專利名稱：一種脂肪酶lip及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種脂肪酶及其基因和應用。
背景技術：
脂肪酶(Lipase, E.C.3.1.1.3),全稱為三酰基甘油酰水解酶(triacylglycerolacylhydrolase),它屬于α/β折疊酶家族,是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶具有優(yōu)良的立體選擇性，反應條件溫和并且不會造成環(huán)境污染，因此在洗滌、食品、造紙等許多工業(yè)領域中均有廣泛的應用。脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中，相對于動植物，微生物分泌的脂肪酶具有更廣的底物專一性、作 用溫度以及作用PH范圍。雖然微生物分泌的脂肪酶具有很好的應用特性，但是尋找到適于工業(yè)化大生產(chǎn)的脂肪酶生產(chǎn)菌株還是十分困難。通過傳統(tǒng)誘變育種以及優(yōu)化發(fā)酵條件，可以一定程度的提高微生物產(chǎn)脂肪酶的能力，然而脂肪酶產(chǎn)量和活力的突破性提高還需要依賴于基因工程。目前，在基因工程操作過程中一般選用大腸桿菌、釀酒酵母和畢赤酵母作為脂肪酶基因的表達宿主。由于在大腸桿菌中表達產(chǎn)量較低，蛋白易形成包涵體，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)困難。因此采用真核生物，如釀酒酵母和畢赤酵母等作為表達宿主成為當前的主要趨勢。到目前為止已有多種微生物的脂肪酶基因在畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達，如溜曲霉(Shi B H et al..Cloning and Expression of Aspergillus tamariiFS132 Lipase Gene in Pichia pastoris.1nt J Mol Sci, 2010，11 (6):2373-2382.)、米根霉(Minging S et al..Functional expression of Rhizopus oryzae lipase inPichia pastoris:high-level production and some properties.JBiotechnol, 1998,66(5):147-156.)、擴展青霉(袁彩，林琳，施巧琴.擴展青霉堿性脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達.生物工程學報，2003，19⑵:31-36.)等，表達的酶活分別為20U/ml、231U/ml和260U/ml。關于黑曲霉脂肪酶的研究報道主要是集中在酶的分離純化、固定化以及應用，關于其基因的克隆與表達方面的報道很少，僅有的報道中也只是將黑曲霉脂肪酶基因轉化到大腸桿菌(Shu Z Y et al..Aspergillus niger lipase:genecloning, over-expression in Escherichia coli and in vitro refolding.BiotechnolLett，2007，29(12):1875-1879.)和畢赤酵母(舒正玉，楊江科，徐麗.黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達.武漢大學學報，2007，53 (2):204-208.)，并沒有詳細的研究重組工程菌株的酶活力以及酶學性質?？傮w上來說，目前所報道的脂肪酶重組酶的酶活力普遍較低，生產(chǎn)成本較高。因此篩選高比活酶基因，構建高效產(chǎn)酶微生物，進行基因改良，優(yōu)化酶的性質，是當前亟待解決的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于黑曲霉的脂肪酶。本發(fā)明的再一目的是提供上述脂肪酶的基因。
本發(fā)明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重組菌株。本發(fā)明的再一目的是提供一種高效表達脂肪酶的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述脂肪酶的應用。本發(fā)明從黑曲霉中分離純化得到一種脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:
權利要求
1.一種脂肪酶LIP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種脂肪酶基因lip，其特征在于，編碼權利要求1所述的脂肪酶LIP。
3.如權利要求2所述的脂肪酶基因lip，其特征在于，其堿基序列如SEQID N0.2所示。
4.包含權利要求2所述的脂肪酶基因Iip的重組載體。
5.根據(jù)權利要求4所述重組載體為pPICZaA。
6.一種高效表達脂肪酶LIP的方法，其特征在于，包括以下步驟:1)用權利要求4所述的重組載體轉化畢赤酵母細胞，得重組菌株；2)重組菌株在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，誘導重組脂肪酶的表達；以及3)發(fā)酵結束后，回收并純化所表達的重組脂肪酶LIP。
7.權利要求1所述的脂肪酶LIP在洗滌、造紙、食品工業(yè)中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種脂肪酶及其基因和應用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術的不足，從黑曲霉中克隆得到一種脂肪酶基因。該脂肪酶在畢赤酵母中的高效表達，可達到比現(xiàn)有技術更高的表達水平。因此，本發(fā)明的重組脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中可大大降低生產(chǎn)成本，使其在洗滌、造紙、食品等工業(yè)中顯示出更大應用潛力。
文檔編號C12N9/20GK103074315SQ20121043124
公開日2013年5月1日 申請日期2012年11月1日 優(yōu)先權日2012年11月1日
發(fā)明者王建榮, 李陽源, 羅長財, 鐘開新, 陳麗芝 申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司