一種提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)多基因聚合早期選種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于綿羊分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種提高綿羊產(chǎn)黑數(shù)多基因聚合早 期選種的方法，本發(fā)明通過克隆得到與綿羊產(chǎn)黑數(shù)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。通過將所述的分 子標(biāo)記組合使用提高綿羊產(chǎn)黑數(shù)多基因聚合早期選種中的應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記從化cB、 BMP15和FS皿基因中克隆得到。
【背景技術(shù)】
[000引根據(jù)FA0(2012)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)現(xiàn)有綿羊1.87億只，占世界飼養(yǎng)量（11. 69億 只）的16%，居世界首位化ttp://www.化0.org/home/en/)，是最大的羊肉生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)。 但我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)整體生產(chǎn)水平與國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家仍有一定的差距。自1970年W來，養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá) 國(guó)家逐步建立和形成了較為完善的肉羊繁育體系，在廣泛應(yīng)用經(jīng)濟(jì)雜交的基礎(chǔ)上培育專口 化早熟肉用和適于黑羊肉生產(chǎn)的新品種，具有產(chǎn)黑率較高、泌乳性能好、黑羊生長(zhǎng)發(fā)育快、 肉用性能好、飼料報(bào)酬高等優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)肉羊育種工作落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，與生產(chǎn)的實(shí)際需求差 距巨大。主要用引入品種與本地品種雜交進(jìn)行雜交育種，選育的技術(shù)和方法不先進(jìn)，尚未培 育出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)肉羊品種。
[0003] 綿羊的群體遺傳改良對(duì)保障羊肉供給，促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和提高人們生活水平具 有重要意義。綿羊的繁殖性狀，尤其產(chǎn)黑數(shù)是現(xiàn)代養(yǎng)羊生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一。而 我國(guó)綿羊群體的繁殖性能總體仍然比較低，在舍飼養(yǎng)羊比重不斷增大的大背景下，繁殖性 能和產(chǎn)肉性能的遺傳改良是當(dāng)前乃至今后一段時(shí)間內(nèi)我國(guó)綿羊群體遺傳改良的重點(diǎn)，而繁 殖性能遺傳改良的重點(diǎn)應(yīng)放在產(chǎn)黑數(shù)性狀上。繁殖性狀屬闊性狀，是一種低遺傳力（平均 0.1)的性狀，并且在不同環(huán)境和不同飼養(yǎng)條件下產(chǎn)黑數(shù)也受到一定影響，因此常規(guī)育種方 法遺傳改良進(jìn)展緩慢，亟需人們加深對(duì)繁殖性狀遺傳機(jī)制的了解，W促進(jìn)綿羊繁殖性狀的 遺傳改良。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記已在綿羊生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，并取得了一 定成績(jī)。然而繁殖性狀受微效多基因控制，而且為加性-顯性基因作用模式，單分子標(biāo)記的 選擇并不能充分挖掘高繁殖力個(gè)體的遺傳潛能，同時(shí)也會(huì)影響選種的準(zhǔn)確性。多基因聚合 育種技術(shù)可將對(duì)目標(biāo)性狀的多個(gè)有利基因型聚合到同一個(gè)基因組中，其技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于可提 高選擇的準(zhǔn)確性，加大選擇強(qiáng)度，培育出目標(biāo)性狀突出、育種應(yīng)用價(jià)值高的優(yōu)勢(shì)種群。
[0004] 對(duì)于綿羊繁殖性狀候選基因的研究，最早且作用機(jī)制相對(duì)最清楚的是化cB基因， 它是于1980年由Davis在Booroola綿羊的常染色體上發(fā)現(xiàn)的，具有提高排卵率和產(chǎn)黑 數(shù)等生物學(xué)作用值avisGH等，Segregationofamajorgeneinfluencingfecundity inprogenyofBooroolasheep.NZJAgricRes, 1982, 25:525-529 ;C.J.H.Souza 等，SecretionofInhibinAandFollicularDynamicsthroughouttheEstrous CycleintheSheepwithandwithouttheBooroolaGene(FecB).Endocrinolo gy, 1997, 138(12) :5333-5340)。之后，Mulsant等和Wilson等幾乎同時(shí)報(bào)道了將化cB基 因定位于綿羊6號(hào)染色體6q23-31，并發(fā)現(xiàn)該基因是由于BMPR-IB基因高度保守的胞內(nèi)激 酶信號(hào)區(qū)域一個(gè)突變（Q249R)的結(jié)果（WilsonT等，Hi曲lyprolificBooroolasheep haveamutationintheintracellular(ALK-6)thatisexpressedinbothoocyte sandgranulosacells.Biol民eprod, 2001，1225-1235;MulsantP等，Mutationinbone morphogeneticproteinreceptor-IBisassociatedwithincreasedovulationrate inBooroolaMerinoewes.ProcNatlAcadSciUSA, 2001，98:5104-5109)。Souza等 將Booroola羊與普通綿羊的cDNA進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)830bp處有一個(gè)A〉C突變，使BMPR-IB 的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)第249位氨基酸由Glu變成Arg伯249R)，從而導(dǎo)致Booroola母羊出現(xiàn) 超多產(chǎn)黑數(shù)基因型（SouzaCJ等，化6Booroola^ecB)Phenotypeisassoeiated withamutationinthebonemorphogeneticreceptortypeIB(BMP民一IB)gene.J Endoerinol, 2001，169 (2) : 1-6)。
