一種從桑白皮生物總堿中分離微量生物堿單體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從桑白皮總生物堿中提取分離出蕎麥堿、1，4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol、l-脫氧野尻霉素等幾種生物堿活性單體的技術(shù)方法和技術(shù)要點(diǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]目前市場(chǎng)上用于治療糖尿病的藥物主要為磺脲類(lèi)、雙胍類(lèi)和α-糖苷酶抑制劑。但磺脲類(lèi)藥物容易引起持久性的低血糖癥，雙胍類(lèi)則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)和肝腎損傷，而α -糖苷酶抑制劑除腹內(nèi)氣體增加外，其他不良反應(yīng)較少，已經(jīng)被廣泛用來(lái)降低餐后高血糖。目前臨床上用于治療糖尿病的α-糖苷酶抑制劑藥物有拜糖蘋(píng)，倍欣和國(guó)產(chǎn)品中藥中的桑白皮及有關(guān)藥物。國(guó)內(nèi)降糖中成藥主要以復(fù)方或單方中藥制成，雖兼顧預(yù)防糖尿病并發(fā)癥，但其降糖效果一般較緩慢，且服藥劑量大，狀況亟待改善。
[0003]桑白皮為?？浦参锷orus alba L.的干燥根皮，中醫(yī)理論認(rèn)為桑白皮具瀉肺平喘，利水消腫之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑白皮中主要含有1-脫氧野尻霉素(DNJ)、蕎麥堿、1，4-dideoxy-l, 4-1mino-d_arabinitol、甜菜堿等多種生物堿類(lèi)成分，其中1-脫氧野尻霉素(DNJ)、蕎麥堿等均是作用明確的α-葡萄糖苷酶的抑制活性物質(zhì)，其它生物堿亦具有輔助降糖作用?，F(xiàn)代藥理研究證明桑白皮可以抑制血糖升高，預(yù)防和治療糖尿病。目前對(duì)桑白皮總堿特別是1-脫氧野尻霉素(DNJ)降糖研究的報(bào)道越來(lái)越多，但投入生產(chǎn)的桑白皮總堿降糖藥卻鮮有。
[0004]本發(fā)明的主要目的是提供一種在提取桑白皮生物總堿物的基礎(chǔ)上分離出總堿中幾種重要活性單體的方法。將分離出的單體用于桑白皮總堿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定位對(duì)照品，指導(dǎo)降糖藥桑白皮生物總堿以更快的速度、更好的質(zhì)量上市及其他用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開(kāi)了以粗提取的桑白皮生物總堿為原材料，分離出總堿中幾種具有降糖作用生物堿單體的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明使用的桑白皮生物總堿原材料是參照專(zhuān)利“一種桑白皮總生物堿提取物及其制備應(yīng)用”(CN103381200A)的方法自提的產(chǎn)品。以自提總堿為初始物，經(jīng)甲醇復(fù)溶除去總堿粗品中的大部分1-脫氧野尻霉素(DNJ)，將洗脫液濃縮后進(jìn)行衍生化反應(yīng)，再過(guò)硅膠柱柱層析，通過(guò)柱洗脫得到幾種活性生物堿單體的衍生物，最后再將衍生化基團(tuán)解離掉，得到生物堿單體。所得單體含量均在99.5%以上。
[0008]上述制備各單體的步驟為:
[0009](I)、衍生化反應(yīng):
[0010]取桑白皮總堿粗提品適量，以1-20倍量甲醇溶解，抽濾液減壓濃縮至干，加入4-8倍量(桑白皮生物總堿粗體物)溶劑溶解，緩慢加入0.5-5倍量衍生化試劑，攪拌反應(yīng)2h以上，加入5-20倍量水稀釋?zhuān)来我允兔演腿　⒂铆h(huán)己烷萃取、棄去有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯萃取、減壓回收有機(jī)溶劑得衍生化物，備用。
[0011](2)、過(guò)柱分離:
[0012]取上述衍生化物一一上100?200目硅膠柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫(薄層跟蹤檢測(cè)，收集目標(biāo)單點(diǎn)流出液)一一減壓回收溶劑，得單體衍生物。
[0013](3)、單體衍生物的解離:
[0014]取上述各單體衍生物適量一一加0.5-5倍量甲醇使溶解一一加0.1-1.0有機(jī)堿，脫去衍生化試劑、減壓回收溶劑經(jīng)重結(jié)晶或柱分離得到單體。
[0015]上述衍生化反應(yīng)中的溶劑為水、無(wú)機(jī)堿性水溶液、無(wú)機(jī)堿性緩沖液、二氧六環(huán)、四氫呋喃中的一種或兩種以上等，優(yōu)選為pH9.0的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液與四氫呋喃(1:1)的混合溶液。
[0016]上述衍生化反應(yīng)中的衍生化試劑為芐氧羰基化物、叔丁氧羰基化物、9-芴甲氧基碳基化物中等胺基保護(hù)試劑，優(yōu)選為9-芴甲氧基碳基化物中的9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl) ο
[0017]上述在單體衍生物的解離中的有機(jī)堿為三乙胺、二乙胺、氨水中的一種或幾種，優(yōu)選為三乙胺。
[0018]本法制備單體過(guò)程的衍生化步驟中，甲醇的用量、衍生化試劑的量及衍生化時(shí)間不僅對(duì)產(chǎn)品收率有影響，還會(huì)影響所得單體的純度.當(dāng)使用10倍量甲醇、3倍量衍生化試劑及衍生化時(shí)間10小時(shí)時(shí)，所得各單體較純，純度均在99.5%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施+例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]實(shí)施例1桑白皮生物堿單體的制備
[0021](I)、衍生化反應(yīng):
[0022]取桑白皮總堿粗提品適量，以10倍量甲醇溶解，抽濾液減壓濃縮至干，加入6倍量(桑白皮生物總堿粗體物)PH9.0的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液與四氫呋喃1:1混合溶液溶解，緩慢加入3倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)試劑，攪拌反應(yīng)10h，加入5倍量水稀釋?zhuān)来我允兔演腿?、用環(huán)己烷萃取、棄去有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯萃取、減壓回收有機(jī)溶劑得衍生化物，備用。
[0023](2)、過(guò)柱分離:
[0024]取上述衍生化物一一上100?200目硅膠柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫(薄層跟蹤檢測(cè)，收集目標(biāo)單點(diǎn)流出液)一一減壓回收溶劑，得單體衍生物。
[0025](3)、單體衍生物的解離:
[0026]取上述各單體衍生物適量——加3倍量甲醇使溶解——加0.5倍量三乙胺，脫去衍生化試劑、減壓回收溶劑經(jīng)重結(jié)晶或柱分離得到單體。
[0027]幾種生物堿單體按極性從大到小的順序排列并用質(zhì)譜檢測(cè)純度，依次為:
[0028]蕎麥堿:純度為99.7%
[0029]1-脫氧野尻霉素:純度為99.8%
[0030]五元環(huán)油狀物:純度為99.6%
[0031]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:純度為 99.6%
[0032]實(shí)施例2桑白皮生物堿單體的制備
[0033](I)、衍生化反應(yīng):
[0034]取桑白皮總堿粗提品適量，以I倍量甲醇溶解，抽濾液減壓濃縮至干，加入4倍量(桑白皮生物總堿粗體物)PH9.0的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液與四氫呋喃1:1混合溶液溶解，緩慢加入0.5倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)，攪拌反應(yīng)2h，加入10倍量水稀釋?zhuān)来我允兔演腿　⒂铆h(huán)己烷萃取、棄去有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯萃取、減壓回收有機(jī)溶劑得衍生化物，備用。
[0035](2)、過(guò)柱分離:
[0036]取上述衍生化物一一上100?200目硅膠柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫(薄層跟蹤檢測(cè)，收集目標(biāo)單點(diǎn)流出液)一一減壓回收溶劑，得單體衍生物。
