重或輕鏈的C-端融合。除了 “野生型” scFv以外，制備了在重鏈可變區(qū)的Kabat位置44和輕鏈可變區(qū)的 Kabat位置100上包含半胱氨酸殘基的變體，以在VH和VL之間產(chǎn)生鏈間二硫鍵。這具有穩(wěn)定scFv分子以最小化潛在的聚集傾向的目的。為了避免雙特異性分子的非特異性交聯(lián)，例如通過(guò)Fc受體作為人Fc γ RIIIa，改變了雙特異性分子的IgG部分的Fc區(qū)中的2個(gè)氨基酸。通過(guò)定點(diǎn)誘變，用丙氨酸殘基替換了 Fc區(qū)中的第234和235位的2個(gè)亮氨酸殘基。描述了此所謂的LALA突變以消除Fc-FcR 相互作用(Hessell 等人，Nature 449(2007)，IOlff)。所有這些分子被重組表達(dá)，制備和使用標(biāo)準(zhǔn)抗體純化技術(shù)(包括蛋白質(zhì)A親和層析后的大小排阻層析)純化。在表達(dá)產(chǎn)量、穩(wěn)定性和生物活性方面表征了分子。表1中提供了由ApomAb-CEA組合組成的不同的雙特異性死亡受體激動(dòng)型抗體分子的總結(jié)?？蓮姆肿用Q(chēng)中推斷不同分子的設(shè)計(jì)描述，其中第一部分表征靶向死亡受體的 IgG (例如ApomAb)，第二名稱(chēng)描述了靶向CEA的scFv的來(lái)源(例如raiA3或sm3e)，字母和數(shù)字組合描述了融合位置和scFv的二硫化物穩(wěn)定性能。表1 靶向人DR5和人CEA的不同的雙特異性死亡受體激動(dòng)型抗體及其相關(guān)特征的描述。
權(quán)利要求
1.雙特異性抗體，其包含特異性針對(duì)死亡受體抗原的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其中所述死亡受體選自DR4，DR5或FAS，優(yōu)選人DR4， 人DR5或人FAS。
3.權(quán)利要求1或2的雙特異性抗體，其中所述第二抗原與腫瘤疾病或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。
4.權(quán)利要求1-3的雙特異性抗體，其中所述第二抗原選自CEA，CRIPTO,R0B04, MCSP, 腱生蛋白C和FAP，優(yōu)選人CEA，人CRIPT0，人R0B04，人MCSP，人腱生蛋白C和人FAP。
5.權(quán)利要求1-4的雙特異性抗體，其中所述第一抗原選自DR5和FAS，所述第二抗原選自 CEA，CRIPTO, FAP 禾口 MCSP。
6.權(quán)利要求5的雙特異性抗體，其選自雙特異性抗體DR5-CEA，DR5-FAP，F(xiàn)AS-CRIPT0 和 FAS-MCSP。
7.權(quán)利要求1-6的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體是二聚體分子，所述二聚體分子包含含有第一抗原結(jié)合位點(diǎn)的第一抗體和含有第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的第二抗體。
8.權(quán)利要求7的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗體包含抗體重鏈的Fc部分，其中所述第一抗體的Fc部分包含第一種二聚化模塊，所述第二抗體的Fc部分包含第二種二聚化模塊，所述二聚化模塊允許所述兩種抗體的異源二聚化。
9.權(quán)利要求8的雙特異性抗體，其中根據(jù)杵臼結(jié)構(gòu)(knobsinto holes)策略，所述第一種二聚化模塊包含杵(knob)，所述第二種二聚化模塊包含白(hole)。
10.權(quán)利要求7的雙特異性抗體，其中所述第一抗體是包含輕鏈和重鏈的免疫球蛋白 (Ig)分子，所述第二抗體選自scFv, scFab, Fab或Fv0
11.權(quán)利要求10的雙特異性抗體，其中所述Ig分子包含特異性針對(duì)死亡受體的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述第二抗體包含特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。
12.權(quán)利要求10的雙特異性抗體，其中所述Ig分子包含特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述第二抗體包含特異性針對(duì)死亡受體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
13.權(quán)利要求10-12的雙特異性抗體，其中所述第二抗體與Ig分子重鏈的N-或C-端融合。
14.權(quán)利要求10-12的雙特異性抗體，其中所述第二抗體與Ig分子輕鏈的N-或C-端融合。
15.權(quán)利要求10-14的雙特異性抗體，其中所述Ig分子是IgG。
16.權(quán)利要求10-15的雙特異性抗體，其中所述第二分子通過(guò)肽接頭，優(yōu)選具有約 10-30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽接頭與Ig分子融合。
17.權(quán)利要求10-16的雙特異性抗體，其中所述第二分子包含另外的半胱氨酸殘基以形成二硫鍵。
18.權(quán)利要求10-17的雙特異性抗體，其中所述Ig分子包含F(xiàn)c變體，所述Fc變體相比野生型Fc區(qū)具有對(duì)Fc γ受體的降低的親和力。
19.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-18的雙特異性抗體。
20.權(quán)利要求1-18的雙特異性抗體，用于治療癌癥或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
21.核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求1-18的雙特異性抗體的重鏈的序列。
22.核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求1-18的雙特異性抗體的輕鏈的序列。
23.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求21和/或權(quán)利要求22的核酸序列。
24.原核或真核宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求23的載體。
25.如本文描述的發(fā)明，特別是參考前述實(shí)施例。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含特異性針對(duì)死亡受體的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和特異性針對(duì)第二抗原的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體，其生產(chǎn)方法，包含所述抗體的藥物組合物，及其用途。
文檔編號(hào)C07K16/30GK102574921SQ201080043541
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者C·蘭伯特, C·弗拉拉科勒, E·默斯納, I·瓦爾德豪爾, P·烏馬納, P·布魯恩克爾, S·格勞, S·赫爾特 申請(qǐng)人:羅切格利卡特公司