本發(fā)明涉及一種雙功能脂肪酶突變體及其在面制品加工中的應(yīng)用，具體地說(shuō)涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得性質(zhì)提高的脂肪酶突變體，該突變體適用于面制品加工領(lǐng)域，屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
酶制劑作為一種蛋白質(zhì)產(chǎn)品，基于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，使得其在烘焙和面粉品質(zhì)改良方面具有其他化學(xué)成分無(wú)法替代的作用。目前，在面制品加工中使用酶制劑已經(jīng)成為一種主流的趨勢(shì)。在面包烘焙過(guò)程中使用的面粉含有甘油磷脂和甘油三脂，若將甘油磷脂部分水解生成溶血甘油磷脂，甘油三脂部分水解為甘油單酯或者甘油二酯，溶血甘油磷脂、甘油單酯和甘油二酯作為表面活性劑能夠起到乳化作用，對(duì)面團(tuán)有強(qiáng)筋作用，能夠提高面包的入爐急脹，增大面包體積，使其組織細(xì)膩均勻，包心柔軟，口感更好。因此在面包烘焙加工中在面粉中加入具有卵磷脂和甘油三脂分解活性的酶就能夠起到上述的作用。另外在饅頭等面制品加工過(guò)程中，由于面粉中含有葉黃素和葉紅素等色素，影響了面制品白度，因此如果在在面粉中加入能夠分解甘油三脂的酶來(lái)分解面粉中的脂肪，使得原本溶于脂肪中的色素被釋放出來(lái)，更加易于被氧化褪色，從而對(duì)面制品起到增白的作用。在前期研究中，發(fā)明人成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶的華根霉(Rhizopuschinensis)CCTCCM201021菌株，并從該菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并實(shí)現(xiàn)該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中的高水平分泌表達(dá)(YuXiao-Weietal.JMolCatalB:Enzym,2009,57:304-311)；以華根霉脂肪酶基因?yàn)槟０?，利用定向進(jìn)化技術(shù)獲得了一系列熱穩(wěn)定性提高的突變體(授權(quán)專利CN101974499B；YuXiao-Weietal.MicrobialCellFactories,2012,11:102-112)。在此基礎(chǔ)上，本研究利用分子生物學(xué)的手段對(duì)華根霉脂肪酶進(jìn)行基因突變，獲得具有甘油三酯與卵磷脂水解活性的耐熱脂肪酶突變體，該突變體在面制品加工中具有很好的應(yīng)用效果，在饅頭等面制品加工中起到顯著增白、在面包烘焙加工中起到顯著增大比容的效果。授權(quán)專利CN102160562B中已經(jīng)公開(kāi)利用本研究親本脂肪酶作為面包添加劑提高面包的烘焙特性，本項(xiàng)目提供了一種性質(zhì)更加優(yōu)良的脂肪酶突變體，用于面包、饅頭等面制品的加工工藝中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種脂肪酶突變體，其氨基酸序列如下：1)所具有的氨基酸序列與SEQNO.1所示親代氨基酸序列相比，存在下列氨基酸取代形式：突變體1：P298T；突變體2：P298T/H317P；突變體3：P298T/H317P/V326S；突變體4：P298T/T218S/S234F；突變體5：P298T/H317P/P168L/A129S；突變體6：P298T/S234F/K161R/V326S；2)在1)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變，同源性達(dá)到80％以上的核苷酸序列；具有甘油三酯與卵磷脂水解活性，且熱穩(wěn)定性好。所述突變體的熱穩(wěn)定性比親代在40℃下半衰期比親本脂肪酶高了14～38倍。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種含有上述脂肪酶突變體的基因工程菌及其構(gòu)建方法。含編碼所述脂肪酶突變體的DNA序列、及其基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系亦是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。所述基因工程菌為重組畢赤酵母GS115，KM71或SMD1168，其中優(yōu)選GS115。本發(fā)明解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題為提供一種構(gòu)建上述基因工程菌的方法，通過(guò)選取重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9，pPIC3K，pPIC9K，pAO815或pPICZα，更優(yōu)選pPIC9構(gòu)建重組表達(dá)載體，以畢赤酵母GS115為宿主進(jìn)行表達(dá)。上述脂肪酶突變體在面制品加工中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，所述面制品為面包、饅頭、面條。脂肪酶突變體的標(biāo)識(shí)采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來(lái)表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸。如S234F，表示位置234的氨基酸由親本脂肪酶的Ser替換成Phe，位置的編號(hào)對(duì)應(yīng)于附件序列表1中親本華根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列編號(hào)。如L180H/T128S，表示位置180和位置218的氨基酸都發(fā)生了突變。本發(fā)明提供的脂肪酶突變體具有有甘油三酯與卵磷脂水解活性，且耐熱性強(qiáng)，在面制品加工中具有很好的應(yīng)用效果，在饅頭等面制品加工中起到顯著增白、在面包烘焙加工中起到顯著增大比容的效果。具體實(shí)施方式實(shí)施例中涉及到的培養(yǎng)基及試劑配方如下：LB液體培養(yǎng)基：蛋...