一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用，該抗氧化肽的氨基酸序列分別為Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS檢測(cè)給出分子離子峰m/z?476.40[M+H]+或者/和m/z?668.60[M+H]+；制備時(shí)，以鯊魚肉為原料，利用乙醇提取鯊魚醇溶蛋白，然后再以木瓜蛋白酶作為酶解用酶，通過酶解技術(shù)同時(shí)融合大孔樹脂脫鹽、超濾分級(jí)和色譜精制得到抗氧化肽。本發(fā)明的制備方法工藝科學(xué)合理，酶解過程易監(jiān)控，制得的抗氧化肽具有較高的活性，與化學(xué)合成的抗氧化劑相比較，本發(fā)明的抗氧化肽具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
【專利說明】一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001 ] 本發(fā)明涉及的是一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用，是一種利用乙醇提取鯊魚醇溶性蛋白的方法及利用酶工程技術(shù)和色譜技術(shù)制備高抗氧化活性醇溶蛋白肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，由于化學(xué)抗氧化添加劑的不安全性和食品安全的考慮，化學(xué)抗氧化添加劑如BHA (丁基羥基茴香醚)、BHT (2，6-二叔羥基對(duì)甲酚)和TBHQ (特丁基對(duì)苯二酚)等的應(yīng)用受到了較大限制。因此，高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。
[0003]目前，已從各種植物、動(dòng)物組織中提取得到了抗氧化活性顯著的物質(zhì)，如茶葉中的茶多酚、大豆中的異黃酮、枸杞中的多糖等物質(zhì)。而已有的研究發(fā)現(xiàn)，生物體內(nèi)天然多肽也具有顯著的抗氧化活性，如存在于肌肉組織中的肌肽不僅可以有效抑制脂肪氧化，而且在肉制品貯藏時(shí)有護(hù)色作用。另外，以生物蛋白為原料，采用酶解技術(shù)得到的酶解物及其組成多肽也具有顯著的抗氧化活性。如張學(xué)忠等發(fā)現(xiàn)大豆酶解多肽具有清除超氧陰離子自由基，減少人體紅細(xì)胞氧化溶血程度以及抑制脂質(zhì)氧化導(dǎo)致的脂質(zhì)體膜的破壞；徐懷德等研究發(fā)現(xiàn)甲魚蛋白的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物可清除羥基自由基和超氧陰離子自由基和DPPH自由基。
[0004]醇溶蛋白早在18世紀(jì)末就被人們發(fā)現(xiàn)，是植物種子儲(chǔ)存蛋白的組分之一。不溶于水，可溶于50%~90%乙醇。由于醇溶蛋白為單鏈蛋白，單肽通過氫鍵和疏水鍵相互作用，這兩種鍵的鍵能較低，容易被“打斷”，所以醇溶蛋白使面筋具有黏性和延伸性，在食品保鮮、藥品緩釋劑、美容護(hù)膚等方面具有較大用途。但是目前尚未有關(guān)于動(dòng)物醇溶蛋白的報(bào)道。
[0005] 申請(qǐng)人:在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，路氏雙髻鯊魚肉中含有大量的醇溶蛋白，且醇溶蛋白的酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性，而文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)以鯊魚肉為原料提取制備醇溶蛋白，利用酶解技術(shù)和色譜技術(shù)制備醇溶蛋白抗氧化肽的工藝研究處于空白階段，而鯊魚醇溶蛋白肽在清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化方面的應(yīng)用更是未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽，具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽的制備方法，利用酶解技術(shù)和色譜技術(shù)進(jìn)行制備，工藝科學(xué)合理、易操作。
[0008]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明為解決上述第一個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽，其特征在于氨基酸序列分別為Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys, ES1-MS 檢測(cè)給出分子離子峰 m/z 476.40 [M+H]+ 或者 / 和 m/z668.60[M+H]+。
[0010]本發(fā)明為解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽的制備方法，其特征在于步驟依次為:
[0011]I)以鯊魚醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:5mL~18:101^，加入？?jī)?cè)~6磷酸鹽緩沖液，用HCl或NaOH調(diào)pH到5~7，得混合液；
[0012]2 )將混合液溫度升至5(T60 °C攪拌預(yù)熱15mirT20min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為5(T60°C，酶解時(shí)間I~3h ；
[0013]3)將酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。
[0014]作為優(yōu)選,所述步驟2)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5X 106U/go
[0015]作為改進(jìn)，所述步驟3)中的滅酶處理為:將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至90-100?，并于此溫度保持10mirTl5min，再冷卻至1(T20°C以終止酶反應(yīng)，然后離心，取上清液作為酶解液。
