一株拮抗地黃?；图怄哏牭毒木昙捌鋺?yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株細(xì)菌菌株，特別涉及一株拮抗地黃專化型尖孢鐮刀菌的菌株及其應(yīng)用，屬于微生物和生物防治技術(shù)領(lǐng)域，可用于藥用植物土傳病害的生物防治。
【背景技術(shù)】
[0002]連作障礙(consecutive monoculture problem)，也稱為自毒作用、重茬問題或土壤病，是指即使正常的田間管理措施下，同一地塊連續(xù)多年種植相同或相似植物造成植物生長發(fā)育不良、病蟲害發(fā)生嚴(yán)重、產(chǎn)量品質(zhì)下降的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象。大多數(shù)藥用植物栽培過程中都存在嚴(yán)重的連作障礙問題。藥用植物連作導(dǎo)致藥用部位一塊根無法正常膨大，造成產(chǎn)量、品質(zhì)嚴(yán)重下降，甚至造成絕收，這嚴(yán)重制約了我國中藥資源的可持續(xù)發(fā)展與利用。
[0003]塊歲{Rehmannia glutinosa L.)為玄參科多年生草本植物，以塊根入藥，是我國最具特色的大宗道地藥材之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，地黃在中藥處方中的使用頻率排名前10位，用量列中藥之首，在中藥復(fù)方領(lǐng)域有著極廣泛應(yīng)用。然而，地黃的連作障礙問題尤為嚴(yán)重(如圖1所示)，通常每茬地黃收獲后須間隔8?10年方可在同一地塊上再次種植。課題組研宄發(fā)現(xiàn)，地黃連作導(dǎo)致土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)惡化，尤其發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌的數(shù)量極顯著上升。從地黃發(fā)病部分和連作土壤中也高頻率分離到尖孢鐮刀菌，并且分離到一株地黃?；图怄哏牭毒摼瓴磺秩居衩?、大豆、小麥等作物，而對地黃表現(xiàn)出極強(qiáng)的致病性(如圖2所示)。
[0004]隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)、綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展與提倡，微生物防治植物病害成為了一個熱點(diǎn)，得到了廣泛研宄。利用拮抗菌進(jìn)行植物病害的生物防治被認(rèn)為是一種科學(xué)、合理、高效、環(huán)境友好型的措施。但是尖孢鐮刀菌的致病菌株具有高度的寄主?；?，從其他作物或環(huán)境中分離到的拮抗菌并不一定對地黃專化型尖孢鐮刀菌有良好的防治效果。所以，本發(fā)明以地黃?；图怄哏牭毒鸀榘袠?biāo)，大量篩選有益拮抗菌，分離到一株高效拮抗該病原真菌的拮抗細(xì)菌，鑒定為蠟狀芽孢桿菌，命名為cereus LK-8，該拮抗菌的分離可為地黃根腐病、枯萎病等的生物防治提供新的生防菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株拮抗地黃?；图怄哏牭毒木昙捌鋺?yīng)用，用于生物防治地黃單一化連續(xù)種植過程中常見的根腐病、枯萎病等問題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明所提供的措抗細(xì)菌為錯狀芽孢桿菌cereus LK-8)，該菌株已于2015年6月9日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院的中國科學(xué)院微生物研宄所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 10967。
[0007]本發(fā)明所述的錯狀芽孢桿菌cereus LK_8)對地黃專化型尖孢鐮刀菌具有很強(qiáng)的拮抗作用。
[0008]本發(fā)明所述的有益拮抗菌具有以下幾個優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明所述的拮抗菌一蠟狀芽孢桿菌cereus LK-8)是從500株土壤細(xì)菌中篩選得到的，可有效抑制地黃專化型尖孢鐮刀菌的生長。
[0009](2)本發(fā)明所述的措抗菌一錯狀芽孢桿菌(feci77w5.cereus LK_8)能夠高效降解地黃根系分泌物中的酚酸類自毒物質(zhì)，減輕自毒作用。
[0010](3)本發(fā)明所述的措抗菌一錯狀芽孢桿菌(ifeci77i/5.Cerew1S LK-8)來源于連作地黃根際土壤中，并非源自其他生境，根際定殖效果較好并且安全可靠，對地黃及后茬其他作物(如小麥、玉米、水稻、大豆、花生等常見作物)均無致病侵染能力。
[0011](4)本發(fā)明所述的拮抗菌一蠟狀芽孢桿菌cereus LK_8)的培養(yǎng)溫度范圍優(yōu)選為20° C?45° C，pH范圍為5?9，適合生長的溫度和pH范圍較廣，適應(yīng)性強(qiáng)。
[0012]
【附圖說明】
[0013]圖1為正、重茬地黃地上部和地下部生長情況比較。
[0014]圖2為尖孢鐮刀菌病原菌侵染地黃組培苗(A)及菌絲顯微觀察(B).A:表示分別接種尖孢鐮刀菌5天(左)和9天(右)后的組培苗發(fā)病情況；B:表示發(fā)病根系上菌絲的顯微觀察。
[0015]圖3為措抗菌錯狀芽孢桿菌(ifeci77w5.cereus LK-8)的革蘭氏染色及顯微形態(tài)觀察。
[0016]圖4為蠟狀芽孢桿菌cereus LK_8)與地黃?；图怄哏牭毒?FON)的對峙培養(yǎng)照片。
[0017]圖5為蠟狀芽孢桿菌cereus LK_8)的代謝產(chǎn)物抑制尖孢鐮刀菌生長.A:添加蠟狀芽孢桿菌LK-8發(fā)酵液；B:未添加LK-8發(fā)酵液。
[0018]圖6為蠟狀芽孢桿菌cereus LK_8)防控尖孢鐮刀菌侵染地黃脫毒移栽苗.A:左盆表示僅接種尖孢鐮刀菌，右盆表示接種假單胞菌(距根部2 cm接種一圈)和尖孢鐮刀菌(距根部4 cm接種一圈)；B:土壤及發(fā)病植株上存在尖孢鐮刀菌病原菌絲。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下實(shí)施例僅僅用于說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。
[0020]實(shí)施例1拮抗菌蠟狀芽孢桿菌cereus LK-8)的篩選及其鑒定
1、地黃?；图怄哏牭毒肟咕鶥acillus cereus LK-8的篩選
1.1根際土壤細(xì)菌單菌落獲得
稱取過篩的新鮮土壤5 g，加入到45 mL冷卻的無菌水中，30° C、150 rpm振蕩30 min得10—1稀釋液，再依次稀釋10倍得10 _2、10_3、10_4、10_5稀釋液。吸取10 'ΙΟ'ΙΟ-5三個稀釋度的土壤懸液60 y L涂抹于LB平板上，每個稀釋度均涂3個平板，置于37 °0的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑選單菌落清晰可辨且生長均勻的平板，挑取其中的單菌落，采用平行劃線的方法進(jìn)行純化，確認(rèn)為單一細(xì)菌菌落，并保存?zhèn)溆谩?br>[0021]1.2地黃專化型尖孢鐮刀菌的拮抗菌篩選
配制馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)，配制如下:將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，稱取200 g，加適量水煮沸后計(jì)時(shí)25 min,經(jīng)四層紗布過濾得濾液，往濾液中加入葡萄糖30