本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種可口服的抑制α糖苷酶活性的多肽及其衍生物制備和用途。

背景技術(shù)：

糖尿病作為一種慢性代謝疾病，具有多種并發(fā)癥，會(huì)對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及視覺系統(tǒng)等產(chǎn)生重大的影響。對(duì)于糖尿病的臨床治療來說，主要包括兩個(gè)方面，一方面注射可以降低血糖的胰島素。另一方面是口服降血糖藥物，主要包括：胰島素促泌劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑、雙胍類以及噻唑烷二酮類四種口服降糖藥。α-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制小腸中糖類的吸收，延緩d-葡萄糖釋放和吸收，以一種非侵害型的方式有效地調(diào)節(jié)了血糖水平和胰島素反應(yīng)。目前α糖苷酶抑制劑的藥物多以阿卡波糖、米格列醇、伏格波列糖等有機(jī)小分子為主?，F(xiàn)在有文獻(xiàn)報(bào)道的具有α糖苷酶抑制活性的天然植物的產(chǎn)物集中在黃酮類、皂甙類、植物酸類以及多糖。只有豆科的白色扁豆、豇豆、大花田菁中有文獻(xiàn)報(bào)道存在抑制α糖苷酶蛋白類活性成分。本發(fā)明中兼具抑制α糖苷酶活性和胰蛋白酶活性的多肽屬于首次提及。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種抑制α糖苷酶活性的多肽，所述多肽有的兼具抗胰蛋白酶活性能力。

本發(fā)明提供的一種抑制α糖苷酶活性的多肽(亞麻多肽，簡(jiǎn)稱luti)，該多肽的制備，參見發(fā)明人公開專利“一種從亞麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制劑方法”(公開號(hào)：cn105566491a)。本發(fā)明在對(duì)多肽的生物學(xué)活性測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)該多肽不僅具有胰蛋白酶抑制活性，還具有α糖苷酶抑制活性，適合開發(fā)功能食品或口服降糖藥物。本發(fā)明人委托公司對(duì)該多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得了多肽的氨基酸序列信息。所述亞麻多肽，具有序列表sqdidno：6所示氨基酸序列。

本發(fā)明又根據(jù)luti的氨基酸序列序列表sqdidno：6，首先進(jìn)行密碼子優(yōu)化，化學(xué)合成適合大腸桿菌表達(dá)的編碼基因，再經(jīng)多點(diǎn)氨基酸添加、替代的突變，獲得一些或提高α糖苷酶抑制活性，或提高胰蛋白酶抑制活性，或兩者均提高的重組多肽，簡(jiǎn)稱dfi，這些多肽具有序列表sqdidno：1所示氨基酸序列，其可應(yīng)用于功能食品、生物制藥領(lǐng)域。

所述兼具胰蛋白酶抑制活性和α糖苷酶抑制活性重組多肽，具有序列表sqdidno：2所示氨基酸序列。

所述兼具胰蛋白酶抑制活性和α糖苷酶抑制活性重組多肽，具有序列表sqdidno：3所示氨基酸序列。

所述具有α糖苷酶抑制活性重組多肽，具有序列表sqdidno：4所示氨基酸序列。

所述具有α糖苷酶抑制活性重組多肽，具有序列表sqdidno：5所示氨基酸序列。

上述的任一抑制α糖苷酶活性的多肽可在制備降糖功能食品及口服降血糖藥物中應(yīng)用。

本發(fā)明的抑制α糖苷酶活性的多肽由于兼具胰蛋白酶抑制活性，具有較強(qiáng)的抗腸道蛋白酶水解能力因此可通過口服給藥，在ⅱ型糖尿病治療中有很好的應(yīng)用前景。

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

附圖說明

圖1.重組多肽dfi1的制備過程電泳圖

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

天然提取或重組表達(dá)的多肽的簡(jiǎn)稱代碼與序列表中序列號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：dfi1(sqdidno：2)；dfi2(sqdidno：3)；dfi3(sqdidno：4)；dfi4(sqdidno：5)；luti(sqdidno：6)

實(shí)施例1.亞麻多肽氨基酸序列的獲得

亞麻多肽(簡(jiǎn)稱luti)的制備：在發(fā)明人公開了專利“一種從亞麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制劑方法”(公開號(hào)：cn105566491a)后，對(duì)多肽的生物學(xué)活性測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)該多肽不僅具有胰蛋白酶抑制活性，還具有α糖苷酶抑制活性。本發(fā)明人委托公司對(duì)該多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得了多肽的氨基酸序列信息，即具有序列表sqdidno：6所示氨基酸序列。