[0016]作為改進(jìn)，所述步驟3)的脫鹽、超濾和層析的具體過程為:
[0017]脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔樹脂層析柱進(jìn)行脫鹽，然后用質(zhì)量濃度60-80%乙醇進(jìn)行解析，除去乙醇，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；
[0018]超濾:將脫鹽酶解物干粉溶于ρΗ6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，于
0.1MPa^0.15MPa的工作壓力和20°C~30°C的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于IkDa部分，得超濾酶解液；
[0019]層析:將超濾酶解液用pH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂分離，用水、0.09~0.1lmol/L、0.45~0.55mol/L和
0.9~1.lmol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集0.45、.55mol/L NaCl的洗脫組分，得離子交換酶解液；將離子交換酶解液用PH6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集所得的最高活性組，即凝膠制備酶解物；將凝膠制備酶解物用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成0.9^1.lmg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得2個(gè)高活性抗氧化肽。
[0020]作為優(yōu)選，所述大孔樹脂為DlOl
[0021]再優(yōu)選，凝膠為葡聚糖凝膠G-25 ;所述反相高效液相色譜的條件為:色譜柱為Zorbax C18，進(jìn)樣量19~21 μ g ;流動(dòng)相:A水，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸，B乙腈，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸；梯度洗脫:0-10min:100%A ；10-50min:0-100%B ;洗脫速度
0.9~1.lml/min ;紫外檢測(cè)波長280nm。
[0022]進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟I)的鯊魚醇溶蛋白的提取方法，包括以下步驟:
[0023]I)鯊魚的魚肉按lg:20mL~lg:30mL固液比加入質(zhì)量濃度85%~95%的乙醇溶液，然后勻漿，在30°C~50°C溫度下動(dòng)態(tài)提取80mirTl20min ；
[0024]2)將提取液的pH值用NaOH調(diào)至8.5^10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至質(zhì)量濃度55%~65%，稀釋后的提取液在 25°C 下放置 30mirT40min，于 400(T5000rpm 離心 20mirT30min，
收集上清液；
[0025]3)上清液中加入NaCl至質(zhì)量濃度為5%~8%，鹽析10h~15h后，于400(T5000rpm離心10min~20min,收集沉淀；
[0026]4)沉淀用乙醚脫脂20h~30h，然后于1000(Tl2000rpm離心10mirTl5min將乙醚去
除、凍干，即得醇溶蛋白。
[0027]最后，所述鯊魚為路氏雙髻鯊。
[0028]本發(fā)明為解決上述第三個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽的應(yīng)用，其特征在于Trp-Asp-Arg或/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys對(duì)羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用，而對(duì)DPPH自由基顯示出中等的清除活性；同時(shí)，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用和對(duì)β-胡蘿卜素亞油酸體系中產(chǎn)生的過氧化氫自由基的良好清除作用；Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品或者食品添加劑上應(yīng)用。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明工藝科學(xué)合理，利用乙醇提取醇溶蛋白，選用木瓜蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時(shí)融合大孔樹脂脫鹽、超濾分級(jí)和色譜精制，酶解過程易監(jiān)控，同時(shí)制得的抗氧化肽具有較高的活性；與化學(xué)合成的抗氧化劑相比較，本發(fā)明制得的抗氧化肽具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖la、Ib是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-25制備酶解物的RP-HPLC分析:A為葡聚糖凝膠G-25制備酶解物的I到60min的洗脫曲線；B為15到34min的洗脫曲線；
[0031]圖2a、2b是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的反相高效液相色譜(RP-HPLC)圖:A Trp-Asp-Arg ；B Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys ；
[0032]圖3a、3b 是本發(fā)明的 Trp-Asp-Arg 和 Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys 的質(zhì)譜圖:ATrp-Asp-Arg ；B Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys ；
