一種脂肪酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及好食脈孢霉液體發(fā)酵制備脂肪酶的方法和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)又稱為三?；视王ニ饷?，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外，還表現(xiàn)出如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶催化反應(yīng)具有立體選擇性、底物專一性、副反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和、不需輔酶及可用于有機(jī)溶劑等特點，在食品、皮革、生物柴油、醫(yī)療醫(yī)藥和洗滌劑等多個生產(chǎn)領(lǐng)域都有應(yīng)用。
[0003]國內(nèi)外市場的脂肪酶酶制劑種類主要有Novozyme435 Lipase、Lipase TLIM、Lipozyme RMIM、Lipase AYS、Lipase AY_30G、Lipase AY、Lipase AK等，這些市售的酶制劑價格較貴，難以開展大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，所以，新型、質(zhì)優(yōu)價廉的脂肪酶的開發(fā)一直以來備受研究者關(guān)注。
[0004]脈孢菌屬(Neurospora)隸屬于真菌界(Fungi )，子囊菌門(Ascomycota)，核菌綱(Pyrenomycetes)，球殼目(Sphaeriales)。FDA組織認(rèn)為脈孢菌是少數(shù)幾種可食用的安全生物，是對醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境很重要的一類生物，同時也是遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究中非常重要的模式生物。利用好食脈孢霉生產(chǎn)脂肪酶具有很好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明目的之一在于提供一種好食脈孢霉液體發(fā)酵制備脂肪酶的發(fā)酵方法。該方法所產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)量高、活性高，是一種胞外酶，有利于后續(xù)的純化，而且安全性良好，制備成本比較低廉。
[0006]本發(fā)明的發(fā)明目的之二在于提供一種脂肪酶的純化方法。該純化方法操作步驟簡單，回收率較高。
[0007]本發(fā)明所使用的菌種為好食脈孢霉、N.si tophi la)菌株17號，保藏號為CGMCCN0.1836。該菌株是本申請人于1999年3月在中國北方醬類食品發(fā)酵中間產(chǎn)物醬塊中分離、篩選得到的。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
1、以好食脈孢霉(ISitophila)菌株17號為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)脂肪酶；
2、培養(yǎng)方法:斜面培養(yǎng)一液體種子培養(yǎng)一液體發(fā)酵培養(yǎng)
斜面培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA斜面)，培養(yǎng)基含煮沸馬鈴薯汁20%W/V、葡萄糖2% W/V、瓊脂2% W/V，pH自然，121°C滅菌30min，冷卻接種后在28?30°C條件下培養(yǎng)3?5天。
[0009]種子培養(yǎng)基制作方法:將30g?50g麩皮加入到100mL自來水中，浸泡過夜后過濾，留濾液，向濾液中添加1.5?3% W/V的蛋白胨，加熱充分溶解后，調(diào)節(jié)pH至5.0即制得種子培養(yǎng)基。250 mL三角瓶裝50 mL液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min后冷卻，每瓶培養(yǎng)基接入15?10 6個孢子后在28?30°C、150r/min條件下培養(yǎng)48小時。
[0010]發(fā)酵培養(yǎng)基含10%W/V麩皮、6%W/V玉米黃粉，0.1%V/V的吐溫-80，0.01% ff/V KCl,培養(yǎng)基初始PH5.5?6.5，250mL三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min后冷卻，接入1%V/V的液體種子，在28?33°C培養(yǎng)48小時，經(jīng)過離心得到上清液，上清液中脂肪酶活力為 3O3.83U/mL。
[0011]、粗提純纖溶酶:經(jīng)過30%W/V飽和度硫酸銨鹽析，4°C環(huán)境中靜置過夜，再經(jīng)lOOOOr/min冷凍離心20min除去固形物，得到的上清液即為含脂肪酶的粗酶液。
[0012]、精提純纖溶酶