實(shí)施例2.重組多肽的制備

根據(jù)luti的氨基酸序列，利用商業(yè)公司化學(xué)合成編碼dfi1，dfi2,dfi3,dfi4多肽的核苷酸編碼序列，然后利用5’端添加bamhi的正向引物(atggatccagccgtcgttgcccg)，3’端添加ecori的反向引物(atgaattcggtaatatgcggcac)，以合成基因?yàn)槟０?，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)條件：95℃5min，95℃30s，53℃30s，72℃40s，72℃10min，30個(gè)循環(huán)；利用限制性內(nèi)切酶bamhi、ecori對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，連接到經(jīng)相同酶切割的表達(dá)載體質(zhì)粒pgex-6p-1，構(gòu)建pgex-6p-1-dfi1或dfi2或dfi3或dfi4的重組子，然后將重組子轉(zhuǎn)入e.colix10感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行菌落pcr篩選，陽性克隆經(jīng)測(cè)序分析確定。

0.5μl濃度為200ng/μl重組質(zhì)粒pgex-6p-1-dfi1或dfi2或dfi3或dfi4，迅速轉(zhuǎn)入100μl凍融狀態(tài)的e.coliorigami(de3)感受態(tài)中，冰浴30分鐘，42℃熱擊90秒，均勻涂布于lb固體平板培養(yǎng)基(含100μg/mlamp)表面，37℃倒置過夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落于5mllb(含100μg/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm過夜震蕩培養(yǎng)。然后將上述培養(yǎng)液按1％(v/v)的比例接種至500ml新鮮的lb液體培養(yǎng)基(含100μg/mlamp)中擴(kuò)大培養(yǎng)至od600＝0.6～0.7時(shí)，加入iptg使其終濃度達(dá)到0.3mm，16℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)；8000rpm離心收集菌體。用30mlph7.3磷酸緩沖液重懸菌體，冰上超聲裂解菌體，13000r/min離心30min，收集上清，并上樣至經(jīng)ph7.3pbs溶液平衡好的gst-sepharose4b親和層析純化，然后gst-3c蛋白酶切割融合蛋白，再次利用gst-sepharose4b純化酶切產(chǎn)物，收集gst-sepharose4b柱穿透樣品，上樣至緩沖液為ph7.3磷酸緩沖液平衡的sephacryls-200凝膠柱，收集目的蛋白，過濾除菌后保存于-80℃。

圖1為重組多肽dfi1的制備過程電泳圖，圖中：1、表達(dá)gst-dfi1蛋白大腸桿菌bl21全菌樣品；2、菌體超聲破碎后離心上清樣品；3、菌體超聲破碎后離心沉淀樣品；4、gst-sepharose4b親和柱穿透樣品；5、gst-sepharose4b親和柱純化樣品；6、sephacryls-200凝膠柱純化樣品；7、gst-dfi1酶切后的混合樣；8、重組的dfi1樣品。

dfi2、dfi3和dfi4的制備過程電泳圖同dfi1的基本相同。

實(shí)施例3.亞麻多肽以及重組多肽體外活性測(cè)定

α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定：以4-硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷(pnpg)為底物，取一定量的多肽(luti或dfi1或dfi2或dfi3或dfi4)溶液與37.5μlpnpg溶液(2×10^-3mol/l)混合后，用0.2mol/l磷酸緩沖液中(ph6.8)補(bǔ)足體積至450μl，于37℃恒溫水浴保溫10min后，加入50μl來源于酵母的α-葡萄糖苷酶(0.5u/ml)，37℃反應(yīng)10min，加入2.5ml0.1mol/lna2co3溶液(ph10.95)終止反應(yīng)，在410nm處測(cè)其吸光值，以不加多肽試樣為空白對(duì)照。

α-葡萄糖苷酶活力單位定義為：37℃下，ph為6.8的緩沖體系中，每分鐘水解pnpg生成1μmol/lpnp所需要的酶量為一個(gè)活力單位。α-葡萄糖苷酶抑制劑活力單位定義為：在相同條件下，降低一個(gè)酶活性單位所需的抑制劑量。