[0033]圖4是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的DPPH自由基清除活性；
[0034]圖5是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的羥基自由基清除活性；
[0035]圖6是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的ABTS自由基清除活性；
[0036]圖7是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的超氧陰離子自由基清除活性；
[0037]圖8是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys在β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的抗氧化活性；
[0038]圖9是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的脂質(zhì)過氧化抑制活性。【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0040]鯊魚醇溶蛋白的提取及其制備抗氧化肽的方法，制備工藝流程如下:鯊魚肉一醇提一醇溶蛋白一酶解一酶解物一大孔樹脂脫鹽一超濾一離子交換層析一凝膠過濾層析一高效液相色譜制備一抗氧化肽。
[0041]實(shí)施例1[0042]I)路氏雙髻鯊去魚皮和魚骨，魚肉按Ig: 25mL固液比加入90%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機(jī)將其制成勻漿，在45°C溫度下動(dòng)態(tài)提取90min ；
[0043]2)將提取液的pH值用0.lmol/L的NaOH調(diào)至9.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至60%。稀釋后的提取液在25°C下放置30min,于4500rpm離心20min,收集上清液；
[0044]3)上清液中加入NaCl至濃度為5%,鹽析12h后，于4500rpm離心15min,收集沉淀；
[0045]4)沉淀用乙醚脫脂24h，然后于IlOOOrpm離心12min將乙醚去除，即得醇溶蛋白，冷凍干燥得粉末，儲(chǔ)存于_20° C備用。
[0046]5)以鯊魚醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:5mL加入磷酸鹽緩沖液(pH5.8)，用
0.lmol/L HCl 或 0.lmol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 6，得混合液；
[0047]6)將混合液溫度升至55°C攪拌預(yù)熱15min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的1.0%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為55°C，酶解時(shí)間2h ；
[0048]7)將酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次經(jīng)脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽，利用氨基酸序列分析和質(zhì)譜測(cè)定其結(jié)構(gòu)，具體過程為:
[0049]①滅酶處理:將酶解產(chǎn)物升溫至95°C，并于此溫度下保持IOmin后，冷卻至20°C，離心，得酶解液；
[0050]②大孔樹脂脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL，加入到DlOl大孔樹脂層析柱進(jìn)行脫鹽，然后用70%乙醇進(jìn)行解析，除去乙醇，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；
[0051]③超濾:將上述脫鹽酶解物干粉溶于磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液，于0.15MPa的工作壓力和25V的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于IkDa部分，得超濾酶解液；
[0052]④陰離子交換層析:將上述超濾酶解液用磷酸鹽緩沖液(PH7.0)配成10mg/mL的溶液，經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂分離，用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0moI/LNaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集0.5mol/L NaCl的洗脫組分，得離子交換酶解液；
[0053]⑤凝膠柱層析:將上述離子交換酶解液用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，利用DPPH法測(cè)定抗氧化活性，收集所得的最高活性組，即凝膠制備酶解物。
[0054]⑥反相高效液相色譜精制:將上述凝膠制備酶解物用磷酸鹽緩沖液(PH7.0)配成lmg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC，色譜條件:樣品濃度100 μ g/ml ;進(jìn)樣量20 μ g ;色譜柱為Zorbax C18 (250mmX4.6_，5 μ m);柱溫為室溫；流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸);梯度洗脫:0-10min:100%A ；10-50min:0-100%B ;洗脫速度1.0ml/min ;紫外檢測(cè)波長280nm)進(jìn)行純化，利用DPPH法測(cè)定抗氧化活性，收集活性最高的2個(gè)抗氧化肽(見圖1)。