采用色譜技術(shù)對粗酶液進(jìn)行精提純，依次采用以下方法純化得到高純度的脂肪酶:
A、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用色譜
將粗酶液中的硫酸銨飽和度調(diào)到30%W/V，平衡液為含30%W/V飽和度硫酸銨的
0.02mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7.0。上樣后用含30%?0W/V硫酸銨飽和度的緩沖液梯度洗脫，收集有脂肪酶活性組分；
B、Superdex75凝膠過濾色譜
以經(jīng)過Octyl-Sepharose FF疏水相互作用色譜分離的脂肪酶活性組分作為該步驟的樣品，上樣后用ρΗ7.4的含0.3mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸氫二鈉_磷酸二氫鈉緩沖液洗脫，收集有脂肪酶活性組分。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點:本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基由麩皮和玉米黃粉組成，不僅原料成本低廉，而且也為這些原有資源的開發(fā)利用提供了新的途徑；本方法發(fā)酵周期短，條件溫和，易于控制；提供的用于好食脈孢霉發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，具有脂肪酶產(chǎn)率高，脂肪酶活力高等優(yōu)點。另外，由于本發(fā)明的脂肪酶為一種胞外酶，在制備中特別有利于后續(xù)的分離和純化，純化步驟簡短，有利于節(jié)省成本，提高回收率。
[0014]本發(fā)明所使用的菌種好食脈孢霉(Afeyrospora.si tophi la) 17號已由本申請人于2006年10月12日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提供了保藏，保藏號為CGMCC N0.1836。保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0015]為了便于理解，下面結(jié)合以下實施例對本發(fā)明予以進(jìn)一步說明。實施例中涉及的百分號(％)若無特別說明，是指10mL溶液中所含溶質(zhì)的克數(shù)或毫升數(shù)。本研究中脂肪酶活力定義為:溫度為37°C，脂肪酶催化對硝基苯酚棕櫚酸酯(P-NPP)，每小時生成Mg的對硝基苯酸定義為一個酶活力單位，國際單位(U/mL)。
[0016]具體實施例實施例1:
1、斜面培養(yǎng):斜面培養(yǎng)基含煮沸馬鈴薯汁20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，pH自然，121°C滅菌30min，冷卻接種好食脈孢霉(Λ? si tophi la) 17號后在28?30°C條件下培養(yǎng)3?5天。
[0017]、種子培養(yǎng):250mL三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min后冷卻，每瓶培養(yǎng)基接入15?10 6個好食脈孢霉(Λ?號孢子后在28?30°C、150r/min條件下培養(yǎng)2d。
[0018]種子培養(yǎng)基制作方法:將30g?50g麩皮加入到100mL自來水中，浸泡過夜后過濾，留濾液，向濾液中添加1.5?3%的蛋白胨，加熱充分溶解后，調(diào)節(jié)pH至5.0即可。
[0019]、液體發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基含10%麩皮、6%玉米黃粉，0.1%的吐溫-80，培養(yǎng)基初始pH5.5?6.5，250mL三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min后冷卻，接入1%的液體種子，在28?33°C培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液在4°C，1000rpm離心1min后獲得的上清液即包含了所需的脂肪酶，測定的脂肪酶活力為71.21U/mL。同時以引用培養(yǎng)基(10%麩皮、6%玉米黃粉，培養(yǎng)基初始pH5.5?6.5)為對照，生產(chǎn)的脂肪酶活性提高了近1倍。
[0020]實施例2
1、斜面培養(yǎng)同實施例1
2、種子培養(yǎng)同實施例2
3、發(fā)酵培養(yǎng)基含10%麩皮、6%玉米黃粉，0.1%的吐溫-80，0.0P/oKCl,培養(yǎng)基初始pH5.5?6.5，250mL三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min后冷卻，接入1%的液體種子，在28?33°C培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液在4°C，1000rpm離心1min后獲得的上清液即包含了所需的脂肪酶，測定的脂肪酶活力為171.55 U/m