抑制率(％)＝(△a空白組410－△a實(shí)驗(yàn)組410)/△a空白組410×100％

胰蛋白酶抑制活性的測(cè)定：依據(jù)胰蛋白酶能特異性酶解底物bapna,生成顯色物質(zhì)pna,在410nm處有最大吸收峰，而胰蛋白酶抑制劑的加入可阻止胰蛋白酶對(duì)bapna的酶解，從而抑制反應(yīng)后的吸光度值的增加。取一定量的多肽(luti或dfi1或dfi2或dfi3或dfi4)樣品與0.4ml0.2mg/ml的胰酶，在37℃下保溫10min后，加入2ml0.5mg/ml底物bapna，再于37℃下保溫10min后，加入0.5ml醋酸溶液(w/v為33％)終止反應(yīng)，在od410下測(cè)量吸光度值。以不加抑制劑樣品為空白對(duì)照。37℃下，每分鐘水解bapna生成1μm對(duì)硝基苯胺pna所需要的酶量為一個(gè)活力單位。在相同條件下，降低一個(gè)酶活性單位所需的抑制劑量，為一個(gè)抑制劑活性單位。

抑制率(％)＝(△a空白組410－△a實(shí)驗(yàn)組410)/△a空白組410×100％

多肽抑制α糖苷酶活性和胰蛋白酶活性的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1亞麻胰蛋白酶抑制劑(luti)及重組雙功能多肽(dfi)對(duì)α糖苷酶活性和胰蛋白酶抑制活性ic50值測(cè)定

sequencelisting

<110>山西大學(xué)

<120>一種抑制α糖苷酶活性的多肽及其應(yīng)用

<130>.

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>74

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>人工合成核苷酸序列，大腸桿菌重組表達(dá)

<220>

<221>dfi

<222>(9)..(9)

<223>"x"指代下列氨基酸：gly,cys,,ala,ser,thr,val;

<220>

<221>dfi

<222>(54)..(54)

<223>"x"指代下列氨基酸：gly,cys,,ala,ser,thr,val;

<400>1

glyproleuglyserserargargxaaproglylysasnalatrppro

151015

gluleuvalglylysserglyasnmetalaalaalathrvalgluarg

202530

gluasnargasnvalhisalailevalleulysgluglyseralamet

354045

thrlysasppheargxaaaspargvaltrpvalilevalasnasphis

505560

glyvalvalthrservalprohisilethr

6570

<210>2

<211>74

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>人工合成核苷酸，大腸桿菌重組表達(dá)

<220>

<221>dfi1

<222>(1)..(74)

<400>2

glyproleuglyserserargargcysproglylysasnalatrppro

151015

gluleuvalglylysserglyasnmetalaalaalathrvalgluarg

202530

gluasnargasnvalhisalailevalleulysgluglyseralamet

354045

thrlysasppheargcysaspargvaltrpvalilevalasnasphis

505560

glyvalvalthrservalprohisilethr

6570

<210>3

<211>74

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>人工合成核苷酸序列，大腸桿菌重組表達(dá)

<220>

<221>dfi2

<222>(1)..(74)

<400>3

glyproleuglyserserargargalaproglylysasnalatrppro

151015

gluleuvalglylysserglyasnmetalaalaalathrvalgluarg

202530

gluasnargasnvalhisalailevalleulysgluglyseralamet

354045

thrlysasppheargcysaspargvaltrpvalilevalasnasphis

505560

glyvalvalthrservalprohisilethr

6570

<210>4

<211>74

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>人工合成核苷酸序列，大腸桿菌重組表達(dá)

<220>

<221>dfi3

<222>(1)..(74)

<400>4

glyproleuglyserserargargcysproglylysasnalatrppro

151015

gluleuvalglylysserglyasnmetalaalaalathrvalgluarg

202530

gluasnargasnvalhisalailevalleulysgluglyseralamet

354045

thrlysasppheargalaaspargvaltrpvalilevalasnasphis

505560

glyvalvalthrservalprohisilethr

6570

<210>5

<211>74

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>人工合成核甘酸序列，大腸桿菌重組表達(dá)

<220>

<221>dfi4

<222>(1)..(74)

<400>5

glyproleuglyserserargargalaproglylysasnalatrppro

151015

gluleuvalglylysserglyasnmetalaalaalathrvalgluarg

202530

gluasnargasnvalhisalailevalleulysgluglyseralamet

354045

thrlysasppheargalaaspargvaltrpvalilevalasnasphis

505560

glyvalvalthrservalprohisilethr

6570

<210>6

<211>69

<212>prt

<213>linumusitatissimum

<220>

<221>luti

<222>(1)..(69)

<400>6

serargargcysproglylysasnalatrpprogluleuvalglylys

151015

serglyasnmetalaalaalathrvalgluarggluasnargasnval

202530

hisalailevalleulysgluglyseralametthrlysaspphearg

354045

cysaspargvaltrpvalilevalasnasphisglyvalvalthrser

505560

valprohisilethr

65