[0055]⑦結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集活性最高的2個(gè)抗氧化肽經(jīng)檢測(cè)為單一峰(見圖2)，利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定2個(gè)抗氧化肽的氨基酸序列分別為Trp-Asp-Arg和 Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys, ES1-MS 檢測(cè)給出分子離子峰 m/z 476.40 [M+H]+ 和 m/z668.60[M+H]+ (見圖 3)。
[0056]實(shí)施例2[0057]I)路氏雙髻鯊去魚皮和魚骨，魚肉按Ig: 20mL固液比加入85%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機(jī)將其制成勻漿，在30°C溫度下動(dòng)態(tài)提取IOOmin ；
[0058]2)將提取液的pH值用0.lmol/L的NaOH調(diào)至10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至55%。稀釋后的提取液在25°C下放置35min,于4000rpm離心30min,收集上清液；
[0059]3)上清液中加入NaCl至濃度為7%，鹽析IOh后，于4000rpm離心20min，收集沉淀；
[0060]4)沉淀用乙醚脫脂20h，然后于1000Orpm離心15min將乙醚去除，即得醇溶蛋白，
冷凍干燥得粉末，儲(chǔ)存于_20°C備用。
[0061]5)以鯊魚醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:1OmL加入磷酸鹽緩沖液(pH5.8)，用
0.lmol/L HCl 或 0.lmol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 7，得混合液；
[0062]6)將混合液溫度升至50°C攪拌預(yù)熱20min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的0.8%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為50°C，酶解時(shí)間3h。
[0063]下面步驟同實(shí)施例1。
[0064]實(shí)施例3
[0065]I)路氏雙髻鯊去魚皮和魚骨，魚肉按Ig: 30mL固液比加入95%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機(jī)將其制成勻漿，在50°C溫度下動(dòng)態(tài)提取SOmin ；
[0066]2)將提取液的pH值用0.lmol/L的NaOH調(diào)至10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至65%。稀釋后的提取液在25°C下放置40min,于5000rpm離心20min,收集上清液；
[0067]3)上清液中加入NaCl至濃度為8%,鹽析15h后，于5000rpm離心IOmin,收集沉淀；
[0068]4)沉淀用乙醚脫脂20h，然后于12000rpm離心IOmin將乙醚去除，即得醇溶蛋白，
冷凍干燥得粉末，儲(chǔ)存于_20°C備用。
[0069]5)以鯊魚醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:8mL加入磷酸鹽緩沖液(pH5.8)，用
0.lmol/L HCl 或 0.lmol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 5，得混合液；
[0070]6)將混合液溫度升至60°C攪拌預(yù)熱15min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為60°C，酶解時(shí)間lh。
[0071]下面步驟同實(shí)施例1.[0072]將制得的鯊魚醇溶蛋白抗氧化肽進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)(見圖4)、羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)(見圖5)、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)(見圖6)、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)(見圖7)、β -胡蘿卜素一亞油酸體系實(shí)驗(yàn)(見圖8)和脂質(zhì)過氧化抑制實(shí)驗(yàn)(見圖9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Trp_Asp_Arg 和 Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys 對(duì)羥基自由基(EC50 0.15mg/mL 和 0.24mg/mL)、ABTS (EC50 0.34mg/mL 和 0.12mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5tl 0.09mg/mL 和 0.12mg/mL)具有良好的清除作用，而對(duì)DPPH自由基(ECki 3.63mg/mL和4.llmg/mL)顯示出中等的清除活性；同時(shí)，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用和對(duì)胡蘿卜素亞油酸體系中產(chǎn)生的過氧化氫自由基的良好清除作用。
[0073]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽，其特征在于該抗氧化鈦的氨基酸序列分別為Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys, ES1-MS檢測(cè)給出分子離子峰m/z476.40 [M+H] + 或者 / 和 m/z 668.60 [M+H]+。