[0005]綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白 15 化onemoi'phogeneticprotein15,BMP15)基因是 影響產(chǎn)黑數(shù)的主效基因么一（GallowaySM等，Mutationsinanoocyte-derived growthfactorgene(BMP15)causeincreasedovulationrateandinfertilityin adosage-sensitivemanner.NatGenet, 2000, 25 (3) : 279-283)。該基因BMP15 基因有 2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，夕h顯子1長(zhǎng)324bp，外顯子2長(zhǎng)855bp，中間隔著5400bp的內(nèi) 含子，編碼393個(gè)氨基酸殘基前蛋白，其成熟活性版為125個(gè)氨基酸（HanrahanJP等， Mutationsinthegenesforoocyte-derivedgrowthfactorsGDF9andBMPlSare associatedwithbothincreasedovulationrateandsterilityinCambridgeand Belcareshe邱?BiolR邱rod, 2004, 70:900-909)。1991 年首先在Romney羊上發(fā)現(xiàn)的 BMP15被稱為GDF_9B(grow化differentiationfactor9B)，是TGF(化ansforminggrow化 factor)家族成員么一，位于綿羊X染色體上，在卵巢內(nèi)僅在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，其編 碼產(chǎn)物在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中起著重要作用化avisDH等，Evidencefor化epresence ofamajorgeneinfluencingovulationrateontheXchromosomeofsheep.Biol 民epord. 1991,44(4) :620-624)。BMP15是由卵母細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子，對(duì)早期卵泡的生 長(zhǎng)和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用QuengelJL等，Effectsofimmunizationagainst bonemorphogeneticprotein15andgrowthdifferentiationfactor9anovulation rate,fertilization,andpregnancyinewes.Biol民eprod, 2004,70(3):557-561)dBMP15 基因編碼區(qū)外顯子II第718bp處發(fā)生了C一T突變，這一突變?cè)诼殉矁?nèi)通過使顆粒細(xì)胞早 熟及卵泡體積變小增加排卵數(shù)，是造成產(chǎn)黑數(shù)增加的一個(gè)重要基因。
[0006]FSHR(促卵泡素受體）屬G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的糖蛋白亞家族成員，由 胞外區(qū)、跨膜區(qū)和C-末端區(qū)構(gòu)成。它包括至少10個(gè)亮氨酸豐富的重復(fù)單位（LPR)， 每個(gè)約有24個(gè)氨基酸殘基。與F細(xì)產(chǎn)生特異性結(jié)合的位點(diǎn)位于LPR5-LPR10么 間；7個(gè)a螺旋構(gòu)成的跨膜結(jié)構(gòu)是G蛋白偶聯(lián)受體家族的特征性基序。FSHR基因 的cDNA于 1990 年首次被克?。⊿prengelR等，化6testicularreceptorfor follicle-stimulatinghormone:structureandfunctionalexpressionofcloned cDNA.MolEndocrinol, 1990, 4 (4) : 525-530)，F(xiàn)SHR突變對(duì)生殖表型具有深刻的影響 (AittomakiK等，Mutationinthefolliclestimulatinghormonereceptorgenecauses hereditaryhypergonadotropicovarianfailure.Cell, 1995, 82 (6) : 959-968)。FSH民在 動(dòng)物繁殖活動(dòng)中具有傳遞促卵泡生長(zhǎng)發(fā)育生物學(xué)信息的作用，其基因突變可能增強(qiáng)或削 弱轉(zhuǎn)導(dǎo)F細(xì)信息的功能，對(duì)生殖表型具有深刻的影響。人的FSHR基因位于2號(hào)染色體短 臂2區(qū)1帶，包括10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子(Gmmol1J等，Localizationofthehuman FSHreceptortochromosome2p21usingagenomicprobecomprisingexonlO,Mol. EndocrinoL, 1994(12):265-271 ;Rousseau_Merck等，Thechromosomallocalizationof thehumanfollicle-stimulatinghormonereceptorgeneon2p21-pl6issimilar tothatoftheluteinizinghormonereceptorgene,Genomics, 1993(15):222-224)。 SatokoSudo等（2002)用PCR-SSCP分析FS皿基因多態(tài)性，檢測(cè)其基因型頻率，研究表明 激素水平及一些婦科病與FSHR基因多態(tài)性相關(guān)。國(guó)內(nèi)在二花臉豬上檢測(cè)到了FSHR基因座 位的多態(tài)性，研究結(jié)果表明，在FS皿基因座位發(fā)現(xiàn)的該個(gè)PCR-SSCP標(biāo)記與二花臉