[0037](3)、單體衍生物的解離:
[0038]取上述各單體衍生物適量一一加0.5倍量甲醇使溶解一一加0.1倍量三乙胺，脫去衍生化試劑、減壓回收溶劑經(jīng)重結(jié)晶或柱分離得到單體。
[0039]幾種生物堿單體按極性從大到小的順序排列并用質(zhì)譜檢測(cè)純度，依次為:
[0040]蕎麥堿:純度為95.5%
[0041 ] 1-脫氧野尻霉素:純度為96.2%
[0042]五元環(huán)油狀物:純度為98.5%
[0043]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:純度為 97.8%
[0044]實(shí)施例3桑白皮生物堿單體的制備
[0045](I)、衍生化反應(yīng):
[0046]取桑白皮總堿粗提品適量，以20倍量甲醇溶解，抽濾液減壓濃縮至干，加入8倍量(桑白皮生物總堿粗體物)PH9.0的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液與四氫呋喃1:1混合溶液溶解，緩慢加入5倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)，攪拌反應(yīng)2h，加入20倍量水稀釋?zhuān)来我允兔演腿?、用環(huán)己烷萃取、棄去有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯萃取、減壓回收有機(jī)溶劑得衍生化物，備用。
[0047](2)、過(guò)柱分離:
[0048]取上述衍生化物一一上100?200目硅膠柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫(薄層跟蹤檢測(cè)，收集目標(biāo)單點(diǎn)流出液)一一減壓回收溶劑，得單體衍生物。
[0049](3)、單體衍生物的解離:
[0050]取上述各單體衍生物適量一一加5倍量甲醇使溶解一一加I倍量三乙胺，脫去衍生化試劑、減壓回收溶劑經(jīng)重結(jié)晶或柱分離得到單體。
[0051]幾種生物堿單體按極性從大到小的順序排列并用質(zhì)譜檢測(cè)純度，依次為:
[0052]蕎麥堿:純度為99.6%
[0053]1-脫氧野尻霉素:純度為99.7%
[0054]五元環(huán)油狀物:純度為99.7%
[0055]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:純度為 99.5%
[0056]實(shí)施例4桑白皮生物堿單體的制備
[0057](I)、衍生化反應(yīng):
[0058]取桑白皮總堿粗提品適量，以20倍量甲醇溶解，抽濾液減壓濃縮至干，加入8倍量(桑白皮生物總堿粗體物)水溶解，緩慢加入5倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)，攪拌反應(yīng)2h，加入20倍量水稀釋?zhuān)来我允兔演腿?、用環(huán)己烷萃取、棄去有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯萃取、減壓回收有機(jī)溶劑得衍生化物，備用。
[0059](2)、過(guò)柱分離:
[0060]取上述衍生化物一一上100?200目硅膠柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫(薄層跟蹤檢測(cè)，收集目標(biāo)單點(diǎn)流出液)一一減壓回收溶劑，得單體衍生物。
[0061 ] (3)、單體衍生物的解離:
[0062]取上述各單體衍生物適量一一加5倍量甲醇使溶解一一加I倍量三乙胺，脫去衍生化試劑、減壓回收溶劑經(jīng)重結(jié)晶或柱分離得到單體。
[0063]幾種生物堿單體按極性從大到小的順序排列并用質(zhì)譜檢測(cè)純度，依次為:
[0064]蕎麥堿:純度為95.4%
[0065]1-脫氧野尻霉素:純度為95.2%
[0066]五元環(huán)油狀物:純度為95.7%
[0067]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:純度為 96.5%
[0068]實(shí)施例5桑白皮生物堿單體的制備
[0069](I)、衍生化反應(yīng):
[0070]取桑白皮總堿粗提品適量，以20倍量甲醇溶解，抽濾液減壓濃縮至干，加入8倍量(桑白皮生物總堿粗體物)PH9.0的碳酸鈉-碳酸