2.—種權(quán)利要求1所述的抗氧化肽的制備方法，其特征在于步驟依次為: 1)以鯊魚醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:5mL~18:101^，加入？?jī)?cè)飛磷酸鹽緩沖液，用HCl或NaOH調(diào)pH到5~7，得混合液； 2)將混合液溫度升至5(T60°C攪拌預(yù)熱15mirT20min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為5(T60°C，酶解時(shí)間l~3h ； 3)將酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5X106U/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的滅酶處理為:將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至9(Tl00°C，并于此溫度保持IOmin~15min，再冷卻至1(T20°C以終止酶反應(yīng)，然后離心，取上清液作為酶解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的脫鹽、超濾和層析的具體過程為: 脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔樹脂層析柱進(jìn)行脫鹽，然后用質(zhì)量濃度60-80%乙醇進(jìn)行解析，除去乙醇，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉； 超濾:將脫鹽酶解物干粉溶于ΡΗ6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，于0.1MPa^0.15MPa的工作壓力和20°C~30°C的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于IkDa部分，得超濾酶解液； 層析:將超濾酶解液用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂分離，用水、0.09~0.1lmol/L、0.45~0.55mol/L和0.9~1.lmol/LNaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集0.45、.55mol/L NaCl的洗脫組分，得離子交換酶解液；將離子交換酶解液用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集所得的最高活性組，即凝膠制備酶解物；將凝膠制備酶解物用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成0.9^1.lmg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得2個(gè)高活性抗氧化肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂為DlOl。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述凝膠柱層析分離中采用的凝膠為葡聚糖凝膠G-25 ;所述反相高效液相色譜的條件為:色譜柱為Zorbax C18，進(jìn)樣量19~21 μ g;流動(dòng)相:A水，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸，B乙腈，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸；梯度洗脫:0-10min:100%A ；10-50min:0-100%B ;洗脫速度 0.9~1.lml/min ;紫外檢測(cè)波長280nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的鯊魚醇溶蛋白的提取方法，包括以下步驟: O鯊魚的魚肉按lg:20mL~lg:30mL固液比加入質(zhì)量濃度85%~95%的乙醇溶液，然后勻漿，在30°C~50°C溫度下動(dòng)態(tài)提取80mirTl20min ； 2)將提取液的pH值用NaOH調(diào)至8.5^10.0,用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至質(zhì)量濃度55%~65%，稀釋后的提取液在 25°C 下放置 30mirT40min，于 400(T5000rpm 離心 20mirT30min，收集上清液； 3)上清液中加入NaCl至質(zhì)量濃度為5%~8%，鹽析10tTl5h后，于400(T5000rpm離心IOmin~20min,收集沉淀； 4)沉淀用乙醚脫脂20h~30h,然后于10000~12000rpm離心IOmin~15min將乙醚去除、凍干，即得醇溶蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述鯊魚為路氏雙髻鯊。
10.一種權(quán)利要求1所述的抗氧化肽的應(yīng)用，其特征在于Trp-Asp-Arg或/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys對(duì)羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用，而對(duì)DPPH自由基顯示出中等的清除活性；同時(shí)，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用和對(duì)β_胡蘿卜素亞油酸體系中產(chǎn)生的過氧化氫自由基的良好清除作用；Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收優(yōu)點(diǎn)，`可以作為藥品、保健食品或者食品添加劑上應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K5/097GK103524597SQ201210230801
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月3日
【發(fā)明者】王斌, 羅紅宇, 李忠瑞, 栗麗 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院